十字花科黑腐病菌应急反应相关基因spoT_(Xcc)对T3SS基因调控作用的分析

通过反向遗传学方法和半定量RT-PCR方法,研究了十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spoT_(Xcc)与Ⅲ型分泌系统(T3SS)基因的调控关系。基于自杀质粒pK18mob同源整合方法构建了十字花科黑腐病菌spoT_(Xcc)基因(XC_0956)的非极性整合突变体,检测了突变体的多种表型,发现spoT_(Xcc)突变体延迟了在非寄主植物辣椒ECW-10R上引发的过敏反应(HR)。利用GUS(β-葡糖苷酸酶)活性检测、原位组织染色和半定量RT-PCR的方法,发现T3SS相关基因在spoT_(Xcc)基因的非极性整合突变体中表达量降低,表明十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spoT_(Xcc)显著正调控T3SS相关基因的表达。     

水稻条斑病菌hrpD5基因在致病性中的功能分析

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)成功侵染水稻主要依靠其III型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)分泌的效应蛋白。T3SS由hrp-hrc-hpa基因编码,其中主要的hrp和hrc基因突变,病原菌将丧失在寄主水稻上的致病性和非寄主烟草上的过敏性反应(hypersensitive response,HR)。hrpD5基因位于hrp基因簇hrpD操纵单元的第5个基因,在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的hrpD5缺失突变体RΔhrpD5。植物接种试验显示,RΔhrpD5丧失了对寄主水稻的致病性和在非寄主烟草上激发HR反应的能力;功能互补子虽然能够恢复这2种表型,但是,与野生型菌株相比,其在感病水稻上的毒性显著降低,在非寄主烟草上形成延迟的HR反应;荧光定量PCR结果显示:hrpD5缺失影响其下游hrpD操纵单元基因hrpD6、hrpE和hpaB以及HrpX操纵单元基因hrpF和hrpB1的表达;同时,hrpD5缺失降低了hrpX的mRNA水平,但是不影响hrpX的启动子活性;酵母双杂交结果显示,HrpD5蛋白能够与HrpF蛋白的N端互作。这些结果暗示在Xoc中hrpD5不仅为主要的致病相关基因,而且调控主要的hrp调节基因hrpX的表达。HrpD5新功能的鉴定将为解析T3SS在致病性中的功能提供线索。     

水稻条斑病菌hrpB1基因决定寄主致病性和非寄主过敏反应的功能研究

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola,Xoc)的hrp基因决定了病原菌在非寄主植物上的过敏反应(hypersensitive response,HR)和在寄主植物上的致病性(pathogenicity),基因产物形成Ⅲ型分泌系统(type-Ⅲ secretion system,T3SS)将致病性效应分子注入寄主细胞从而引起水稻产生抗病性或者感病性反应。以位于hrpB操纵单元的首个hr-pB1基因为对象,通过基因敲除方式对其进行了突变,发现hrpB1突变体丧失了在水稻上的致病性和在烟草上激发HR的能力,并且在水稻组织中的生长能力显著降低。RT-PCR测定结果表明,hrpB1的转录表达受HrpG和HrpX的正调控。免疫杂交结果显示,HrpB1蛋白可通过T3SS进行分泌。这些结果不仅明确了hrpB1基因在病原菌致病性中的功能,而且提示了hrp结构基因不仅仅局限于形成Ⅲ型分泌系统,部分hrp基因产物本身也通过Ⅲ型系统分泌到胞外,并且可能起到效应分子的功能。     

十字花科黑腐病菌hrp基因致病功能分析

通过对Xcc 8004菌株的hrp基因进行逐一敲除,系统研究单个hrp基因对Xcc致病性的贡献。结果表明,9个hrc(hypersensitive response and conserved)基因单独突变后在满身红萝卜上的致病性和在辣椒ECW-10R上激发HR的能力完全丧失;9个hrp基因中,hrpW突变后在辣椒ECW-10R上仍能产生HR,满身红萝卜上致病性减弱,其余hrp基因突变后致病性和过敏反应均丧失;4个hpa(hrp associated protein)基因突变后,hpaA和hpaB突变体完全丧失在满身红萝卜上的毒性也不能在辣椒ECW-10R上引起HR,hpa1和hpaP突变后致病性和HR显著减弱。另外,通过RT-PCR对Xcc 8004 hrp基因簇的每个基因受hrpX和hrpG的调控情况进行分析,结果表明所有hrp基因在不同程度上都受到hrpG、hrpX的正向调控。     

猕猴桃溃疡病菌不致病菌株G230的鉴定及形成原因分析

为探索田间猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae(Psa)致病力丧失的分子机制,针对从猕猴桃果园中分离获得的1株不致病菌株G230,通过特异性引物检测和多基因序列分析明确其分类地位,并设计引物检测其是否由已知遗传变异引起,通过比较基因组学、基因表达、超敏反应和荧光素酶报告菌株检测确定引起菌株G230致病力丧失的原因。结果表明,不致病菌株G230为Psa生物型3(Psa3),其致病缺陷不是由已报道的遗传变异引起;基于基因组比较分析发现菌株G230中的hrpS基因被转座子ISPsy36插入破坏,导致Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,T3SS）不能正常表达;而在不致病菌株G230中表达hrpS基因后能恢复其T3SS功能,使其具备致病能力及激发非寄主超敏反应的能力。表明转座子ISPsy36插入hrpS基因内部可以破坏Psa的T3SS功能进而使其丧失致病力,这是自然条件下Psa3丧失致病力的一种新型机制。     

十字花科黑腐病菌IV型分泌系统的诱导表达与抗逆功能分析

 细菌通过IV型分泌系统(Type IV Secretion System, T4SS)的接合系统、效应物转运系统和释放/吸收系统3个子家族进行DNA、蛋白质及毒素的分泌和转运。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是一种重要的植物病原菌,也是研究植物病原细菌与植物相互作用机理的模式细菌之一。本研究通过检测Xcc 8004野生型菌株和T4SS突变体在不同条件下的生长、诱导情况及对过敏反应的影响发现:T4SS不影响在培养基中的生长,与野生型菌株相比,T4SS突变体在非寄主辣椒ECW-10R上的过敏反应减弱;T4SS相关基因受基本培养基MMX诱导表达,且与Ni²⁺、H₂O₂、Phenol等抗逆相关。推测T4SS相关基因在该病原菌的接触、识别阶段起作用。     

寄主植物中抑制十字花科黑腐病菌Ⅲ型分泌系统小分子化合物的鉴定

 寻找抑制植物病原菌III型分泌系统的植物源活性小分子化合物,是研发生物安全农药的重要途径之一。本研究采用水煮提取法从十字花科黑腐病菌寄主植物满身红萝卜中提取分离活性小分子化合物,利用高效液相-质谱联用解析出活性物质的单体结构。然后用荧光素酶基因luxAB构建融合报告系统以及定量PCR检测活性物质对十字花科黑腐病菌III型分泌系统的抑制效果,最后采用剪叶接种和压渗接种的方法研究活性小分子物质对十字花科黑腐病菌的生防作用。研究表明,植物鞘氨醇和二氢鞘氨醇对十字花科黑腐病菌III型分泌系统基因的转录表达有一定程度的抑制作用,但是对I、II、IV型分泌系统基因的表达没有明显的抑制作用。植物鞘氨醇在XCM1上影响菌的生长,而二氢鞘氨醇不影响菌的生长。同时,还发现这两种物质能显著降低Xcc在寄主植株满身红萝卜上的病害症状以及能够使Xcc在非寄主植物辣椒上引起过敏反应的能力丧失。该研究结果为深入研究小分子化合物对十字花科黑腐病菌III型分泌系统的作用机制及后续开发植物源抑制剂提供了一定的理论依据。     

利用编码harpin蛋白的基因遗传改良生防荧光假单胞菌2P24

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens 2P24是根围促生细菌（PGPR）,具有Ⅲ型分泌系统（T3SS）。为了在2P24中表达植物过敏反应激发子harpin,赋予生防菌诱导抗病性能力,本文选择可在2P24中表达的来自Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000的avrPto1基因启动子与水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzae pv.oryzicola harpin蛋白编码基因hpa1进行融合,实现了harpin蛋白在2P24的表达。重组菌株通过T3SS分泌harpin蛋白,可激发烟草产生过敏反应（HR）,激活HR途径的HIN1基因和HRS203J基因以及病程相关蛋白PR1a基因的转录表达。harpin重组菌株与2P24一样,对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum和棉花枯萎病菌F.oxysporum f.sp.vasinfectum具有抑制作用。这为利用植物-病原物互作中激发植物产生抗病性的激发子来遗传改良生防微生物奠定了理论和实践基础。     

7种检疫性植物病原黄单胞菌Ⅲ型分泌系统和效应蛋白编码基因的差异性分析

γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的黄单胞菌属(Xanthomonas)的大多数种类可引起植物病害,多数是我国检疫对象。与其他革兰氏阴性植物病原细菌一样,植物病原黄单胞菌可通过高度保守的Ⅲ型分泌系统(type-Ⅲsecretion system,T3SS)分泌效应蛋白(T3SS-secreted effectors,T3SEs)进入植物细胞,在非寄主植物和抗病寄主植物上产生过敏反应(hypersensitive response,HR)以及在感病寄主植物上具有致病性。尚不清楚哪些种类的黄单胞菌具有T3SS和缺少哪些T3SE是否可作为检疫的依据。搜集7种检疫性植物病原黄单胞菌,通过PCR和Southern杂交试验结果发现:香蕉细菌性青枯病菌(X.campestris pv.musacearum)的ICMP287和ATCC49084菌株、甘蔗流胶病菌(X.axonopodis pv.vasculorum)ATCC13901菌株、洋葱细菌性叶枯病菌(X.axonopodis pv.allii)的LMG576和LMG578菌株中不含有tale基因,并且ATCC13901菌株既不含有T3SS基因也不含有hpal和xopQ基因;菜豆细菌性疫病菌(X.campestris pv.phaseoli)ATCC49119菌株不含有hpal基因。相应地,推测含有2~12个tale基因的黄单胞菌有:大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)ICMP5732和ATCC43911菌株、豌豆细菌性疫病菌(X.axonopodis pv.vignicola)ATCC11648菌株、棉花细菌性角斑病菌(X.campestris pv.malvacearum)ATCC12131和(X.campestris pv.phaseoli)ATCC49119菌株。大豆细菌性斑疹病菌ATCC43911菌株尽管含有hpal、xopQ和hrcC基因,但在非寄主烟草上不能激发HR反应;而甘蔗流胶病菌ATCC13901菌株不含有hpal、xopQ和hrcC基因,却激发烟草产生HR反应。这些结果对于分析比较不同植物病原黄单胞菌的致病性因子和设计特定的植物检疫靶点提供了科学线索。     

青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系统基因簇功能研究

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是革兰氏阴性细菌中新近发现的分泌系统,控制细菌的毒性和蛋白泌出。本试验构建了植物青枯菌Po82菌株的T6SS基因簇完全缺失菌株,从全局水平初步分析了T6SS的功能。与野生型菌株相比,T6SS基因簇的缺失导致了突变菌株运动能力显著增强,在接种前期突变株病情指数明显下降;通过qRT-PCR分析Ⅲ型分泌系统效应子基因,其中popA、popB和popP基因表达量上调,而popC表达水平下调。T6SS基因簇的缺失影响了Po82菌株的运动能力和Ⅲ型效应子基因的表达,使得Po82病程延长。这些结果说明,T6SS参与青枯菌的致病过程,且T6SS与T3SS之间有复杂的未知调控关系。     

hrp基因关键调控因子HrpG在水稻白叶枯病菌和条斑病菌中的交叉互补性研究

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola, Xoc)在非寄主烟草上产生过敏反应(HR)和在寄主水稻上具有致病性,是由hrp致病岛决定的,其中HrpG为关键调控因子。Xoo和Xoc侵染水稻途径和在水稻上产生病害症状的不同,是否与hrpG基因有关,还不清楚。本研究利用反向遗传学方法获得了Xoo和Xoc的hrpG突变体PΔhrpG和RΔhrpG,并用hrpG_Xoo基因和hrpG_Xoc基因分别互补上述2个突变体,获得了相应的互补菌株。致病性测定结果显示,PΔhrpG和RΔhrpG突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主烟草上产生HR的能力,而hrpG_Xoo基因和hrpG_Xoc基因可分别互补上述突变体至野生型水平。利用GUS报告基因检测基因启动子活性发现,hrpG_Xoo和hrpG_Xoc的启动子活性没有显著差别;RT-PCR和Western杂交结果显示,hrpG基因交叉互补菌株中HrpG调控的下游基因hrpX、hpaR、hrcT、hpa2和hrpD6的表达没有差异,且III型分泌系统分泌蛋白Hpa2的分泌性没有受到影响。这些结果表明,稻黄单胞菌hrpG基因可在Xoo和Xoc中交叉互置,位于其上游和下游的调控途径可能相似,而决定Xoo和Xoc在水稻上的侵染途径以及所致病害症状差异可能与hrpG基因位点无关。     

水稻白叶枯病菌毒性基因调控hrp基因表达的分析

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)侵染寄主水稻,引起水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)。病原菌主要依赖hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注入水稻细胞中,激发水稻的抗(感)病性。同源性搜索结果显示,植物病原黄单胞菌中已鉴定的一些毒性基因在Xoo的代表菌株PXO99A中保守存在。为了明确这些毒性基因对hrp基因表达调控的影响,本研究利用pK18mob-W介导的定点突变方法,成功获得了14个毒性基因的突变体;在突变体中,利用hrp∶∶gusA融合表达体系,通过GUS活性定量测定检测了hrpG、hrpX和hrpB1的启动子活性;通过荧光定量PCR技术,检测了这3个基因的mRNA水平。结果显示,双组分调控系统ColR/ColS、RpfC/RpfG和转录调控子Clp负调控hrpG和hrpB1的表达;Trh和Xrv A通过HrpG-HrpX途径正调控hrpB1的表达;HpaR1和Fur不依赖于HrpG仅通过HrpX正调控hrpB1的表达。这些调控关系的鉴定为解析水稻黄单胞菌hrp调控网络提供了新的线索。     

西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统hrcQ基因功能分析

Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)是影响西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli致病性的重要因素,hrcQ作为T3SS的保守基因,在组成和维持该系统功能方面扮演着重要角色,但hrcQ在西瓜噬酸菌中的具体生物学功能尚不明确。本试验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过基因敲除、致病力及相关表型测定等,解析了hrcQ基因的功能。结果表明:hrcQ缺失导致Aac5菌株对寄主的致病能力丧失,运动性及生物膜形成能力降低,并丧失了引起烟草过敏性反应能力;hrcJ和hrcR基因在hrcQ缺失突变株中的表达量下调,hrcQ对hrcJ和hrcR基因均为正调控。表明hrcQ在维持西瓜噬酸菌致病能力中起着不可或缺的作用。     

hrpE基因在水稻条斑病菌Hrp pilus形成和致病性中起重要作用

 水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇编码形成Ⅲ型分泌系统(T3SS),将致病性的效应分子通过HrpF转位装置注入水稻细胞中,从而导致水稻产生抗(感)病性,但Xooc的HrpE是否形成Hrp pilus还不清楚。本研究对Xooc的hrpE基因进行突变,发现hrpE突变体在水稻上丧失致病性和在烟草上丧失激发HR的能力。与水稻互作结果显示,hrpE突变体不能够与水稻细胞互作,其在水稻组织中的生长能力显著下降。电镜结果显示,hrpE突变体不能够形成Hrp pilus,从而导致水稻条斑病菌丧失在水稻上的致病性。功能互补结果显示,完整的hrpE基因可以恢复hrpE突变体在烟草上激发HR反应的能力、在水稻上的致病性以及在水稻薄壁细胞间形成Hrp pilus的能力,表明hrpE基因形成Hrp pilus是水稻条斑病菌分泌致病性效应分子的重要条件。     

水稻条斑病菌rsmA基因在致病性中的功能分析

RsmA属于CrsA/RsmA蛋白家族成员,是一类RNA结合蛋白,作为一类全局性的转录后调控因子,调控碳代谢、生物膜形成、游动性以及致病性相关基因的表达等。同源性搜索结果显示,水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)RS105中存在rsmA基因,其与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99A的rsmAXoo同源性为100%。但是,r smAXoc基因在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的rsmA缺失突变体RΔrsmA。寄主水稻和非寄主烟草接种结果显示,RΔrsmA在水稻上仍具有致病性,在非寄主烟草上也能够激发HR反应,这些结果与已鉴定的Xoo rsmA突变体表型不一致。但是,与野生型菌株相比,RΔrsmA在感病水稻上的毒性显著降低;在丰富和贫乏的培养基中,RΔrsmA的生长能力也明显减弱。其他毒性相关表型的测定结果显示,与野生型菌株相比,RΔrsmA在半固体培养基上的游动能力减弱,生物膜形成能力增强,胞外多糖产量明显降低,胞外蛋白酶的活性增加。这些结果暗示在Xoc中rsmA为重要的毒性相关基因,在Xoo和Xoc中RsmA在致病性中的功能存在一定的差异,RsmA下游调控基因的鉴定可能为解析其在2个水稻致病变种中功能的差异提供线索。     

7种检疫性植物病原黄单胞菌III型分泌系统和效应蛋白编码基因的差异性分析

 γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的黄单胞菌属(Xanthomonas)的大多数种类可引起植物病害,多数是我国检疫对象。与其他革兰氏阴性植物病原细菌一样,植物病原黄单胞菌可通过高度保守的III型分泌系统(type-III secretion system, T3SS)分泌效应蛋白(T3SS-secreted effectors, T3SEs)进入植物细胞,在非寄主植物和抗病寄主植物上产生过敏反应(hypersensitive response, HR)以及在感病寄主植物上具有致病性。尚不清楚哪些种类的黄单胞菌具有T3SS和缺少哪些T3SE是否可作为检疫的依据。搜集7种检疫性植物病原黄单胞菌,通过PCR和Southern杂交试验结果发现:香蕉细菌性青枯病菌(X. campestris pv. musacearum)的ICMP287和ATCC49084菌株、甘蔗流胶病菌(X. axonopodis pv. vasculorum)ATCC13901菌株、洋葱细菌性叶枯病菌(X. axonopodis pv. allii)的LMG576和LMG578菌株中不含有tale基因,并且ATCC13901菌株既不含有T3SS基因也不含有hpa1和xopQ基因;菜豆细菌性疫病菌(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株不含有hpa1基因。相应地,推测含有2~12个tale基因的黄单胞菌有:大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)ICMP5732和ATCC43911菌株、豌豆细菌性疫病菌(X. axonopodis pv. vignicola)ATCC11648菌株、棉花细菌性角斑病菌(X. campestris pv. malvacearum)ATCC12131和(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株。大豆细菌性斑疹病菌ATCC43911菌株尽管含有hpa1、xopQ和hrcC基因,但在非寄主烟草上不能激发HR反应;而甘蔗流胶病菌ATCC13901菌株不含有hpa1、xopQ和hrcC基因,却激发烟草产生HR反应。这些结果对于分析比较不同植物病原黄单胞菌的致病性因子和设计特定的植物检疫靶点提供了科学线索。     

水稻白叶枯病菌hrpG调控基因的鉴定

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)是水稻上最严重的细菌病害之一。Xoo与寄主水稻的互作依赖由hrp基因编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS),将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注射入水稻细胞,引起BLB症状的扩展。HrpG是hrp基因转录表达的主要调控因子。为了鉴定未知的hrpG调控子,本研究在以hrpG∷gusA为报道基因构建的转座子突变体库中,筛选获得4个候选的hrpG负调控子突变体G24-46、G48-22、G19-14和G57-41。GUS活性测定、荧光定量PCR以及烟草组织的GUS染色试验均显示,在这些突变体中hrpG的表达显著增加。Southern杂交结果显示,突变体中转座子均为单一位点的插入。插入位点分析结果显示,在G24-46、G48-22、G57-41和G19-14中转座子分别插入在minD、pilA、metB和wxoB基因中。毒性测定结果显示,这4个突变体在水稻上的毒性显著降低。这些hrpG调控子基因的鉴定为进一步解析稻黄单胞菌hrpG上游调控网络提供了新的科学线索。     

西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统hrcS基因功能分析

为明确编码Ⅲ型分泌系统（typeⅢsecretion system,T3SS）中重要核心蛋白的hrcS基因对西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli致病力的影响,以西瓜噬酸菌野生型菌株Aac5为对象,通过基因敲除构建hrcS基因缺失突变菌株ΔhrcS及其互补菌株ΔhrcS-comp,测定其致病力及致病相关基因表达量、烟草过敏性反应能力、运动能力及运动能力相关基因表达量、生物膜形成能力和离体生长能力。结果显示,与野生型菌株Aac5相比,hrcS基因缺失突变菌株丧失了对寄主的致病能力和引起非寄主烟草过敏性反应能力,运动能力显著增强了191.75%,生物膜形成能力显著下降了43.90%,离体生长能力在达到对数期后呈下降趋势。hrcS基因缺失使西瓜噬酸菌T3SS中hrpG、hrpX和hrpE基因以及鞭毛fliC基因表达量显著上调,分别为野生型菌株的2.27倍、2.38倍、1.26倍和1.77倍,hrcQ基因表达量显著下调,仅为野生型菌株的50.75%。表明hrcS基因在维持西瓜噬酸菌致病能力中发挥着重要作用。     

利用桥梁载体策略构建水稻条斑病菌T3SS基因诱导表达检测体系

 水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS)。Xoc主要依靠hrp基因簇(T3SS基因)编码的III型分泌系统(type III secretion system, T3SS)将效应蛋白注入水稻细胞中,激发寄主水稻的感(抗)病性。为了准确在Xoc中进行T3SS基因表达调控的分析,本研究设计出桥梁载体策略,将目标基因的启动子或者功能片段构建在高拷贝的桥梁载体,获得融合表达元件,通过亚克隆的方式将融合元件转入骨架载体上,获得用于转录表达和蛋白表达分析的载体。为了验证该策略的可行性,选取hrpG、hrpX和hrcC基因构建了相应的启动子探针载体和蛋白表达载体,将这些载体导入毒性调控子基因trh、lrpX和zur的突变体中,GUS活性测定、荧光定量PCR以及蛋白免疫杂交结果显示:在trh、lrpX和zur的突变体中,hrpG、hrpX和hrcC的转录表达水平、mRNA水平和蛋白表达水平呈现一致。这表明这套桥梁载体策略能够有效应用于T3SS基因转录表达和蛋白表达的分析。综上所述,运用桥梁载体能够克服低拷贝载体DNA遗传操作效率低的缺陷,这一策略也适用于毒性相关基因调控机理的研究,这将为Xoc-水稻互作研究提供高效的工作系统。     

利用桥梁载体策略构建水稻条斑病菌T3SS基因诱导表达检测体系

 水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS)。Xoc主要依靠hrp基因簇(T3SS基因)编码的III型分泌系统(type III secretion system, T3SS)将效应蛋白注入水稻细胞中,激发寄主水稻的感(抗)病性。为了准确在Xoc中进行T3SS基因表达调控的分析,本研究设计出桥梁载体策略,将目标基因的启动子或者功能片段构建在高拷贝的桥梁载体,获得融合表达元件,通过亚克隆的方式将融合元件转入骨架载体上,获得用于转录表达和蛋白表达分析的载体。为了验证该策略的可行性,选取hrpG、hrpX和hrcC基因构建了相应的启动子探针载体和蛋白表达载体,将这些载体导入毒性调控子基因trh、lrpX和zur的突变体中,GUS活性测定、荧光定量PCR以及蛋白免疫杂交结果显示:在trh、lrpX和zur的突变体中,hrpG、hrpX和hrcC的转录表达水平、mRNA水平和蛋白表达水平呈现一致。这表明这套桥梁载体策略能够有效应用于T3SS基因转录表达和蛋白表达的分析。综上所述,运用桥梁载体能够克服低拷贝载体DNA遗传操作效率低的缺陷,这一策略也适用于毒性相关基因调控机理的研究,这将为Xoc-水稻互作研究提供高效的工作系统。