新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利,本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞.结果,利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株,获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,22 h内贴壁并发生细胞分裂,6～7 d明显增殖,10～12d汇合成单层.连续传代培养至12代,细胞基本失去上皮样特征.倒置显微镜下观察,10代前培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,11～12代细胞发生变形,间隙增大.细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性.电镜下,纹状缘整齐,紧密连接结构清晰可见.结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞.     

猪小肠黏膜上皮细胞原代培养

分别采用酶消化法和组织块培养法,建立了猪小肠黏膜上皮细胞原代培养的方法。酶消化法于37℃分为4个处理组进行。处理1以2.5 g/L的胰蛋白酶消化30 min;处理2以2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min;处理3以50 mg/L嗜热菌蛋白酶消化50 min;处理4以50 mg/L嗜热菌蛋白酶+2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min。采用柠檬酸胰酶法分离纯化细胞。结果表明,组织块法原代培养获得的细胞活性较强。     

山羊乳腺上皮细胞培养体系的建立

乳腺是转基因动物技术的一个主要研究对象,因为通过遗传操作可改变乳汁成分,获得具有生物活性成分的重要外源蛋白质产物［１］。近几年来,乳腺生物反应器研究成功的例子屡有报道［２］,但通过乳腺生物反应器生产的蛋白质能达到商品化所需浓度的却为数不多,其中一个重要原因是人们对乳腺上皮细胞的各种生理特性及其基因表达调控的分子机制了解得不够深入［３］。有鉴于此,本研究建立了正常山羊乳腺上皮细胞（ＧＭＥＣ）培养体系,为进一步研究ＧＭＥＣ的增殖和分化以及基因表达调控的分子机制提供了有利条件。１　材料与方法１．１　细…     

山羊小肠上皮细胞的培养及其对氨基酸的代谢利用研究

本试验采用组织块培养法获得原代小肠上皮细胞,联合刮除法、相差消化法纯化原代细胞,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代,对山羊小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定,同时以山羊小肠上皮细胞为模型,体外研究山羊小肠上皮细胞对氨基酸的代谢作用。免疫组化鉴定结果表明所分离纯化的细胞为小肠上皮细胞;组氨酸、精氨酸、苏氨酸和亮氨酸是小肠上皮细胞快速利用的氨基酸,在72h内快速下降;天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸是生成的氨基酸,在72h内有所积累;其它氨基酸呈现平缓的被消耗状态。     

原代犬小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立原代犬小肠上皮细胞分离培养及纯化的方法,为犬肠道病毒性、细菌性及寄生虫相关疾病研究提供细胞材料。采用组织块培养法分离培养原代犬小肠上皮细胞,胰酶差速消化法进行纯化,利用细胞形态学、间接免疫荧光法鉴定上皮细胞特性,脂多糖(LPS)刺激原代上皮细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测炎性因子转录水平,鉴定原代犬小肠上皮细胞的功能。结果显示：组织块培养法获得的原代犬小肠上皮细胞可在24 h内贴壁,第3天细胞开始增殖,第4天时达到增殖顶峰,第5～7天细胞活性逐渐降低,在体外连续传代可培养至第10代。经胰蛋白酶差速消化纯化后,获得铺路石样原代犬小肠上皮细胞,生长曲线类似“S”形,上皮细胞特异性细胞角蛋白18 (CK18)鉴定呈阳性,LPS可诱导犬小肠原代上皮细胞炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的转录水平在12 h(P<0.05)、24 h(P<0.01)表达量呈显著和极显著差异。研究表明,利用组织块培养法可成功分离获得数量较多、纯度较高且具有典型上皮细胞形态和功能的犬小肠上皮细...     

鸡小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

选择组织块法分离培养鸡小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC),采用机械刮除法和相差消化－相差贴壁法纯化细胞,0.05%的Trypsin-EDTA对获得的IEC进行消化传代,免疫细胞化学法鉴定IEC。结果表明,组织块培养法可分离出活性较强的IEC,并获得纯化的上皮细胞;形态学和免疫细胞化学法检测显示获得的细胞表面抗原呈阳性,鉴定为IEC;纯化的IEC可在体外稳定传代。     

几种酶分离山羊小肠上皮细胞方法的比较

用不同酶消化分离山羊小肠上皮细胞,从而找到最佳的分离方法,为进一步研究IEC提供合适的细胞模型。本研究分别用胶原酶Ⅰ、嗜热菌蛋白酶、胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ消化分离刚出生未进奶的山羊小肠上皮细胞,通过观察IEC生长状态、形态特征、抗原鉴定比较哪种分离效果最佳。结果表明,联合用胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ1h可分离出大量健全绒毛隐窝单位,进一步培养获得的小肠粘膜上皮(IEC),上皮细胞膜抗原均呈阳性,用胶原酶Ⅰ和嗜热菌蛋白酶分离得到的大部分是成纤维细胞。选用用胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ作为分离IEC的消化酶,可获得较纯的IEC。     

几种酶分离山羊小肠上皮细胞方法的比较

用不同酶消化分离山羊小肠上皮细胞,从而找到最佳的分离方法,为进一步研究IEC提供合适的细胞模型.本研究分别用胶原酶Ⅰ、嗜热菌蛋白酶、胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ消化分离刚出生未进奶的山羊小肠上皮细胞,通过观察IEC生长状态、形态特征、抗原鉴定比较哪种分离效果最佳.结果表明,联合用胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ 1h可分离出大量健全绒毛隐窝单位,进一步培养获得的小肠粘膜上皮(IEC),上皮细胞膜抗原均呈阳性,用胶原酶Ⅰ和嗜热菌蛋白酶分离得到的大部分是成纤维细胞.选用用胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ作为分离IEC的消化酶,可获得较纯的IEC.     

舍饲不同生长阶段山羊小肠组织学观察

为了给山羊舍饲提供基础性的组织学理论依据,试验应用普通石蜡切片H.E.染色的方法对60只山羊的小肠进行了组织学研究.结果表明:小肠固有膜厚度舍饲组厚于放牧组,肠绒毛高度舍饲组高于放牧组,隐窝深度舍饲组浅于放牧组,肌层厚度舍饲组薄于放牧组;绒毛高度随舍饲月龄延长而有所降低,固有膜、肌层厚度的变化没有特别的规律性,隐窝深度...     

小肠上皮细胞培养及其在畜牧业生产中的应用

从小肠上皮细胞的结构和生理作用、IEC培养方法的建立、IEC生长对Gln的依赖性和IEC培养在畜牧业生产中的应用4个方面,综述了小肠上皮细胞的培养方法及其在畜牧业生产中的应用前景。     

猪小肠上皮细胞分离培养与鉴定

为建立功能性永生化的猪小肠上皮细胞系,并为猪肠道营养吸收与免疫调控以及仔猪肠道疾病发病机制的研究提供细胞模型,本试验采用组织块培养法来分离纯化猪小肠上皮细胞,并通过细胞角蛋白18、细胞增殖曲线、核型分析来鉴定猪小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块培养法能够成功培养猪小肠上皮细胞并稳定传11代。2)本试验获得的猪小肠上皮细胞角蛋白18抗原鉴定为阳性,染色体核型为二倍体。3)倒置显微镜下观察培养至第11代的猪小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,呈现"铺路石"和上皮样形态。培养11代后的猪小肠上皮细胞间隙开始变大,规则不明显,细胞开始凋亡。第15代的猪小肠上皮细胞则出现大量凋亡并从瓶底脱落,仅有很少细胞贴壁生长。综上所述,采用组织块培养法能够获得生物学功能稳定的猪小肠上皮细胞系并能正常传11代,可为细胞的永生化提供试验素材。     

黄姑鱼肠道上皮细胞体外分离培养及鉴定

本研究旨在建立黄姑鱼(Nibea albiflora)肠道上皮细胞的体外分离培养及鉴定方法,为海水鱼类肠道功能及其发病机制相关研究提供细胞模型.以黄姑鱼肠道组织为研究对象,采用胰蛋白酶(0.25％)、胶原蛋白酶(1 mg/mL)和透明质酸酶(0.16 mg/mL)联合消化法对肠道组织进行不同时间(0、20、40、60和...     

肉用杂交犊牛小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

本试验旨在建立肉用杂交犊牛小肠上皮细胞分离培养和鉴定的方法,为研究犊牛小肠上皮细胞营养吸收、免疫调控及肠道屏障功能提供原代细胞培养模型。选用新生未吮乳的肉用杂交犊牛的空肠组织,应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法对小肠上皮细胞进行分离,应用相差消化法和相差贴壁法对犊牛小肠上皮细胞进行纯化。通过细胞形态学观察、生长曲线、免疫荧光及染色体核型分析等方法来鉴定细胞。结果表明:1)应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法得到的犊牛小肠上皮细胞生长状况良好,经纯化后得到90%以上纯度的犊牛小肠上皮细胞,并稳定传代至10代以上; 2)犊牛小肠上皮细胞的生长曲线为"S"形,符合细胞增殖规律; 3)免疫荧光鉴定犊牛小肠上皮细胞特异性表达角蛋白13和绒毛蛋白; 4)透射电镜观察发现犊牛小肠上皮细胞边缘有微绒毛结构,细胞与细胞之间的紧密连接结构清晰可见; 5)染色体核型分析显示细胞内含有60条染色体,形态正常,呈二倍体核型。综上所述,应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化及相差贴壁纯化成功得到犊牛小肠上皮细胞,为研究犊牛小肠上皮细胞营养物质吸收、免疫调控和肠道屏障功能提供了细胞素材。     

白藜芦醇对热应激诱导的山羊小肠上皮细胞炎性反应调节作用的研究

本试验旨在探究白藜芦醇对热应激（HS）诱导的山羊小肠上皮细胞炎性因子转录的影响。采用生长良好的第4代山羊小肠上皮细胞（GIE细胞）,分为空白对照组（37℃）、热应激组（42℃）、42℃热应激加白藜芦醇组（5、15、30 μmol·L^-1）;加药预处理6 h后进行热应激处理6 h。通过CCK-8法检测白藜芦醇细胞毒性;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白藜芦醇对热应激诱导的细胞因子分泌的影响;采用生化法检测白藜芦醇对热应激诱导的GIE细胞抗氧化性能的影响;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测白藜芦醇对热应激诱导的GIE细胞HSP70、IL-1β、TNF-α、IL-8和NF-κB基因转录的影响。结果显示：不同浓度（5、15、30 μmol·L^-1）的白藜芦醇可不同程度地提高热应激诱导的GIE细胞GSH-Px、SOD及T-AOC活性,极显著降低脂质过氧化物MDA含量（P<0.01）;不同浓度（5、15、30 μmol·L^-1）的白藜芦醇能不同程度地抑制热应激诱导的GIE细胞IL-1β、IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌,并极显著降低炎性模型细胞IL-1β、TNF-α、IL-8、HSP70和NF-κB的基因转录水平（P<0.01）。结果提示,白藜芦醇可调节热应激诱导GIE细胞炎性模型中HSP70基因表达和炎症因子的产生及表达,促进抗氧化酶活力,具有显著的抗炎活性,其抑炎作用可能与抑制NF-κB信号通路相关。     

山羊乳腺上皮细胞的分离、培养与超微结构观察

从山羊乳腺取部分组织进行细胞培养，并通过控时消化分离纯化山羊乳腺上皮细胞，建立了山羊乳腺上皮细胞系。结果表明：用含150U／mL Ⅰ型胶原酶和100U／mL透明质酸酶的混合液，37℃消化组织块4h，可得到大量的分散单细胞用于原代培养，该法是获得山羊乳腺组织单细胞的适宜方法；以含10％胎牛血清和双抗的RP-M11640或DEME／F12培养液为基础液，在培养液中添加氢化考的松、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、表皮生长因子(EGF)及胰岛素一转铁蛋白一硒钠(ITS)对山羊乳腺上皮细胞的生长具有较明显的促进作用。上皮细胞显微和超微结构显示：山羊乳腺上皮细胞在体外培养过程中可形成岛屿状单层聚集和类似圆顶状的结构；传代培养到第7代的细胞仍增殖旺盛，细胞内有丰富的脂滴和高尔基小泡，细胞分泌活动旺盛。     

肠上皮细胞中内质网应激与动物肠道炎症机制的研究进展

近年来,内质网应激参与动物炎症性肠病发病机制的研究引起了广泛关注,未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔中过量积累而引发内质网应激,持续的内质网应激则会导致动物肠黏膜屏障损伤并诱发肠道炎症。本文就内质网应激发生机制、未折叠蛋白质反应及内质网应激与肠道炎症互作机制进行了综述,旨在为防治动物肠道炎症提出新的治疗策略。     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA(ds-cDNA),通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×10⁸ CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0 kb,平均长度约为1.1 kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。     

姜黄素抑制轮状病毒感染猪肠上皮细胞的作用研究

本研究旨在探讨姜黄素对猪轮状病毒(PRV)感染猪肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)的抗病毒作用。以IPEC-J2细胞为试验对象,分别设置阴性对照组、感染PRV(感染复数=0.1)组和感染PRV后姜黄素(20μmol/L)处理组。在感染PRV后观察细胞病变,利用流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)含量,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和病毒滴度测定法检测PRV在IPEC-J2细胞内的复制与增殖。结果表明：与阴性对照组相比,1)PRV感染导致IPEC-J2细胞病变,显著降低细胞活力(P<0.05),极显著上调细胞内ROS含量(P<0.01);2)姜黄素可显著抑制PRV在细胞内的复制与增殖(P<0.05);3)在PRV吸附细胞阶段添加姜黄素显著抑制了病毒的复制与增殖(P<0.05);4)姜黄素在感染前与PRV直接孵育能显著降低感染后病毒的滴度(P<0.05);5)PRV感染显著提高了细胞内黑色素瘤分化相关基因5、干扰素诱导蛋白44样蛋白抗体和干扰素β的mRNA相对表达量(P<0.05),显著降低了细胞内Toll样受体适配器分子1、线粒体抗病毒信...