盘羊脐带间充质干细胞的分离培养及诱导分化

试验旨在研究野生盘羊脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）的分离、培养及体外多向分化潜能等生物学特性。取盘羊分娩后的新生雄性胎儿脐带,采用组织块培养法分离盘羊UC-MSCs后进行体外培养,并对UC-MSCs进行成骨、成软骨和成脂诱导分化,检测其多向分化潜能。结果显示,应用组织块培养法获得的盘羊UC-MSCs具有UC-MSCs特有的呈簇、成纤维状的特性,细胞呈"S"型曲线生长,细胞的倍增时间平均为33.50 h,且可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂细胞分化。诱导分化特异性染色结果表明,野生盘羊UC-MSCs经诱导后的成骨细胞经茜素红S染色呈现典型的橙红色钙沉积物聚集,成软骨细胞经阿利新蓝染色呈现蓝色的软骨基质,成脂细胞经油红O染色呈现深红色的脂滴。实时荧光定量PCR检测结果发现,随着诱导时间的延长,成骨分化的细胞中骨内γ-羧基谷氨酸蛋白（BGLAP）、骨桥蛋白基因（OPN）、Runt相关转录因子2（RUNX2）基因的相对表达量极显著升高（P<0.01）;成软骨分化的细胞中光蛋白聚糖（LUM）基因的表达量明显增加,而双糖链蛋白多糖（BGN）和Y染色体性别决定区基因盒9（SOX9）基因表达量极显著提高（P<0.01）;成脂分化的细胞中脂蛋白酶（LPL）和过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPAR-γ）基因的相对表达量极显著上升（P<0.01）。试验结果表明,用盘羊胎盘附带的脐带组织可以分离到盘羊UC-MSCs,且分离到的UC-MSCs具有分化为成骨细胞、成软骨细胞及成脂细胞等多向分化潜能。     

马骨髓间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化

试验旨在建立马骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）细胞系,并诱导其向软骨细胞分化。通过获取马BMSCs,进行细胞培养和纯化,对第3代（P3）细胞进行干细胞特性鉴定,并诱导其向软骨细胞分化,对分化后的细胞染色,并检测其软骨细胞特异性基因的表达。结果显示,获得的马BMSCs表达标记基因Sox2和Nanog,并表达间充质干细胞表面标记因子CD44、CD90和CD105,不表达造血细胞表面标志物CD34和CD45。P3代细胞经诱导培养后形态发生改变,阿尔新蓝染色为阳性,并表达软骨细胞特异基因Col,且其表达量随着诱导分化时间的增加而增高。综上表明,本试验建立了马BMSC细胞系,并成功诱导其分化为软骨细胞,为软骨损伤的干细胞治疗提供了试验依据。     

犬脂肪间充质干细胞的分离培养及分化潜能研究

为获得犬脂肪间充质干细胞,本试验取犬腹股沟皮下脂肪组织,分别利用组织培养法和酶消化法分离犬脂肪来源间充质干细胞,对比观察不同来源细胞的形态和增殖特征,并通过诱导液促进细胞向成骨细胞和成脂细胞方向分化,检测其分化潜能。结果表明,通过组织培养法培养的青年犬脂肪组织,可获得大量脂肪间充质干细胞,该细胞生长旺盛,形态均一,可分化为碱性磷酸酶染色阳性的成骨细胞和油红O染色阳性成脂细胞。组织培养法分离培养犬脂肪间充质干细胞操作简单,可为细胞移植治疗等研究提供充足的细胞来源。     

蒙古羊骨髓间充质干细胞的分离培养及多向诱导分化

本研究旨在建立蒙古羊骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)体外分离、纯化、增殖方法,诱导其向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。穿刺法抽取蒙古羊骨髓组织,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化BMSC,增殖,并测定其生长曲线及细胞倍增时间。对第3代蒙古羊BMSC进行成脂、成骨及成软骨诱导,观察诱导后的细胞形态。采用油红O、茜素红、HE等染色法在组织学水平对BMSC进行成脂、成骨和成软骨分化鉴定。结果显示,蒙古羊BMSC呈现均一梭形成纤维细胞样生长,生长曲线呈S型,生长增殖能力良好。在不同分化诱导之后,细胞呈现脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞的表型特征。表明获得的蒙古羊BMSC具有多向分化潜能,所分离细胞确为骨髓间充质干细胞。     

猪骨髓间充质干细胞分离培养和诱导分化脂肪细胞

采用全骨髓培养法分离猪骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)并传代培养;取第4代纯化的MSCs在成脂诱导培养基中诱导分化;分化的成脂细胞用形态学和油红O染色法进行鉴定;用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测成脂分化标志基因PPARγ2和LPL mRNA的表达情况。结果显示,分离培养的猪MSCs细胞经连续传代形态上无明显改变;MSCs在成脂分化培养液中诱导分化2d开始有少量脂滴出现,油红O染色成阳性,诱导18d成脂转化率可达59.8%;在诱导分化第5、10、15天时,PPARγ2mRNA相对表达量分别是(5.065±0.159)、(6.268±0.340)、(9.277±0.261),LPL mRNA的相对表达量分别是(10.995±1.473)、(13.130±0.712)、(15.762±0.934)。结果表明,用本诱导条件诱导猪MSCs向脂肪细胞分化,经形态学和油红O染色鉴定,成脂细胞分化率可达60%,且随分化时间的延长,脂肪细胞标志基因表达增加。     

大鼠胰腺间充质干细胞的分离鉴定及体外诱导成脂和成骨研究

从新生大鼠胰腺中分离出间充质干细胞(MSCs),研究其分化潜能,为胰腺疾病的干细胞移植治疗探寻新的细胞来源。无菌条件取出新生3 d的大鼠胰腺,通过Ⅴ型胶原酶消化获得细胞,常规培养传代、贴壁筛选法纯化细胞、吉姆萨染色观察细胞形态、流式细胞仪测定表面标志CD34和CD44;用成骨、成脂诱导剂鉴定其分化潜能。结果显示,纯化细胞在成骨诱导剂作用下被诱导成成骨细胞,在成脂诱导剂作用下被诱导成脂肪细胞。证明所纯化的细胞为尚未分化的基质细胞,而不是组织的成体细胞,它具有多向分化潜能。     

南阳牛骨髓间充质干细胞的分离培养及多向分化

本研究旨在建立南阳牛骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法,在此基础上研究其生物学特性和多向分化的能力。采用骨髓穿刺法取3月龄小牛的肋骨骨髓,分离培养BMSCs,传代培养并测定其生长曲线,RT-PCR检测Oct4、Nanog、Sox2基因的表达,然后取P3 BMSCs分别向神经和脂肪细胞进行诱导分化,并利用组织学染色技术和RT-PCR技术进行鉴定。结果表明,分离得到的BMSCs大小均匀,多呈梭形的成纤维细胞样生长;RT-PCR可检测到干细胞因子Oct4、Nanog、Sox2的表达;不同代次细胞生长曲线呈S型,一般在第3天时进入指数生长期,第7天后进入平台期;成神经诱导后,甲苯胺蓝染色可见明显的尼氏体结构,RT-PCR检测ENO2和GFAP基因表达呈阳性;成脂肪诱导后,油红O染色后可见大量的脂滴存在,RT-PCR检测Leptin和PPAR基因表达呈阳性。试验证明,成功分离得到了南阳牛BMSCs,且其具有多向诱导分化潜能。     

马脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性试验

为马的关节炎、肌腱和韧带损伤的临床治疗提供种子细胞,本试验通过采集马颈部脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法分离脂肪间充质干细胞,并进行传代培养;绘制细胞生长曲线、测定细胞群体倍增时间;通过流式细胞术检测P3代细胞表面标记物,RT-PCR法扩增细胞表面标记物目的基因片段;油红O和茜素红染色法测定脂肪间充质干细胞的成脂和成骨诱导分化能力。结果发现:马脂肪间充质干细胞体外培养条件下呈长梭形和典型的旋涡状,生长状态良好、折光性强;经测定细胞生长曲线呈典型的S型,符合Logistic生长曲线规律;P3、P6和P9代细胞群体倍增时间分别为21.5 h、26 h、36 h;流式细胞术检测结果显示,P3代细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD44、CD90和CD105,不表达造血系细胞表面标志物CD45;PCR扩增得到CD44、CD90、CD105和CD73特异性目的片段;油红O和茜素红染色证明,马脂肪间充质干细胞具有成脂和成骨诱导分化能力。     

DMSO对兔骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的影响

红细胞裂解法分离获得兔骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),传代纯化培养并进行生物特性的鉴定。不同浓度二甲基亚砜(DMSO)(0、0.5%、1%、2%、4%)作用于贴壁前、贴壁后的兔BM-MSCs,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察细胞的形态、生长情况。DMSO体外诱导P3代兔BM-MSCs分化为胰岛细胞,观察诱导前后细胞形态学变化;双硫腙染色法初步鉴定胰岛细胞;免疫细胞化学检测胰岛素的表达;ELISA检测胰岛素的分泌。结果显示,原代、传代细胞呈成纤维细胞样,生长良好。DMSO对细胞的生长有抑制作用,细胞贴壁前、后的2种处理方法相比,DMSO对细胞生长抑制作用差异不显著(P0.05)。相对而言,DMSO浓度1%对细胞的生长损害作用较小。诱导分化过程中,细胞变圆,逐渐聚集,6d出现细胞聚集,随着诱导的继续,形成细胞团样结构,细胞团数逐渐增多;终末阶段试验组双硫腙染色呈明显的猩红色、免疫细胞化学法鉴定胰岛素表达显示阳性,ELISA检测细胞分泌胰岛素,诱导组7d和12d的胰岛素含量分别为(31.32±0.14)mU/L和(32.85±0.21)mU/L,与对照组的(25.02±0.55)mU/L和(25.06±2.46)mU/L比较,差异极显著。结果表明,DMSO可以用于诱导BM-MSCs分化,终末阶段形成分泌胰岛素的功能细胞,未来可以针对其诱导的高效性进一步进行研究。     

荷斯坦牛骨髓间充质干细胞的分离培养和体外诱导分化的研究

本试验采用密度梯度离心法来分离纯化和体外培养荷斯坦牛骨髓间充质干细胞,并在体外分别诱导其分化为神经样细胞和脂肪样细胞.结果表明,采用密度梯度离心法可获得纯化度较高的荷斯坦牛骨髓间充质干细胞,并且在一定的诱导条件下能够分化为脂肪样和神经样细胞,为利用骨髓间充质干细胞作为核供体进行核移植的研究和动物遗传资源的保存研究奠定理论基础.     

小鼠MyoD基因诱导绵羊脐带间充质干细胞为成肌细胞的研究

为了探讨小鼠MyoD基因诱导绵羊脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）为成肌细胞的可能性,本研究用小鼠MyoD-pcDNA3.1真核表达载体质粒转染绵羊UCMSCs,在观察细胞形态变化的同时,检测成肌细胞标记蛋白表达、表达成肌细胞特异蛋白的细胞比率和成肌细胞特异基因mRNA相对表达量。结果显示,与对照组（未转染）相比,在转染MyoD-pcDNA3.1质粒后第21天,大部分细胞呈现似成肌细胞的细长管状;与对照组未表达相关蛋白相比,转染MyoD-pcDNA3.1后第8天,在荧光倒置显微镜下观察到细胞表达MyoD和Desmin蛋白荧光,转染后第16天,不仅观察到细胞表达MyoD和Desmin,而且观察到MyoG蛋白的表达;对于转染细胞后22 d的细胞进行流式细胞仪检测显示,表达MyoD、MyoG和Desmin的细胞比率分别达93.5%、97.4%和99.5%;此外,实时荧光定量PCR检测显示,转染MyoD-pcDNA3.1后第28天,其细胞中的MyoD、MyoG和Desmin mRNA相对表达量分别提高2.046、2.389和5.489倍。上述结果表明,利用小鼠MyoD构建真核表达载体具有诱导UCMSCs分化为成肌细胞的功效。     

Study on Differentiation of Sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells into Muscle Cells Induced by Mouse MyoD Gene

In order to investigate the differentiation of sheep umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs) into muscle cells induced by mouse MyoD gene. This study based on the previous work constructed the eukaryotic expression vector of MyoD-pcDNA3.1 in mice, and the vector was transfected into sheep UCMSCs. The morphological changes of cells were observed by fluorescent microsco, the expression of MyoD, Desmin and MyoG genes were detected by immunofluorescence, the percentage of cells expressing the cell specific factor (MyoD, Desmin and MyoG) was analyzed by flow cytometry and Real-time quantitative PCR to detect the relative expression of mRNA relative to muscle cell specific factor. Compared with the control group (no transfection), the vector was transfected into sheep UCMSCs, it was found that the cells were transformed into a long, slender, muscular cell state, and the cell spiral gradually disappeared at 21th day. It was found that MyoD and Desmin showed positive expression by immunofluorescence assay at 8th day, the expression of MyoG was also found after 16 d of induction, and the expression of MyoD decreased, the amount of Desmin expression was no change;By flow cytometry, the percentages of the expression of MyoD, MyoG and Desmin were 93.5%, 97.4% and 99.5%,respectively;Real-time quantitative PCR results showed that the relative expression of MyoD, MyoG and Desmin were increased and compared with the control group (non transfected cells), the cells were increased by 2.046, 2.389 and 5.489 times, respectively. The results showed that mouce MyoD gene could induce the differentiation of sheep UCMSCs into muscle cells.     

Study on Inducing Equine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Differentiated into Chondrocytes

This study was aimed to establish equine bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) line and induce it to differentiate into chondrocytes. The BMSCs were collected by cutting the bone and flushing the cutting surface by PBS, and then the bone marrow was washed with PBS,the collected cells were cultured after centrifugation. The cells were purified by passaging,the stem cell properties were tested before the induction. And the cells were also appraised by the expression of the special gene of chondrocytes as well as staining the differentiated cells with Alcian blue to insure the induction was effective. The obtained BMSCs expressed Sox2 and Nanog genes, which were the stem cell special genes, and also expressed CD44, CD90 and CD105 genes, but absent of CD34 and CD45 genes. The shapes of the 3rd passage BMSCs were changed after cultured in inducing medium for a few days. Furthermore, the cells were positive to Alcian blue staining, increased expression of the Col special gene of chondrocyte day by day as well. According to this study, the BMSC line was established, and the BMSCs were induced and differentiate into chondrocytes successfully.     

移植脐带间充质干细胞对荷斯坦公犊体重及血清免疫和抗氧化水平的影响

本文旨在探究移植脐带间充质干细胞( UC-MSCs)对荷斯坦公犊体重及血清免疫和抗氧化水平的影响。选取1月龄体重相近的荷斯坦公犊28头,随机分为对照组和试验组,每组14头。采集健康的荷斯坦新生胎牛的脐带组织,通过胰酶消化筛选法体外分离、纯化培养UC-MSCs,试验组公犊颈静脉注射UC-MSCs 3×105个/kg BW(稀释至8 mL),对照组注射等量生理盐水,分别与1、2、3、4、5月龄各注射1次。试验期150 d。结果表明：与对照组相比,公犊移植UC-MSCs,1)显著提高4、5、6月龄体重( P<0.05);显著提高3、4月龄( P<0.05),极显著提高6月龄(P<0.01)的平均日增重;2)极显著提高4月龄(P<0.01),显著提高6月龄(P<0.05)血清免疫球蛋白A(IgA)含量;极显著提高2、5月龄(P<0.01),显著提高6月龄(P<0.05)血清免疫球蛋白G(IgG)含量;极显著降低3月龄(P<0.01),显著降低4月龄(P<0.05)血清白细胞介素2( IL-2)含量;3)极显著降低2、3、4、5、6月龄血清丙二醛( MDA)含量( P<0.01);显著提高5月龄( P<0.05),极显著提高6月龄( P<0.01)血清超氧化物歧化酶( SOD)活性。由此可见,移植UC-MSCs能够提高公犊血清IgA、IgG含量;降低血清MDA含量,提高SOD活性,增强机体清除自由基的能力;降低血清IL-2含量,减少内部炎症发生;从而提高公犊机体免疫力,进而促进公犊的生长发育。     

移植脐带间充质干细胞对荷斯坦公犊日增重及血清生长因子水平的影响

本试验旨在研究移植脐带间充质干细胞对荷斯坦公犊日增重及血清生长因子水平的影响.选取1月龄体重相近的荷斯坦公犊28头,随机分为对照组和试验组,采集健康的荷斯坦新生胎牛的脐带组织,通过胰酶消化筛选法体外分离、纯化及培养牛脐带间充质干细胞(UC-MSCs),试验组按公犊体重(3×10⁵个/kg干细胞)稀释至8 mL颈静脉注射至体内,对照组注射等量生理盐水.试验期154 d.结果表明,注射UC-MSCs后,试验组公犊平均体重在4、5、6月龄时显著高于对照组(P< 0.05);试验组公犊平均日增重在3、4月龄时显著高于对照组(P< 0.05),而在6月龄时极显著高于对照组(P< 0.01).试验组血清中类胰岛素样生长因子(IGF-1)水平在4月龄时显著高于对照组(P< 0.05);试验组血清中血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-α)水平在3月龄时显著高于对照组(P< 0.05);试验组血清中VEGF、成纤维细胞生长因子(bFGF)、TGF-α水平在6月龄时显著或极显著高于对照组(P< 0.05;P< 0.01);2、3、4、6月龄时,试验组血清中骨形态发生蛋白(BMP-7)水平显著低于对照组(P< 0.05).综上所述,移植UC-MSCs能显著提高公犊的平均日增重及血清中IGF-1、VEGF、TGF-α、bFGF水平,血清中这些生长因子与公犊的生长发育密切相关,进而影响其生长性能.     

犬UC-MSC-Exo来源miRNA表达分析及其cfa-miR-34a/-143对血管内皮细胞增殖的影响

试验旨在分离鉴定犬脐带间充质干细胞分泌的外泌体（UC-MSC-Exo）,并研究犬UC-MSC-Exo来源miRNA的表达情况及其对血管内皮细胞（VEC）增殖的影响。采用超高速离心法从犬脐带间充质干细胞培养上清中分离外泌体,采用Western blotting、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析法（NTA）进行鉴定。通过对犬UC-MSC-Exo中的miRNA进行测序,筛选出2个目标miRNA（cfa-miR-34a和cfa-miR-143）并合成相应的mimic和inhibitor,转染犬VEC;采用荧光显微镜和实时荧光定量PCR法检测mimic和inhibitor转染情况及其转染效率;CCK-8法检测转染mimic和inhibitor对犬VEC增殖能力的影响,并对其靶基因进行预测。结果显示,犬UC-MSC-Exo表达特异性的外泌体表面蛋白CD9、CD63和CD81,粒径集中在100~200 nm,电镜检测成典型的杯状。免疫荧光结果表明,miRNA mimic和inhibitor均已转染进细胞内,并且聚集于细胞质中;实时荧光定量PCR结果表明,转染cfa-miR-34a mimic和cfa-miR-143 mimic后,细胞内cfa-miR-34a和cfa-miR-143表达量分别升高约400和78倍;而转染cfa-miR-34a inhibitor和cfa-miR-143 inhibitor后,细胞内cfa-miR-34a和cfa-miR-143表达量分别降低了77%和83%;CCK-8检测结果表明,cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可极显著促进血管内皮细胞的增殖（P<0.01）。cfa-miR-34a靶基因预测结果发现,共有195个保守靶位点,与miRDB预测结果共有69个交集靶基因;cfa-miR-143则有448个保守靶基因,其与miRDB预测结果有128个交集靶基因。本试验成功分离得到犬UC-MSC-Exo,且证实目标miRNA cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可极显著促进VEC增殖。