鸡传染性法氏囊病毒江苏地方株的分离及其VP2基因分析

用SPF鸡胚从江苏溧水某鸡场病死鸡的法氏囊组织中分离到1株法氏囊病毒(IBDV-LS株),该病毒不能凝集鸡的红细胞,琼扩试验证明与IBDV标准阳性血清发生反应,应用RT-PCR扩增IBDV VP2基因,测序后并与GenBank中的IBDV已知序列进行比较。结果表明,分离的IB-DV-LS与国内外超强毒的核苷酸同源性在94.6%以上,推导氨基酸同源性96.6%,并与超强毒株处于进化树同一分支;说明IBDV-LS属IBDV超强毒株,而亲水区内个别氨基酸的替换,提示该毒株已发生一定的变异。     

鸡传染性法氏囊病病毒12个野毒株的毒力比较

对3－7周龄SPF鸡人工感染的致病性比较试验表明，从不同地区收集的12个鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）野毒株的毒力差异甚大，致病性最强的GX8／99株可引起易感年龄的SPF鸡70％－92％的死亡率，属超强毒，而人工接种YN2／99株的SPF鸡死亡率几乎为零。其余毒株对SPF鸡的致死率介于20％－60％，它们的毒力介于IBDV的标准毒与超强毒之间。     

鸡传染性法氏囊病毒蚀斑克隆纯化CV01株生物学特性研究

通过蚀斑克隆技术,对野外分离的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)进行纯化后,筛选到1株病毒含量高、传代稳定的蚀斑纯化毒CV01株。生物学特性分析发现,IBDV能在鸡胚成纤维细胞(DF-1)上形成大小不同的蚀斑,且蚀斑大小与病毒的毒力有一定的相关性,大蚀斑的病毒含量高(108.0TCID50/m L以上),小蚀斑的病毒含量低(107.0l~108.0TCID50/m L)。蚀斑克隆VP2基因序列分析显示大蚀斑克隆毒具有IBDV超强毒株的特性。选病毒含量高(108.5TCID50/m L)的大蚀斑CV01进行进一步试验,结果发现CV01对10日龄SPF鸡胚的毒力达到106.7/0.2 m L以上,能致40%的30日龄SPF鸡感染。蚀斑克隆毒的免疫原性好,血清中和抗体水平高达15.6 log2,能100%抵抗超强毒株的攻击,表明该纯化株适合用于疫苗生产。     

鸡传染性法氏囊病毒超强毒株的分离及生物学特性鉴定

用SPF鸡及鸡胚，从吉林某鸡场病死鸡的法氏囊组织到一株超强毒株（J20株）。此病毒不能凝集鸡的红细胞，可以被IBDV标准阳性血清检出IBDV抗原。通过对J2001分离毒株进行回归实验，测定病毒效价EID50达10^6/0.2ml，发病率为100％，死亡达70％；病毒理化特性试验，电镜观察等证实J20株为鸡传染性法氏囊病超强毒株。     

利用SPF鸡胚分离传染性法氏囊病病毒超强毒的研究

传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒(vvIBDV)不适应鸡胚成纤维细胞培养,其分离鉴定通常采用直接接种无特定病原体(SPF)鸡的方法。然而该方法需要特殊设备,成本较高,较繁琐。研究旨在探讨SPF鸡胚作为IBDV分离工具的可行性,将IBDV阳性病料混悬液通过绒毛尿囊膜途径接种9~11日胚龄SPF鸡胚,并盲传三代成功分离获得vvIBDV(IBD16GX01株)。分离毒各代次序列一致,且与SPF鸡分离氨基酸同源性100%。结果表明,SPF鸡胚可用于vvIBDV的分离鉴定,为vvIBDV分子流行病学研究奠定基础。     

1997～2001年间31个不同传染性法氏囊病病毒分离株的致病性研究

对1997～2001年间从不同地区收集到的31个鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)野毒株分别人工感染3～7周龄SPF鸡,以比较和确定它们的致病性.比较试验表明,不同毒株间的毒力差异很大,人工感染鸡的年龄也对病毒的致死率有很大影响,4周龄SPF鸡最易感.致病性最强的GX8/99不仅有较明显的易感年龄范围,而且可稳定地引起高达70%～92%的死亡率,是一株真正的超强毒.而人工接种YN2/99株的SPF鸡的死亡率几乎为零.其余毒株对SPF鸡的致死率则介于6%～77%间,但是所有毒株都能造成法氏囊和胸腺的显著萎缩.本研究还表明,我国近几年流行的IBDV大多数毒株的毒力介于典型的超强毒和标准毒之间.     

鸡传染性法氏囊病毒JS株毒力测定

35日龄SPF鸡半数致死量(LD50)和9日龄SPF鸡胚半数致死量(ELD50)试验结果显示,传染性法氏囊病毒(1BDV)JS株的LD50为10-3.60.1 mL/只,ELD50为10-5.20.1 mL/胚;1～6周龄SPF鸡及商品鸡的致病性试验结果显示,IBDV JS株对SPF鸡和商品鸡3周龄后的致病率为100%,最高致死率分别为93.75%和75%;应用RT-PCR方法从IBDV JS株中扩增的VP2基因,经序列测定分析结果显示,IBDV JS株的VP2基因与香港HK46、日本OKYM、英国UK661等国际超强毒株的氨基酸序列的同源性达99%以上.表明IBDV JS株为超强毒株.     

2株鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离鉴定

用分离的疑为鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)超强毒株 (vv IBDV) He B- lf和 He B- bd接种 SPF鸡 ,36 h后接种鸡开始发病 ,发病率为 10 0 %,死亡率为 5 0 %以上。剖检可见与野外病例相同的病理变化 ,如肌肉、心脏、腺胃出血 ,法氏囊水肿或呈“紫葡萄”样外观。经血清学试验、毒力试验、鸡胚接种试验、分子生物学和电镜形态学观察均证明该两分离物为超强毒株 ,从而证明河北省鸡群中存在不同于经典 IBDV的超强毒株。     

鸡传染性法氏囊病疫苗B87对SPF鸡289的免疫效果

30日龄SPF鸡经点鼻途径用鸡传染性法氏囊病病毒（1BDV）的中等毒力疫苗B87株免疫后14d，再以200个ELD50超强毒IBDV株GX8/99点鼻人工攻毒，所有鸡都没有发病死亡。而对照鸡有10/10发病和6/10死亡，并有典型的病理变化。这表明，对SPF鸡用中等毒力的IBDV疫苗免疫可诱发有效的免疫保护作用。并能完全抵抗超强毒IBDV的攻击。     

传染性法氏囊病病毒 PY05 株的分离鉴定

为了分离到鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）病毒,从河南省濮阳地区某疑似感染鸡法氏囊病病毒的鸡场采集病料,用SPF鸡胚对病毒进行分离培养,通过琼脂扩散试验和RT-PCR扩增VP4片段对其进行鉴定。结果显示该毒株能引起鸡胚规律性死亡,且出现CAM增厚、鸡胚出血等明显病变;待检抗原、标准阳性血清之间出现阳性沉淀线;琼脂电泳得到大小约为1200bp片段,与预期结果相符。结果证明该分离株为IBDV地方株,并命名为PY05株。     

免疫胶体金试纸膜和AGP检测vvIBDV GX株在SPF鸡体内的侵染性变化规律

对28日龄无特定病原(SPF)鸡通过点眼、滴鼻方式人工感染了传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒株GX;自感染第2天至第9天,每天用免疫胶体金试纸膜和琼脂扩散试验(AGP)两种方法检测九种组织(法氏囊、脾脏、胸腺、肾脏、肝脏、盲肠、扁桃体、肺脏、心脏、直肠内容物)的病毒含量变化,初步探索出传染性法氏囊病病毒在鸡体内各组织的侵染性变化规律。     

果子狸源细小病毒分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

【目的】探究果子狸源细小病毒流行特点及其VP2基因遗传变异情况,为细小病毒防治提供理论依据和技术支撑。【方法】采用猫肾细胞(CRFK细胞)对患有肠炎的果子狸肠道组织样品进行病毒分离,通过血凝试验、免疫荧光试验鉴定分离的病毒,并对病毒VP2基因进行PCR扩增和遗传进化分析。【结果】分离到的毒株在CRFK细胞中培养出现细胞脱落、崩解和破碎等典型细小病毒细胞病变效应(CPE);血凝试验结果显示,此病毒可凝集猪红细胞,血凝效价为1∶512;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的CRFK细胞内可观察到亮绿色荧光,而对照细胞没有荧光。将分离毒株命名为MPCPV-SX。VP2基因进化树分析发现,其与犬细小病毒处于同一分支,位于CPV-2和CPV-2a型之间,同时VP2氨基酸的87和101位显示为CPV-2型,而300和305位氨基酸则与CPV-2a型一致。【结论】本研究成功从果子狸肠道组织样品中分离出1株细小病毒MPCPV-SX,其VP2基因是介于CPV-2和CPV-2a之间的中间型,表明细小病毒通过果子狸等野生动物跨越宿主流行传播,可能在细小病毒遗传进化方面起到一定的过渡作用。     

猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定

【目的】确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因。【方法】对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)的RT-PCR检测,将阳性样品接种MA104细胞传代进行PoRV的分离;对分离毒株进行电镜观察、间接免疫荧光试验、PoRV VP4和VP7基因序列测序和动物回归等试验。【结果】猪小肠病料样品经终浓度15 μg/mL的胰酶处理37 ℃孵育2 h,接种MA104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70 nm,平均大小为65 nm,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和RT-PCR检测均为PoRV阳性,确定该分离株为PoRV。分离株VP4和VP7基因序列分析显示,VP4基因型与P[23]基因型相似性最高,VP7基因型与G5基因型相似性最高,根据A群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G5P[23]型。动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24 h左右陆续出现水样腹泻、呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到PoRV。【结论】通过MA104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株PoRV,该分离株属于G5P[23]型PoRV,为哺乳仔猪发生腹泻的病原。     

不同来源传染性支气管炎病毒诱导SPF鸡发病的免疫机制研究

试验旨在探讨不同来源的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)诱导SPF鸡发病的免疫机制。选用140只1日龄SPF白来航鸡,随机分为4组,3组攻毒组通过滴鼻点眼途径分别接种鸡源IBV强毒株、鸡源IBV弱毒株和野鸡源IBV毒株3个毒株,对照组以同种方式接种等量灭菌的磷酸盐缓冲液。在感染后12 h、36 h、72 h、7 d和14 d,每组随机选取5只进行剖检,并分别采集法氏囊、肾脏和气管组织,剩余鸡用于观察临床症状、发病及死亡情况。应用实时荧光定量PCR检测攻毒后不同时间点采集的各组织中IBV的病毒载量、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)及部分细胞因子(白细胞介素(interleukin,IL)和干扰素(interferon,IFN))表达量的变化。结果显示,感染不同来源IBV毒株之后仅鸡源IBV强毒株感染组SPF鸡出现抑郁、翅膀下垂、甩头等典型的临床症状,且在感染后5~10 d共有7只死亡,死亡率为20%。病理剖检发现,感染鸡源IBV强毒株的鸡肾脏肿大、尿酸盐沉积和有花斑样病变,而感染野鸡源IBV毒株、鸡源IBV弱毒株和对照组的鸡无明显的眼观病变。实时荧光定量PCR结果显示,在鸡源IBV强毒株组的法氏囊、肾脏和气管3个组织中均检测到病毒。对照组和野鸡源IBV毒株组中均未检测到病毒,鸡源IBV弱毒株组只在部分组织中检测到病毒。在感染后72 h,鸡源IBV强毒株组与其他各组相比,TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7和TLR15基因在法氏囊中的表达量均显著升高(P<0.05),IL-6和IFN-β参与更强烈的抗病毒免疫反应;在感染后7 d,鸡源IBV弱毒株组与其他各组相比,肾脏中TLR2、TLR3、TLR15、TLR21、IL-6和IL-18基因表达量均显著升高(P<0.05)。野鸡源IBV感染后36 h法氏囊组织中IFN-γ基因表达量显著上调(P<0.05)。综上所述,3个IBV毒株中仅鸡源IBV强毒感染引起SPF鸡典型临床发病症状与可视组织病变,且可提高SPF鸡组织中免疫相关因子的基因表达量。本研究结果揭示,不同来源的IBV对SPF鸡的不同致病性与其感染诱导的免疫反应不同有关。     

Ⅰ群禽腺病毒血清11型的分离鉴定及致病性试验

【目的】 了解江苏地区禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV）的基因遗传演化情况及致病性,为FAdV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】 通过SPF鸡胚盲传、PCR鉴定、电镜观察、全基因组测序、序列比对与相似性分析判定病毒血清分型,并将分离株以5×10^5.33 EID₅₀剂量胸肌注射的方式感染10日龄SPF雏鸡进行动物回归试验。【结果】 PCR结果显示,该分离株为Ⅰ群FAdV阳性,在透射电镜下可见球型、无囊膜、具有腺病毒典型的二十面体结构,通过全基因组和Hexon基因进行序列分析表明该分离毒株为FAdV D种血清11型毒株,命名为JSNT-1株。将该毒株感染SPF雏鸡,死亡率为10%（1/10）,病死鸡剖检可见肝脏褪色变黄,出血肿胀,边缘钝圆;肾脏肿大出血,苍白等病变。通过实时荧光定量PCR试验可从口腔及泄殖腔中检测到排毒,且病毒在鸡体内多个组织器官均有分布。病理组织学结果显示,死亡鸡的肝细胞变性坏死,出现嗜碱性核内包涵体;肾小球上皮细胞变性坏死;心肌可见大量炎性细胞浸润。【结论】 分离株为FAdV血清11型,感染SPF鸡后临床发病不明显,致死率低,病死鸡能产生特征性的包涵体肝炎病变,且病毒可在鸡体内外进行复制。     

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及生物学特性分析

鸡传染性法氏囊病（IBD）是一种严重危害养禽业的高度致死性和免疫抑制性传染病。为研制IBD重组火鸡疱疹病毒（HVT）活载体疫苗,本研究构建了表达鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）保护性抗原VP2基因的重组HVT并对其体外生物学特性进行了分析。通过RT-PCR扩增IBDV超强毒株VP2基因并克隆入pCI载体,获得重组真核表达质粒pCI-VP2。用限制性内切酶将携带CMV启动子的VP2基因表达框架切下,连接于入门质粒pENTR,构建获得重组入门质粒pENTR-VP2。将pENTR-VP2与HVT重组黏粒H3-Kan/ccdB进行LR重组反应,构建重组表达黏粒H3-VP2。用H3-VP2与其他4个相互重叠并覆盖HVT全基因组的黏粒共同转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,拯救获得重组病毒rHVT-VP2。将重组病毒在CEF中连续传至20代后用PCR、间接免疫荧光试验和免疫印迹试验进行检测,并绘制重组病毒体外生长曲线,分析其体外复制特性。结果表明,重组病毒rHVT-VP2能够稳定表达VP2蛋白,rHVT-VP2在CEF中的复制能力与亲本病毒无明显差异。重组病毒rHVT-VP2免疫鸡后能够诱导产生IBDV中和抗体,并对IBDV强毒株攻击引起的死亡提供90%免疫保护。重组病毒rHVT-VP2的构建为研制IBD重组HVT活载体疫苗奠定了基础,对IBD的防控具有重要意义。     

新型鸭呼肠孤病毒分离鉴定及其σC基因序列分析

【目的】 了解并掌握新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）流行特点及生物学特性,为NDRV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】 采集河北某鸭场疑似发生鸭呼肠孤病毒感染的组织,无菌处理后接种SPF鸡胚分离病毒,收获第3代尿囊液进行血凝试验,通过PCR、透射电镜观察、间接免疫荧光法（IFA）鉴定病毒,对分离得到的病毒进行体外细胞培养和动物回归试验,并采用Mega 7.0对其σC基因进行遗传进化分析。【结果】 分离得到的病毒不能凝集鸡红细胞,可致死鸡胚,死亡鸡胚出血、充血严重;经PCR鉴定,病毒呈NDRV阳性,其他病原（禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、禽腺病毒血清4型）均呈阴性,将分离得到的病毒命名为BD/CHN/2020株;病毒纯化后,经电镜观察可见直径为60~80 nm、无囊膜的球形病毒粒子,该毒株可在BHK和LMH细胞上稳定增殖并产生细胞融合的细胞病变效应（CPE）;IFA结果显示,BD/CHN/2020株接种BHK细胞后在激光共聚焦显微镜下观察可见特异性绿色荧光;BD/CHN/2020株经皮下接种后,发病鸭出现精神沉郁、排白色稀粪等临床症状,剖检可见脾脏出血、肿大、有白色坏死灶等病理变化;序列比对发现,BD/CHN/2020株与NDRV毒株（TH11、091等毒株）在同一分支,与NDRV SY株核苷酸和氨基酸序列相似性最高,均为99.7%,属于NDRV。与灭活疫苗TH11株（KC493571.1）和弱毒疫苗JS01-105P株（V202168）相比,BD/CHN/2020株第93、120、132、158、253、298位氨基酸处发生了位点突变。【结论】 成功分离得到1株NDRV BD/CHN/2020株,分离毒株对北京鸭有较强的致病性,与国内疫苗株相比,BD/CHN/2020株的σC蛋白已经发生了氨基酸位点的突变,结果可为新型鸭呼肠孤病毒病的流行病学及疫苗研发奠定基础。     

表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5的构建及鉴定

【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV） VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒（Human adenovirus serotype-5，HAdV-5），以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2；PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞，利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2；将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞，包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5（rAd5-VP2），将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞（Vero、CEF和DF1细胞）并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养，测得第10代病毒的滴度为7.9×10⁹ IFU/mL；RT-PCR结果显示，VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译；Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达，蛋白分子质量为41 ku；将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达，表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5，该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。