绵羊miR-449a/b前体序列组织表达及生物信息学分析

【目的】探究miR-449a/b在绵羊生长发育和繁殖性能方面的作用,为进一步研究miR-449a/b在绵羊繁殖调控中的作用提供参考。【方法】以湖羊为研究对象,利用实时荧光定量PCR技术鉴定miR-449a/b在湖羊下丘脑、垂体和卵巢中的相对表达量。使用TargetScan、miRWalk、miRDB软件预测绵羊miR-449a/b前体序列的靶基因,利用微生信和KOBAS网站对其进行GO功能和KEGG通路富集分析。【结果】试验获得的前体序列与NCBI数据库中绵羊前体序列信息比对结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,miR-449a在垂体中的相对表达量显著高于miR-449b(P<0.05),miR-449b在卵巢中的相对表达量极显著高于miR-449a(P<0.01)。利用3个靶基因预测软件做韦恩图分析,取其交集得到miR-449a/b的靶基因数目分别为299和23个。GO功能富集显示,miR-449a/b主要被富集到生物进程;KEGG通路富集结果取前20个通路进行分析发现,主要包括催产素、MAPK等与繁殖调控相关的信号通路。【结论】miR-449a在垂体中的表达量较高,mi...     

毛壳素对绒山羊ADSCs组蛋白甲基化修饰的影响研究

为了探究毛壳素对绒山羊脂肪间充质干细胞(gADSCs)组蛋白甲基化修饰差异的影响。本研究采用不同浓度的毛壳素对gADSCs进行不同时间的处理,以期筛选出对细胞活性影响最低且能够最大程度抑制gADSCs组蛋白甲基化的药物处理浓度及时间。以最适药物浓度和时间处理组为试验组,无药物处理组为对照组,通过实时荧光定量PCR检测H3K9 me2和H3K9 me3甲基化相关酶和胚胎发育多潜能基因mRNA表达水平的改变,并检测毛壳素对组蛋白H3K9 me2和H3K9 me3蛋白表达水平的影响。结果显示,20 nmol·L^-1的毛壳素处理gADSCs 48 h时对细胞活性影响较小,组蛋白甲基化转移酶G9A的表达显著降低(P<0.05),为最适处理浓度和时间。实时PCR结果显示,试验组H3K9 me2和H3K9 me3甲基化转移酶EHMT1、EHMT2、SUV39H1、SUV39H2表达显著降低(P<0.05),H3K9 me2和H3K9 me3去甲基化酶KDM3A、KDM3B、KDM4B、KDM4D表达显著增高(P<0.05),多潜能性相关基因SOX2、OCT4、NANOG表达量增高。免疫荧光和WB结果显示,处理组H3K9 me2蛋白水平无明显变化,而H3K9 me3蛋白水平显著降低(P<0.05)。20 nmol·L^-1的毛壳素处理gADSCs 48 h后可以显著降低组蛋白H3K9 me2和H3K9 me3的甲基化修饰作用,提高多潜能性相关基因的表达。     

bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c靶基因预测及生物信息学分析

【目的】试验旨在对bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的序列保守性、转录因子和靶基因进行生物信息学预测和分析,探究其影响精子发生的作用机制,为研究其生物学功能及作用机制提供指导和思路。【方法】利用miRBase数据库获取不同物种的bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c序列并进行相似性分析;通过TargetScan、miRWalk、miRDB等方法预测bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因,对获得的靶基因集合分别进行GO功能和KEGG通路富集分析;通过AnimalTFDB获取共同调控bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的转录因子,并构建TF-miRNA-mRNA作用网络。【结果】bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c在不同物种间高度保守。预测得到2个转录因子和49个候选靶基因,这些靶基因主要富集在精子发生、钙离子依赖性胞吐的调节、胰岛素分泌的调节等GO条目,以及HIF-1信号通路、甲状腺激素信号通路、Wnt信号通路等KEGG通路。bta-miR-34b/c、bta-m...     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

过表达KDM4家族基因对猪克隆胚胎体外发育效率的影响

为了探究过表达H3K9me3的组蛋白去甲基化酶4(KDM4)家族基因对猪克隆胚胎体外发育效率的影响,试验采用pc-KDM4A～D质粒构建、酶切鉴定、细胞转染、定量PCR扩增及体外转录等方法制备过表达KDM4A～D的猪胎儿成纤维细胞和KDM4A～D mRNAs,通过体细胞核移植和显微注射的方式制备过表达KDM4A～D的猪克隆胚胎。将供体细胞过表达KDM4A～D的猪克隆胚胎分为1个对照组和5个试验组,分别为pcDNA3.1(+)组、pc-KDM4A组、pc-KDM4B组、pc-KDM4C组、pc-KDM4D组及4质粒组;将注射KDM4A～D mRNA的猪克隆胚胎分为1个对照组和5个试验组,分别为H₂O组、KDM4A组、KDM4B组、KDM4C组、KDM4D组及4mRNA组。统计各组的卵裂数、囊胚数和囊胚细胞数;利用免疫荧光检测4质粒组和4mRNA组4-细胞期猪克隆胚胎中H3K9me3的表达水平。结果表明：pc-KDM4A～D质粒构建成功,质粒转染的猪胎儿成纤维细胞可过表达KDM4A～D和降低细胞内H3K9me3水平。与pcDNA3.1(+)组比较,4质粒组可显著提高猪...     

丙酮酸对猪早期胚胎发育的影响

在哺乳动物中,早期胚胎发育阻滞一般发生在胚胎由输卵管向子宫角转移的时期,此时输卵管液中的物质对早期胚胎发育尤为重要,如葡萄糖、乳糖、丙酮酸.丙酮酸是大多数能量物质在代谢过程中的中间产物,在抗氧化、间接调节信号等过程中都发挥着重要作用,并且是卵母细胞和合子能够直接利用的主要能量底物.此外,早期胚胎发育阻滞时期恰好是母源-...     

提高绵羊早期体外胚胎发育效率的研究

哺乳动物胚胎体外发育培养技术是胚胎发育生物学、转基因、动物克隆等研究的重要技术平台.因此,建立稳定的体外胚胎培养体系和提高胚胎发育效果显得尤为重要.     

DNA甲基化对早期胚胎发育的影响

综合分析了DNA甲基化的表观遗传特征,结合DNA甲基化在不同物种、不同发育阶段胚胎中的调控模式,以期从早期胚胎死亡角度揭示DNA甲基化作用对胚胎早期发育基因的表达调控作用,进而阐明胚胎发育过程中的表观遗传调控机制。     

牛几种卵母细胞数和精子浓度对体外受精及早期胚胎发育的影响

在容量为46μl的受精液滴中,(一)滴内精子浓度固定为1.2～1.7×100/ml,每滴分别加入1、10、25、50枚体外培养成熟的卵母细胞;(二)每滴内放入10枚成熟卵母细胞,加入不同量的精子,使滴内精于浓度分别为0.64×10~6/ml、1.6×10~5/ml、3.2×10~6/ml和4.8×10~6/ml。卵母细胞的体外成熟及体外受精均按Lu等报导的方法进行。试验结果表明,当受精液滴内精子浓度为1.2～1.7×10~6/ml,活率达0.45时,每滴加50枚卵母细胞进行受精,对分裂率和胚胎发育率均无显著影响(P>0.05)。受精滴内含10枚卵母细胞,加入活率为0.45的精子,较合适的精子浓度为0.64×10~6/ml～1.6×10~6/ml。精于浓度高于1.6×10~6/ml时,对分裂率虽无影响,但对分裂球进一步发育至囊胚有一定的影响。     

牛早期胚胎发育影响因子研究进展

早期胚胎的死亡给畜牧业的发展带来了巨大的经济损失,本文分析了影响牛早期胚胎发育的诸多因素,阐述了黄体功能对早期胚胎发育的影响,指出生长因子和细胞因子可能是非人为因素中早期影响胚胎发育的最重要的因素。     

香猪睾丸miR-449b和miR-222分子的发育性变化

为了阐明miR-449b和miR-222对贵州从江香猪睾丸发育的调节作用。运用qPCR方法检测香猪睾丸组织中miR-449b和miR-222表达量的发育性变化,通过miRSystem数据库、Kobas数据库对预测的靶基因进行信号转导通路富集分析。经克隆测序,得到香猪miR-222序列,与猪的相似性为100%,而且物种之间miR-449b和miR-222两个分子的保守性都很高。香猪睾丸中miR-449b于1~4月龄期间的表达量逐渐上升,4月龄时表达量达到峰值,之后下降;miR-222的表达量呈现相反的变化趋势,于1~4月龄期间表达量逐渐下降,1月龄时最高,4月龄时最低,之后的表达量有所回升;已知物种的miR-449b和miR-222序列高度保守;经预测miR-449b靶基因有420个,富集于卵母细胞减数分裂、Notch信号通路、Ras信号通路等100个途径(P0.05),miR-222的靶基因有429个,富集于细胞周期、Fox O信号通路、TGF-β信号通路等69个通路(P0.05);miR-449b和miR-222的靶基因共享的通路为Wnt信号通路、MAPK信号通路、雌激素信号通路等42个(P0.05)。     

影响胚胎早期发育环境因素的研究进展

妊娠期生理状态的改变,使母体对治疗药物和各种环境有害物质的吸收、分布和排泄发生了较大的改变。在发育初期,胚胎对治疗药物和环境因素的影响极为敏感,此时各种有害因素都可导致胚胎的损伤,甚至丢失。许多药物和环境因素是引起早期胚胎死亡或胎儿畸形的主要因素。环境类激素可直接作用于中枢神经内分泌调节系统,引起生殖激素分泌紊乱,出现生殖率下降和胚胎发育异常。重金属铅、镉、汞、砷可导致早期胚胎的丢失,或使胎儿出现畸形。对于药物和环境因素对胚胎发育的毒性评估,妊娠动物服用的剂量对妊娠结果仍然是最基本的方法,而用BBDR模型来反映药物在低剂量情况下的作用以及在种间变化是近年来常用的模型。另一方面,细胞和分子的水平上观察环境毒物造成畸胎发生的机理也是活跃的研究领域。     

哺乳动物早期胚胎性别鉴定技术研究进展

哺乳动物早期胚胎性别鉴定是人们实现性别控制的重要途径。随着科学技术的发展和各种新的研究工具在性别鉴定中的应用,性别鉴定已越来越接近于能够在生产实践中应用。目前应用较多、重复性较好的性别鉴定方法主要有细胞遗传学方法、生物化学方法、免疫学方法和分子生物学方法等。文章主要综述了哺乳动物早期胚胎性别鉴定技术的研究现状,并分析了这些方法存在的问题及发展前景,为哺乳动物早期胚胎性别鉴定的研究提供借鉴。     

低氧分压通过低氧诱导因子(HIF)影响卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育

卵母细胞和早期胚胎的体外培养(IVC)是哺乳动物胚胎工程的一项关键技术,是生殖生物学和转基因与克隆技术等生物技术研究的基础.影响卵母细胞和早期胚胎体外培养的因素包括培养液组成成分、离子浓度和渗透压,培养环境气相组成和温度等.最近研究表明,培养系统中的氧分压可以显著影响胚胎的发育,而这种影响主要由低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)进行调控.作者综述了氧分压及HIF对卵母细胞和早期胚胎体外发育的影响,并对HIF的结构及调控机制进行讨论,为研究低氧培养技术在卵母细胞和早期胚胎体外培养中的应用提供依据.     

Effects of Low Oxygen Tension for in vitro Oocyte Maturation and Early Embryo Development through Hypoxia-inducible Factor (HIF)

Oocytes and early embryo in vitro culture (IVC) was a key technology of mammalian embryo engineering and was the basis of biotechnology such as genetically modified (GM) and cloning research.The factors,which affect the efficiency of in vitro culture for oocytes and early embryo,include the composition,ion concentration and osmotic pressure of the culture medium,and the gas composition and temperature of the culture environment. Recent studies have shown that the oxygen tension in the culture systems can significantly affect the development of embryos,and this effect is mainly regulated by the hypoxia-inducible factor (HIF). This paper reviewed the effects of the oxygen tension on oocyte maturation and early embryo development,and the structure and regulation mechanism of HIF were discussed,in order to provide a theoretical basis for further explore the application of hypoxia method in the in vitro culture of oocytes and early embryo.     

“牛早期胚胎发育观察”实验教学改革探索

早期胚胎发育是现代生物技术的基础和重要环节之一,通过开设"牛早期胚胎发育观察"实验,可为学生掌握相关生物技术奠定基础。阐述了传统"牛早期胚胎发育观察"实验教学中存在的问题及相应的改革措施,以期提高该课程的实验教学质量,充分调动学生的实践主动性和创造性,提高学生的实验操作技能,培养应用型高素质创新人才。     

乌骨鸡早期胚胎发育的研究

在鸡产蛋后，不同时间获取受精卵，观察早期胚胎发育变化规律，依据胚盘形态的变化，可将鸡胚在体内发育过程分为两个时期：（1）距前一个蛋产出后5.5h(0-1h子宫龄）至15.5h(10-10.5h子宫龄）为鸡胚的卵裂期，卵裂的结果形成厚约6－7层细胞的胚盘。（2）距前一个蛋产出后17.5h（12－12.5h子宫龄）至明区形成期，即鸟类的囊胚期晚期，结果在胚盘中央形成透明的明区和周围不透明的暗区。乌果骨受精卵第一次分裂发生在产蛋后5h（0－0.5h子宫龄），桑椹期在产蛋后11.5h(6-6.5h子宫岭），囊胚期在产蛋后15.5h(10-10.5h子宫龄）。     

早期鸡胚发育过程中增殖细胞核抗原在法氏囊的表达

法氏囊是鸟类特有的器官,是B淋巴细胞成熟的场所.本研究分析了鸡胚早期发育过程的中法氏囊形态变化及增殖细胞核抗原PCNA表达变化.结果表明鸡胚6.5 d(E6.5)时,法氏囊开始出现在鸡胚泄殖腔的最深处,从最开始E6.5的一些小的囊泡发育成E8的一个大腔,E8～E10,法氏囊继续发育.从E11开始,法氏囊开始出现一些小的皱褶,E11～E18,这些小的皱褶逐渐变得清晰,并贯穿整个法氏囊.在E9时,法氏囊轮廓形成,可以发现在表皮层和基膜层PCNA有着广泛的表达.统计分析表明表皮层的PCNA阳性率在100％左右,在整个发育早期几乎没有变化;而基层的阳性率随着胚胎的发育逐渐下降,在E9、E10、E11、E12、E14和E18表达率分别是97％、93％、71％、55％、56％和20％.