利用单碱基编辑系统定点编辑哈萨克羊MSTN基因的研究

肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）可负调控骨骼肌的发育。本研究利用胞嘧啶碱基编辑器（cytidine base editor,CBE）在哈萨克羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子,以期达到敲除MSTN基因的目的。共设计2条靶向哈萨克羊MSTN基因不同外显子的sgRNAs,分别连接至pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒,并与pCMV-AncBE4 max-P2A-GFP质粒共转染哈萨克羊胎儿成纤维细胞,经Cruiser^TM酶酶切检测、Sanger测序和TA克隆分析。结果显示,成功筛选出可以在哈萨克羊MSTN基因外显子提前引入终止密码子的2条sgRNAs,其中STOPsg-1靶位点编辑效率为26.7%,STOPsg-2靶位点的编辑效率为6.7%。本研究成功运用CBE（AncBE4 max）技术在哈萨克羊胎儿成纤维细胞MSTN基因编码区实现定点编辑,为培育精确编辑MSTN基因的哈萨克羊奠定基础。     

碱基编辑器介导的猪IGF2基因高效定点突变

本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast cells,PFFs）中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2,IGF2）进行高效、精确的定点编辑。通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的IGF2基因序列进行鉴定,构建靶向巴马猪的sgRNA-IGF2表达载体,进而通过细胞转染、混合细胞编辑效率检测、单克隆细胞筛选及基因型鉴定等技术手段研究不同碱基编辑器对猪IGF2基因靶点的编辑效率及突变类型。结果显示,巴马猪和大白猪IGF2基因第3内含子存在第3 072 bp处的单核苷酸多态性（SNP）位点,设计靶向巴马猪IGF2基因的单链寡核苷酸序列。单链寡核苷酸经退火后与BsaⅠ线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行重组连接,构建sgRNA-IGF2表达质粒,重组质粒测序结果表明,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间。将rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器分别与sgRNA-IGF2表达质粒共转染至猪胎儿成纤维细胞中,对混合细胞编辑效率进行检测结果表明,对于IGF2基因靶点,hA3A-BE3系列碱基编辑器C到T的编辑效率显著高于rA1-BE3（P<0.05）。流式分选、单克隆细胞培养及鉴定结果表明,虽然有71.43%的hA3A-BE3单克隆细胞已被编辑,但有42.86%的细胞存在插入和缺失（indels）;hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F的编辑效率（56.86%和40.38%）虽低于hA3A-BE3（71.43%）,但是indels的效率也较低（31.37%和21.15%）。测序结果分析表明,利用碱基编辑器高效筛选到IGF2基因靶点纯合点突变的单克隆细胞。碱基编辑器作为新的基因编辑工具,可以对猪基因组中与经济性状关联的SNP位点进行高效、精确的基因修饰,为加速猪经济性状的遗传改良提供理论与实践基础。     

猪CD163基因的单碱基编辑研究

旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C＞T的单碱基突变,形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止.利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点,并且C5后续的两个碱基为A A,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍.PCR扩增CD...     

单碱基水平上胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的研究进展

尽管新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9拥有众多优点,但在执行单个碱基水平的突变时其效率往往很低。由于DNA的双链断裂具有很多的不确定性,又加上基于供体模板的同源末端重组（homology directed repair,HDR）仅仅发生在分裂活跃的细胞中,而非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）在整个细胞周期中都可以发生,因此,传统CRISPR/Cas9在单碱基分辨率上进行基因编辑时存在一定弊端。碱基编辑器（base editor,BE）的出现则在一定程度上弥补了这一缺陷。胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor,CBE）或腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor,ABE）都能够在不引起双链断裂的情况下实现C·G到T·A或A·T到G·C的转换,极大地提高了单碱基编辑的应用价值。本文侧重对出现较早的CBE的原理、发展、应用及存在的问题进行综述,以期为高效单碱基突变工具在生物医学和畜牧业生产中的应用提供有益的参考和借鉴。     

高坡猪肌肉生长抑制素基因多态性及其与肉质性状的相关性分析

为了探讨肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因的多态性对高坡猪肉质性状（水分、粗脂肪、粗蛋白质、粗灰分、眼肌面积、大理石纹、pH、肉色、嫩度、滴水损失、失水率）的影响,试验以MSTN基因作为肉质性状候选基因,以10月龄的50头高坡猪为研究对象,采用PCR扩增产物直接测序的方法对高坡猪MSTN基因3个外显子的单核苷酸多态性（SNP）进行研究,运用SPSS 20.0软件分析MSTN基因SNP与肉质性状的关联性。结果表明,仅在高坡猪MSTN基因第3外显子63 bp处检测到1个C/T突变位点,该突变为同义突变,未引起编码氨基酸的改变。基因型分析发现,仅有3个个体在该位点发生突变,CC基因型为优势基因型,C为优势等位基因,无TT纯合基因型。经χ²适合性检验分析,该SNP在研究群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。群体遗传参数分析发现,C63T标记位点的杂合度（He）相对较低,表明其在高坡猪群体中的变异较小;就多态信息含量（PIC）而言,该位点属于低度多态（PIC<0.25）,说明该遗传标记能够提供少量的遗传信息。将该位点的不同基因型与肉质性状指标进行关联分析表明,所有肉质性状指标在不同基因型间差异均不显著（P>0.05）。综上所述,MSTN基因外显子在高坡猪中存在多态性,但变异较少,相对保守,能否作为高坡猪肉质性状的遗传标记有待于扩大样本数量进一步研究。     

欧拉藏绵羊MSTN基因单碱基编辑体系的建立

肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）基因突变时会导致肌纤维增粗,肌肉细胞增多,表现出双肌性状。为敲除欧拉藏绵羊MSTN基因以获得产肉性状更优的欧拉藏绵羊,利用胞嘧啶碱基编辑系统（CBE）在欧拉藏绵羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子。在MSTN基因3个外显子区域上各设计1条sgRNA,分别连接至pEF1a-BE4max-NG-mU6-gRNA-blast质粒并转染欧拉藏绵羊耳成纤维细胞,通过Sanger测序和T-A克隆检测,成功筛选出1条靶向外显子I的符合预期的sgRNA,编辑效率20%。本研究成功通过单碱基编辑技术在欧拉藏绵羊耳成纤维细胞MSTN基因编码区进行定点编辑,为通过分子育种培育产肉性状更佳的欧拉藏绵羊新品种奠定基础。     

猪肌肉生长抑制素基因的研究进展

肌肉生长抑制素(MSTN)是骨骼肌生长发育的负调控因子。其活性的丧失或降低，会引起动物肌肉的过度发育，表现为双肌征状。最早在小鼠中发现该基因，随后通过荧光原位杂交法将猪MSTN基因定位于15q2.3上，进而分析了MSTN以及其分子结构，比较。MSTN基因在不同物种间的同源性。     

绵羊胚胎FGF5基因单碱基突变体系的建立

研究旨在利用单碱基编辑技术定点修饰绵羊（Ovis aries）成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor 5,FGF5）基因第1外显子以引入终止密码子,获得定点编辑类型的绵羊胚胎,为培育具有长毛性状的绵羊提供试验材料。首先设计合成4个单导向RNA （single guide RNA,sgRNA）寡核苷酸链（sgRNA-T1~sgRNA-T4）,构建4组不同的重组表达载体;将构建好的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pCMV-AncBE4max-P2A-GFP质粒以共转染的方法分别转入4组绵羊成纤维细胞,随后用Cruiser^TM酶对转染的细胞进行活性检测并在胚胎水平进行测序验证。结果显示,sgRNA-T1和sgRNA-T4组细胞的PCR产物可被Cruiser^TM酶酶切,且测序结果表明都具有靶向效果,编辑效率分别为68.75%和47.37%。利用显微注射技术将不同浓度的AncBE4max mRNA与有效sgRNA混合注射到绵羊孤雌激活胚胎中,并检测胚胎卵裂率、囊胚率和编辑效率,结果显示,胚胎水平的最佳注射浓度组合为AncBE4max （ng/μL）∶sgRNA （ng/μL）=100∶50,从该浓度组中随机挑选的单枚胚胎测序结果显示,引入终止密码子的编辑效率为80%。而sgRNA-T1在不同浓度组合的注射胚胎中均未检测到编辑。本研究针对FGF5基因的第1外显子,通过在成纤维细胞转染表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊FGF5基因的2个sgRNA （T1、T4）;通过显微注射绵羊孤雌激活胚胎,成功在胚胎上实现FGF5基因第1外显子打靶位点C→T的转变,为后期FGF5基因定点编辑羊的生产奠定基础。     

动物机体中肌肉生长抑制素基因的研究进展

肌纤维作为构成肌肉组织的基本单位,其生成在分子水平上受到肌细胞生成素等基因的精确调控,其中肌肉生成抑制素（Myostain,MSTN）负向调控肌肉生长,对肌肉细胞的分化生长起负向调节作用。本文主要就MSTN基因的表达、生物学功能、作用机制、在动物中的最新研究进展以及发展前景进行综述。     

西南矮马肌肉生长抑制素基因启动子区PCR-RFLP 多态性检测

利用PCR-RFLP技术对贵州矮马、德保矮马和宁强矮马3个品种的45个个体的肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)基因的启动子区进行多态性分析。结果表明,大小为204 bp的扩增片段经限制性内切酶SspⅠ酶切后,不同基因型经过测序发现156T→C突变,产生AA和AB两种基因型,没有发现BB基因型。贵州矮马和宁强矮马中AB基因型频率大于AA基因型,德保矮马中AA基因型占优势,在3种矮马品种A等位基因频率均大于B等位基因。卡方检测结果发现,贵州和德保矮马在该酶切位点处于平衡状态(P＞0.05),而宁强矮马在该位点分布差异显著(P＜0.05)。     

猪MSTN前肽定点诱变载体在C2C12细胞中的表达

本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性.以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序.再将目的片段定向克隆到去除了EGFP基因的pEGFP-N1表达载体上.通过定点诱变方法将前肽编码序列第76位天冬氨酸突变为丙氨酸,获得定点诱变载体pEGFP(-)-N1-ProMstnD76A,并瞬时转染C2C12细胞.转染48 h后,通过RT-PCR和Real-time PCR方法检测目的基因的表达情况.结果表明:本研究成功克隆了通城猪含第1个内含子的MSTN前肽基因,并对该基因进行定点诱变修饰,构建了真核表达载体,转染后其前体mRNA能在C2C12细胞中进行正确剪接,目的基因mRNA表达水平较高.这为猪MSTN前肽基因在体内表达的研究奠定基础,并为制备转基因猪提供有用的分子材料.     

Efficient Site-directed Mutation of Porcine IGF2 Gene via Base Editors

This study was aimed to efficiently and accurately edit the growth trait-related gene insulin-like growth factor 2 (IGF2) in porcine fetal fibroblasts cells (PFFs) of Bama pigs using base editors.The IGF2 gene sequences of Bama pigs and Large White pigs were identified by PCR amplification and sequencing,and the expression vector of sgRNA-IGF2 targeting Bama pigs was constructed.Then the editing efficiency and product types at IGF2 gene via different base editors were studied by cell transfection,detection of mixed cell editing efficiency,screening of single cell colonies and genotyping.The results showed that there was a single nucleotide polymorphism (SNP) site at 3 072 bp in intron 3 of IGF2 gene between Bama pigs and Large White pigs,and a single-stranded oligonucleotide sequence targeting the IGF2 gene was designed.The single-stranded oligonucleotide was annealed and ligated with the BsaⅠ-linearized pGL3-U6-sgRNA plasmid to construct the sgRNA-IGF2 expression plasmid.The sequencing results of the recombinant plasmid showed that the sgRNA sequence was accurately inserted between the U6 promoter and the sgRNA scaffold.Four different cytosine base editors (rA1-BE3,hA3A-BE3,hA3A-BE3-Y130F and hA3A-eBE-Y130F) were co-transfected with sgRNA-IGF2-expressing plasmid into PFFs,respectively.The editing efficiency in mixed cells showed hA3A-BE3-based CBEs could introduce higher efficiency of C-to-T mutation than rA1-BE3 (P<0.05).The results of flow cytometry,single cell culture and genotyping showed that 71.43% of single cell colonies were mutant in hA3A-BE3 group,but 42.86% of them had insertions/deletions (indels).The editing efficiency of hA3A-BE3-Y130F (56.86%) and hA3A-eBE-Y130F (40.38%) were lower than hA3A-BE3(71.43%),but the indels of them were also lower (31.37% and 21.15%).In addition,single cell colonies with homozygous mutation at IGF2 gene site were achieved by base editors in this study.Base editors,as new gene editing tools,could efficiently and accurately modify SNP associated with economic traits in pig genome and accelerate genetic improvement.     

肌肉生长抑制素基因的研究进展

肌肉生长抑制素(MSTN)基因是畜禽生产力的重要候选基因,并成为提高畜禽肉产量的研究的焦点。近年来,有关牛、猪、斑马鱼MSTN基因的研究不断增加,该领域的深入探讨可能对畜牧生产和医学上产生深远影响。本文较全面地介绍了MSTN基因的发现、基因的结构、基因的表达、作用机理及发现的突变点和多态性,评价了研究MSTN基因的意义。     

肌肉生长抑制素基因的研究进展

肌肉生长抑制素(MSTN)基因是畜禽生产力的重要候选基因,并成为提高畜禽肉产量的研究的焦点.近年来,有关牛、猪、斑马鱼MSTN基因的研究不断增加,该领域的深入探讨可能对畜牧生产和医学上产生深远影响.本文较全面地介绍了MSTN基因的发现、基因的结构、基因的表达、作用机理及发现的突变点和多态性,评价了研究MSTN基因的意义.     

3个绵羊品种MSTN基因多态性的比较分析

对杜泊绵羊、小尾寒羊和晋中绵羊3个品种的MSTN基因编码序列进行克隆测序,并比较分析该基因编码区的SNPs。结果表明：在引物P1、P2、P3扩增的MSTN基因片段中存在10个SNPs,其中4个SNPs位于非编码区,6个SNPs位于编码区;编码区中有2个SNPs为无义突变,其他4个为错义突变。因此,绵羊MSTN基因在进化过程中保守性不强,可能存在较多的变异位点,为进一步群体遗传分析提供了基础。