猪流行性腹泻病毒M基因及其片段原核表达效果分析

将猪流行性腹泻病毒的M基因及编码M蛋白膜外区M基因片段（M’）分别亚克隆到原核表达载体pJLA605和pGEX-6p-1中，构建了重组质粒pJLA605-M、pGEX-6p-M-GST、pGEX-6p-M和pGEX-6p-M’，转化大肠杆菌后。探索了M蛋白在N端和C端不带有谷胱苷肽巯基转移酶（GST）、N端和C端均带有GST、只在N端带有GST以及只含有M蛋白的膜外区M’蛋白的表达情况。SDS-PAGE分析结果表明，N端和C端带有GST的pGEX-6p-M-GST和只含有膜外区M’基因的重组质粒pGEX-6p-M’获得了高效表达，经Bandscan5．0软件分析，其表达产物分别以融合蛋白GST-M和GST-M’形式存在，表达量分别为20％和45％。在对重组质粒pJLA605-M转化的大肠杆菌诱导表达过程中发现菌体生长的抑制现象，说明M蛋白对宿主菌有一定的毒性，进一步提取包涵体进行SDS-PAGE发现M蛋白以包涵体的形式得以表达。猪流行性腹泻病毒M蛋白的毒性作用可能与M蛋白具有的出芽功能有关，因而表现出对大肠杆菌的细胞壁的破坏作用。     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

猪流行性腹泻病毒M基因的表达及鉴定

为了更好的研究近两年在我国爆发的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)疫情,本实验室收集不同发病地区的临床样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea,PEDV)RT-PCR检测,并挑选8个阳性样品对其M基因进行扩增,克隆和测序。序列比对的结果显示,8个分离株与14个参考株之间的核苷酸以及氨基酸同源性分别是96.5%～99.9%和96.0%～100%,表明目前流行的PEDV其M基因是相对保守的。同时,我们将ZZ-1株的M基因克隆于原核载体pGEX-6p-1,转入菌株BL21中后获得了大量表达,重组蛋白大小约为50 kDa。利用PEDV阳性猪血清对纯化后的重组M蛋白进行Western blot分析,结果表明重组表达的M蛋白与临床阳性猪血清具有良好的免疫反应性。     

猪流行性腹泻病毒M基因克隆与分子特征分析

为更好地了解近年来中国暴发的猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）疫情,本研究采集荣昌及其周边地区疑似患有PED的猪小肠上皮组织进行RNA的提取,扩增猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）M基因序列,进行序列分析及M蛋白分子特性研究。结果显示,M基因开放阅读框（ORF）长为681 bp,编码226个氨基酸。通过DNAMAN软件及系统进化树分析发现,本试验中PEDV与GenBank中参考毒株的M基因氨基酸同源性在96.0%以上,其中与广东毒株CH/SD-M/2012株亲缘关系最为相近,同源性高达96.9%,表明M基因相对比较保守。通过M蛋白同源建模及功能预测发现,M蛋白晶体模型同SARS冠状病毒nsp14-nsp10复合体5c8s.1.A及NAD激酶Ⅰ2i1w.1.B模型序列相似性为27.69%、15.07%;其高级结构中在第110-113、118-125、132-136、140-145、147-152、154-157、160-173位氨基酸处存在7个α螺旋,在第98-100、102-107、135-137、139-145、149-154氨基酸存在5个锌指结构配体,M蛋白为PEDV病毒基因组复制酶的多聚蛋白。     

2011年—2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析

本试验应用RT-PCR方法对2011年1月—2014年4月采自广西南宁、玉林等14个地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测。结果显示331份样品中有210份为PEDV阳性,阳性率为63.44%。对其中25份阳性样品的PEDV M基因进行克隆和测序,将测序结果与GenBank中PEDV参考毒株的M基因序列进行同源性比对分析并构建系统进化树。25个PEDV M基因序列与51个参考毒株M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.9%、94.3%~99.6%。PEDV M基因遗传变异分析结果表明,广西2013年—2014年的PEDV流行毒株与北京、安徽、武汉、河北、广东等地2010年—2013年的流行毒株亲缘关系较近,而与中国早期分离株CH/S(GenBank登录号:JN547228)、疫苗株CV777(GenBank登录号:AF353511)和Attenuated DR13(GenBank登录号:JQ023162)的遗传距离较远。提示广西现流行的PEDV与早期毒株相比已发生较为明显的变异。     

猪流行性腹泻病毒荧光抗体的制备及应用

本研究旨在建立一种可辅助猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离鉴定的直接荧光抗体检测方法。借助基因工程技术融合表达PEDV S1基因中和抗原表位区域（COE）,层析柱法纯化兔源免疫球蛋白IgG,搅拌法标记荧光素。通过Western blotting和动物免疫试验测定表达融合蛋白的抗原性,间接ELISA方法测定免疫后的抗体效价,直接免疫荧光法测定标记荧光抗体的特异性,梯度稀释方法测定标记抗体的最佳工作浓度。结果显示,本研究成功将423 bp的S1基因中和抗原表位COE进行融合表达,表达蛋白大小约40 ku,蛋白命名为pGEX-6P/COE;Western blotting检测结果表明,融合蛋白具有良好的反应原性;ELISA检测结果显示,免疫后35 d的血清抗体效价达1：25 600;与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪瘟病毒（CSFV）及猪细小病毒（PPV）等均无非特异性反应,标记的荧光抗体具有良好的特异性,最佳工作稀释度为1：32~1：64。综上所述,本试验制备的直接免疫荧光抗体可用于细胞平台上的PEDV快速检测,能直观地提供相关检测数据,对于病毒分离过程的取舍具有重要指导意义。     

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D 蛋白免疫 BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明, S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示, 腹水的抗体效价达到了1∶1 000 000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV) 5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与 PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究 PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒流行毒株S基因截短表达与抗原性分析

临床分离获得1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),对其纤突(S)基因5'端序列分析比较表明,该分离株(NB2011)与目前国内流行的猪流行性腹泻病毒毒株同源性为99%以上,与经典毒株(CV777)的同源性仅为82.6%。经氨基酸分析比较,PEDV纤突蛋白发生明显变异,在抗原位点35-55aa以及100-145aa区间存在很大差异。本试验对CV777株与临床分离的NB2011株的S基因N端差异较大的区段(CV777-S661,NB-S673)进行原核表达,分别获得经典株和流行株S基因N端表达蛋白。Western blotting结果表明,S661和S673重组蛋白均能与PEDV阳性血清产生特异性反应,且不与PEDV阴性血清反应。对两种蛋白进行交叉斑点试验,结果表明两者在反应原性上存在差异。研究结果为进一步阐明PEDV流行毒株抗原表位的变异及研究PEDV免疫保护机制打下基础。     

猪流行性腹泻病毒反向遗传学及其研究进展

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是高度接触性肠道传染病猪流行性腹泻（PED）的病原,是有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组全长约28 kb。2010年以来,PEDV G2型高致病性毒株不断发生变异,给全国乃至全球的养猪业造成巨大的经济损失。反向遗传学系统,即构建RNA病毒的全长感染性克隆。近年来,PEDV主要基于靶向RNA重组、BAC系统和体外连接3种方法来建立全长感染性cDNA克隆。文章简述了反向遗传学的原理和方法。靶向RNA重组利用冠状病毒RNA的高同源重组的特点来实现病毒的拯救;BAC系统利用pBeloBAC11载体克服PEDV基因组中含有的毒性序列所导致的cDNA在高拷贝质粒中不稳定的困难;体外连接技术主要利用PEDV基因组本身存在的限制性内切酶的酶切位点或通过改造的酶切位点在体外将病毒分片段地连接成全长的cDNA克隆。另外,文章还总结了近年来基于反向遗传学技术的PEDV相关的研究进展。PEDV反向遗传学是研究PEDV病毒基因组结构功能及设计减毒活疫苗的有效工具,利用反向遗传学技术探究S基因等毒力相关基因,探究其突变或缺失对病毒致病机制的影响,揭示PEDV毒力衰减的分子机制,有望设计出具有良好免疫原性且避免毒株返毒和重组减毒活疫苗。总之,PEDV反向遗传学是研究PEDV基因组结构及功能、病毒宿主相互作用及致病机制的一种重要方法,同时也是设计PEDV减毒活疫苗一种合理有效的途径。     

猪流行性腹泻病毒疫苗研究进展

猪流行性腹泻病(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种肠道传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失,目前尚无有效的治疗药物,接种疫苗仍是主要预防措施。自1971年首次发现PEDV以来,该病毒便不断发生变异并出现了大范围传播,有关PEDV疫苗的研究工作也在不断完善,但免疫效果并不理想。疫苗的安全性和有效性是疫苗研发的首要因素。传统灭活疫苗安全性好,但需多次大量接种;弱毒疫苗免疫原性强,但易毒力返祖;新型亚单位疫苗与灭活疫苗类似,保证抗原蛋白的天然构象、提高免疫原性是今后研发的重点;重组活载体疫苗中的载体本身就充当了“免疫增强剂”的角色,而另一方面,致弱后的载体能否稳定遗传及其安全性还需更深入的研究;面对变异速度极快的冠状病毒,第三代核酸疫苗只需简单修改相应基因即可迅速投入使用,而这类疫苗存在很大的缺口,未来需要侧重于核酸疫苗的研发;利用转基因植物生产疫苗可避免其他动物病原的污染,无需低温储存,植物细胞壁可对抗原蛋白进行保护,避免被酶消化,稳定性好,但这类疫苗在进...     

Prokaryotic Expression of Partial N Gene Fragment of Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Reactionogenicity Analysis of the Expressed Protein

This experiment was aimed to study the antigenicity of prokaryotic expression of the N gene fragment of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),and lay a foundation for establishing an indirect ELISA method of PEDV.The N gene segment was amplified by RT-PCR,then the recombinant plasmid with the vector pET-30a(+) was constructed,which was induced by 0.5 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 h.Furthermore,the expressed product was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting.Sequencing results proved that recombinant plasmid was correctly constructed.The result showed that the PEDV polyclonal antibody could specifically bind to PEDV N protein,which indicated that the recombinant fusion protein had excellent immunogenicity.A prokaryotic expression vector for the fragment of N protein was successfully constructed in this study,which laid a foundation for the development of diagnosis of PEDV.     

猪流行性腹泻病毒部分N基因的原核表达及表达产物反应原性分析

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)部分N蛋白的原核表达产物是否具有抗原性,并为建立PEDV的间接ELISA方法奠定基础,本试验应用RT-PCR技术扩增N基因的部分核酸序列,经克隆后将目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中。重组菌于37 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导4 h后进行SDS-PAGE分析,并进行Western blotting鉴定。结果显示,构建的原核表达重组质粒测序正确,且该蛋白与抗血清(PEDV高免血清)具有良好的反应活性。本试验成功构建了PEDV部分N基因原核表达载体,为后续PEDV感染的血清学诊断方法的建立提供依据。     

Cloning and Molecular Characterization Analysis of M Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

In order to study the porcine epidemic diarrhea (PED) epidemic situation recently,small intestine tissue from piglets suspected porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) were collected in this study. The PEDV M gene was amplified using RT-PCR method and the molecular characterization were analysed. The results showed that the ORF of M gene was 681 bp which encoded 226 amino acids. The percent identity of M gene amino acid between PEDV in this study and reference strains in GenBank were higher than 96.0%,and that with CH/SD-M/2012 strain was highest (96.9%).The phylogenetic tree based on the Neighbor-Joining (NJ) and Minimum-Evolution (ME) showed that the PEDV in this study was closely related to CH/SD-M/2012 strain which were belonged to the same evolutionary branch. The phylogenetic tree analysis illustrated that M gene of PEDV was relatively conservative. The results of homology modeling analysis found that crystal model of M protein was similar to coronavirus nsp14-nsp10 complex 5c8s.1 and NAD kinase Ⅰ 2i1w.1.B which shared 27.69% and 15.07% sequence similarity,respectively. The protein structure prediction analysis found seven α-helix structures located in 110 to 113,118 to 125,132 to 136,140 to 145,147 to 152,154 to 157 and 160 to 173 amino acid regions,and five ligand structures of zinc finger located in 98 to 100,102 to 107,135 to 137, 139 to 145 and 149 to 154, amino acid regions. The protein structure prediction analysis indicated that the M protein might be a polyprotein of viral genome replication enzyme.     

猪流行性腹泻病毒S2基因B细胞表位嵌入型S-层蛋白在副干酪乳杆菌中的表达与鉴定

【目的】构建新型猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)乳酸菌活菌疫苗载体。【方法】应用DNA重组技术将嗜酸乳杆菌S-层蛋白(SLP)基因及PEDV S2基因B细胞表位(EpitopeS2)融合基因(SLP-EpitopeS2)克隆到乳酸杆菌表达载体pTRK892中,构建重组载体pTRK-SLP-EpitopeS2,通过电转化方法将重组质粒导入副干酪乳杆菌中,获得重组副干酪乳杆菌。分别用SDS-PAGE、Western blotting和免疫荧光试验(IFA)鉴定目的蛋白在副干酪乳杆菌中的表达。【结果】PCR结果显示,成功扩增出大小为1 400 bp的目的条带,与插入融合基因大小一致,双酶切结果出现大小分别为1 400和4 700 bp的2条带,基因测序结果显示无碱基缺失和突变等,从而确定重组质粒pTRK-SLP-EpitopeS2构建正确。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,在48 ku处出现与理论值大小一致的目的蛋白条带,表明融合基因SLP-EpitopeS2在副干酪乳杆菌中得到有效表达。IFA结果显示,...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a(+)原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验(IFA)检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-...     

河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。