绵羊miR-127/FOXO4反馈环路及其对卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响

旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共（或单独）转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体（miR-127 mimic/mimic NC）转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127（FOXO4）及凋亡基因（Casp3、Bax及BCL2）的表达水平。过表达转录因子FOXO4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性（P<0.05）和oar-miR-127表达水平（P<0.05）;miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOXO4缺失/突变型重组质粒的细胞（P<0.05）。转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低（P<0.05）,Casp3和Bax基因表达水平极显著升高（P<0.001）;过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化（P>0.05）,但BCL2相对表达量显著降低（P<0.05）。本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOXO4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础。     

miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响

旨在探究miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响及作用机制.本研究选取健康的3～4月龄大足黑山羊母羊,收集卵巢颗粒细胞,利用miR-495-3p模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)构建过表达和抑制模型,通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期,ELISA分析颗粒细胞的雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌,采...     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用

旨在探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的影响。本试验收集180日龄健康母猪的卵巢组织,每次试验取20对卵巢进行颗粒细胞的分离培养,将miR-24-3p的mimics及inhibitor转染进颗粒细胞,通过ELISA、RT-qPCR、Western blot、双荧光素酶报告试验等技术探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用。结果表明,过表达miR-24-3p可显著促进雌二醇的合成(P<0.01),并加快StAR、CYP19A1和CYP11A1的转录和翻译(P<0.05);而干扰miR-24-3p则显著抑制雌二醇的合成(P<0.05),并显著下调CYP11A1、CYP19A1的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。进一步研究发现,TOP1是miR-24-3p的直接靶基因,过表达miR-24-3p可显著抑制TOP1的表达(P<0.05),干扰miR-24-3p可显著上调TOP1的表达(P<0.05)。而过表达TOP1则可减弱miR-24-3p对颗粒细胞雌二醇合成的促进作用(P<0.05)。综上所述,miR-24-3p通过靶向TOP1...     

miR-18a通过靶向结合CTGF调控猪颗粒细胞凋亡

为探究miR-18a对猪卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用,利用生物信息学分析、荧光素酶活性检测和体外培养颗粒细胞试验验证miR-18a对CTGF的靶向作用及其在猪颗粒细胞中对CTGF基因表达的影响,并通过流式细胞技术检测其对猪卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用。生物信息学分析结果表明,CTGF是miR-18a的潜在靶基因,荧光素酶活性检测进一步验证了miR-18a与CTGF的结合。在培养的颗粒细胞中转染miR-18a模拟物后,qRT-PCR和Western blot结果显示CTGF的mRNA和蛋白水平均显著降低,流式细胞技术检测表明miR-18a显著促进颗粒细胞的凋亡。而转染miR-18a抑制剂后,猪颗粒细胞的凋亡率显著降低,共转染miR-18a抑制剂和CTGF的干扰RNA后,颗粒细胞的凋亡率呈现回升。试验结果表明miR-18a通过靶向结合CTGF基因调控猪颗粒细胞的凋亡。     

ID3影响鸡卵泡发育与选择的分子机制

为探究DNA分化抑制因子3(ID3)影响卵泡选择的分子机制,试验观察比较了35周龄与75周龄京红1号蛋鸡卵泡形态、大小及数量差异,采用实时荧光定量PCR检测ID3在不同发育阶段卵泡中的表达,并通过CRISPRi技术与rhBMP2蛋白分别调控鸡小黄卵泡颗粒细胞中ID3的表达,检测卵泡选择相关基因卵泡刺激素受体（FSHR）与类固醇生成急性调节蛋白（StAR）相对表达量。结果显示：35周龄京红1号蛋鸡等级卵泡数目显著高于75周龄蛋鸡（P<0.05）;ID3在35周龄京红1号蛋鸡不同发育阶段卵泡中表达差异不显著（P>0.05）,但75周龄蛋Fx(F6/7)卵泡中ID3表达显著高于其他卵泡（P<0.05）,且75周龄蛋鸡的大白卵泡、小黄卵泡、Fx卵泡、F3卵泡、F1卵泡及卵巢基质中的ID3表达显著高于35周龄蛋鸡（P<0.05）;通过CRISPRi抑制ID3表达时,FSHR与StAR的表达会显著增加（P<0.05）;10、50、200 ng/mL rhBMP2能显著诱导ID3的表达（P<0.05）,FSHR与StAR的表达下降,但差异不显著。研究证实ID3与鸡...     

蛋鸭的产蛋机制及其营养调控

目前国内外关于蛋鸭产蛋机制、蛋鸭营养调控方面的研究均落后于养鸭生产的需要,相关的文献报道也比较少.本文将对国内外相关文献报道进行汇总,结合蛋鸡等产蛋机制方面的研究报道,重点综述蛋鸭的产蛋机制研究现状及营养调控措施.     

转染miR-106a对牦牛卵泡颗粒细胞增殖和激素分泌的影响

为探究miR-106a对牦牛卵泡颗粒细胞(GCs)增殖和激素分泌的影响,本试验通过体外分离培养牦牛卵泡GCs,分别转染miR-106a模拟物(miR-106a mimics)和miR-106a抑制剂(miR-106a inhibitors),利用CCK-8法检测GCs细胞增殖,ELISA法分别检测雌二醇(E₂)和孕酮(P₄)激素分泌情况。结果显示,与对照组相比,24、48、72和96 h时,miR-106a mimics组和miR-106a inhibitors组牦牛GCs的细胞增殖受到极显著抑制(P<0.01)。与对照组相比,GCs转染48 h时,miR-106a mimics组E₂分泌量极显著升高,而miR-106a inhibitors组E₂分泌量极显著降低(P<0.01);GCs转染72 h时,miR-106a mimics组和miR-106a inhibitors组E₂分泌量均极显著降低(P<0.01);GCs转染48 h时,miR-106a mim...     

miR-15a对猪卵泡颗粒细胞BDNF基因表达的影响

为探索miR-15a对猪卵泡发育的影响,选取健康大卵泡、中等卵泡和闭锁卵泡,研究不同卵泡中miR-15a的相对表达量以及其是否对卵巢颗粒细胞中有BDNF表达具有调节作用。分别抽取直径3-5 mm、大于5 mm健康卵泡和3-5 mm闭锁猪卵泡,采用q PCR检测发现闭锁卵泡中miR-15a表达显著升高。免疫组化结果显示中等健康卵泡颗粒细胞上BDNF、Tr KB均有表达,而在靠近卵泡腔的凋亡颗粒细胞BDNF免疫阳性反应较弱。分离培养猪卵巢颗粒细胞,过表达miR-15a能显著上调BDNF基因表达水平,Bcl-2基因表达有下降趋势但差异不显著;抑制miR-15a表达能显著抑制BDNF、bcl-2基因表达水平。Western-Blot结果发现,过表达miR-15a显著下调BDNF蛋白水平,而抑制miR-15a表达则能显著上调BDNF蛋白水平。实验结果显示miR-15a可能经由其靶基因BDNF参与猪卵泡的发育和闭锁。     

miR-145-5p靶向IGF1R介导AKT通路抑制猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化

旨在探讨miR-145-5p对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究采用qRT-PCR检测miR-145-5p的组织表达谱和发育性表达规律;选用1 d晋汾白猪趾长伸肌进行骨骼肌卫星细胞的分离与培养,分别转染miR-145-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics NC),miR-145-5p抑制剂(inhibitor)及其对照组(inhibitor NC),每个处理3个重复,利用qRT-PCR、EdU和CCK-8方法检测增殖相关基因表达量、EdU阳性细胞数和细胞增殖活性;待猪骨骼肌卫星细胞分化后利用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色方法探究分化相关基因mRNA和蛋白水平及肌管形成情况;采用双荧光素酶试验、qRT-PCR和Western blot探究miR-145-5p对下游IGF1R和AKT通路的影响。结果显示,miR-145-5p基因在肝和肺中表达量最高,心和皮下脂肪中次之(P<0.05);随着日龄的增加,miR-145-5p在猪背最长肌中的表达量持续升高(P<0.05)。在猪骨骼肌卫星细胞体外培养过程中,转染miR-145-5p mimi...     

笼养与平养蛋鸭蛋品质测定与相关性分析

试验旨在比较笼养和平养方式对不同品种蛋鸭蛋品质的影响,以期为评价不同饲养方式下的鸭蛋品质提供参考依据。随机选取40周龄笼养和平养的金定鸭（青壳蛋）和山麻鸭（白壳蛋）鸭蛋各30枚于产后24 h内进行蛋品质测定。结果表明,同一品种笼养蛋鸭蛋重极显著大于平养蛋鸭蛋重（P<0.01）,蛋重与蛋壳重、蛋白重和蛋黄重之间均存在极显著正相关（P<0.01）,但不同类型鸭蛋的蛋黄重之间差异不显著（P>0.05）。青壳蛋的蛋壳强度显著高于白壳蛋（P<0.05）,笼养青壳蛋的蛋壳强度亦高于平养青壳蛋（P<0.05）。蛋的比重与蛋壳厚度呈极显著正相关（0.503,P<0.01）,与蛋壳强度的相关系数亦达到0.536（P<0.01）。4种类型鸭蛋的哈氏单位均达到72以上。虽然蛋白重与蛋黄重之间呈极显著正相关（P<0.01）,但蛋白重与蛋黄比率之间却呈极显著的负相关（P<0.01）。蛋的比重与蛋黄重和蛋黄比率之间亦存在显著负相关（P<0.05）。以上结果表明,就蛋品质而言,蛋鸭养殖以采用笼养模式、选择青壳蛋鸭品种为宜。     

Determination and Correlation Analysis on the Egg Quality of Egg-laying Ducks Reared in Cages and on Floor

The purpose of this test was to evaluate the egg quality from two breeds of ducks reared in cages and on floor.30 eggs were chosen from each type of eggs,which were from Jinding (green shell) and Shan Partridge ducks (white shell)at 40 weeks-old reared in cages and on floor for egg quality evaluation.The results showed that the egg weight of caged duck was extremely significantly larger than the floor duck (P<0.01) in the same breed,there were very significant positive correlations between the egg weight and eggshell weight,egg-white weight and egg yolk weight (P<0.01),but no significant difference among the egg yolk weights of different types of ducks (P>0.05).The shell strength of green egg was obviously higher than that of white shell eggs (P<0.05),and the shell strength of green egg from caged ducks was higher than that of the green egg ducks on floor.The correlation coefficients of the egg specific gravity and eggshell thickness,the specific gravity and eggshell strength were 0.503 (P<0.01) and 0.536 (P<0.01) respectively.Haugh units of four types of ducks all reached 72 or more.Although there was significant positive correlation between egg-white weight and egg yolk weight (P<0.01),significant negative correlation was existed between egg-white weight and egg yolk ratio (P<0.01).There were significant negative correlations between egg specific gravity and egg yolk weight (P<0.05) and egg yolk ratio (P<0.05).In conclusion,the mode of cage feeding and the breed with green shell were appropriate choices in laying-egg duck production for high egg quality.     

miR-193a在MDBK细胞中诱导细胞凋亡的研究

本试验旨在研究miR-193a在致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(cp BVDV)感染MDBK细胞过程中诱导细胞凋亡的分子机制。试验利用TargetScan和Microcosm Targets等生物信息学在线软件预测凋亡相关的miR-193a靶基因Bax,并利用双荧光素酶报告基因系统验证miR-193a的靶基因;用过表达miR-193a的慢病毒pre-miR-193a-lv和抑制miR-193a表达的慢病毒pre-miR-193a-inhibitor-lv分别侵染MDBK细胞,48 h后收集细胞,然后用实时荧光定量PCR、Western blotting和流式细胞仪检测凋亡通路中Bax的表达水平及MDBK细胞凋亡率。结果预测并验证了miR-193a的靶基因为Bax;双荧光素酶报告基因分析结果显示miR-193a能直接结合到Bax 3'UTR区域中的miRNA反应位点,并极显著下调Bax的表达水平(P<0.01);流式细胞仪检测凋亡率结果显示,感染pre-miR-193a-lv慢病毒的MDBK细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。结果表明miR-193a能直接靶向凋亡通路中Bax基因,从而促进凋亡的发生。     

蛋氨酸水平对开产期麻鸭产蛋性能、蛋品质及卵巢形态的影响

采用单因子随机分组试验设计,设6个蛋氨酸水平(0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%和0.50%),探讨不同蛋氨酸水平对开产期蛋鸭产蛋性能、蛋品质及卵巢形态的影响。试验选用115日龄龙岩山麻鸭1 188只,分为6组,每组6个重复,每重复33只鸭,产蛋率达到50%开始正式试验,产蛋率80%结束,试验期21 d。结果表明:各组间平均蛋重随着饲粮蛋氨酸水平的提高而增加,并且0.30%～0.50%组显著高于0.25%组(P<0.05);饲粮蛋氨酸水平对试鸭日产蛋重产生显著影响(P<0.05),且日产蛋重与蛋氨酸水平之间存在显著的二次曲线相关(P<0.05)。各组间试鸭产蛋率、料蛋比、蛋品质、卵泡和输卵管形态未有显著差异(P>0.05)。以日产蛋重为评价指标,依据二次曲线模型,开产期麻鸭饲粮适宜蛋氨酸水平为0.40%,日摄入量为560 mg/d。蛋氨酸对开产期麻鸭蛋品质及卵巢形态未产生显著影响。     

miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响

【目的】研究miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响及其在不同组织中的表达情况,为探究miRNA在肌肉发育中的调控机制提供理论基础。【方法】利用生物信息学方法预测miR-495-3p的靶基因;实时荧光定量PCR检测miR-495-3p及其靶基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌等组织中的表达水平。构建miR-495-3p的过表达(miR-495-3p mimic、miR-495-3p mimic NC)及抑制物(miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC),在山羊骨骼肌细胞汇合度达60%～70%时进行转染,并用含2%马血清的培养基进行诱导分化,用CCK-8检测细胞增殖活力,实时荧光定量PCR检测过表达和干扰效率及增殖分化相关基因配对盒基因(paired-box 7,Pax7)、细胞蛋白周期E(Cyclin E)、肌细胞生成素(myogenin, myoG)、生肌因子5(recombinant myogenic factor 5,Myf5)的表达;构建miR-495-3p靶基因的野生型和突变型载体并转染至293T细胞,用...     

抑制miR-142-3p对奶山羊化学诱导乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

【目的】探索miR-142-3p对奶山羊化学诱导乳腺上皮细胞(chemical induced mammary epithelial cells, CiMECs)体外泌乳功能的调节作用,旨在为促进转基因乳腺生物反应器的发展以及“培养皿奶”的商业化生产奠定基础和提供新的思路。【方法】选取奶山羊耳缘成纤维细胞(GEFs)为研究材料,经单一小分子化合物TGFβR-1/ALK5的抑制剂(RepSox)诱导8 d后,分别从细胞的形态变化、特异性标记物免疫荧光染色以及油红O染色对其进行鉴定。之后运用脂质体转染技术在诱导成功的奶山羊CiMECs中分别转染miR-142-3p的抑制物(miR-142-3p inhibitor)及抑制物对照(inhibitor-NC),不转染的细胞作为空白对照(BC),转染24 h后,采用实时荧光定量PCR检测miR-142-3p的表达水平,CCK-8法检测细胞的增殖率,Western blotting检测β-酪蛋白(β-casein)的表达量,甘油三酯酶法测定甘油三酯的含量。【结果】GEFs诱导8 d后形成岛屿状多核仁样的上皮样聚集;免疫荧光染色结果显示,诱导后的GE...     

miR-188对小鼠乳腺癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

【目的】探讨microRNA-188-5p(miR-188)在乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡过程中的调控作用,以期为乳腺癌相关治疗药物的研发提供理论依据。【方法】培养小鼠乳腺癌细胞(4T1),建立4T1细胞小鼠移植瘤模型,分离肿瘤组织和瘤旁组织,用实时荧光定量PCR法检测miR-188的表达情况;在4T1细胞中分别转染miR-188的模拟物(miR-188 mimics)、模拟物对照(mimics-NC)、miR-188抑制物(miR-188 inhibitor)及抑制物对照(inhibitor-NC),不转染的细胞为空白对照(Con),用实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-188的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖能力,细胞划痕试验检测细胞的迁移率,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western blotting检测细胞相关凋亡蛋白的表达情况。【结果】瘤旁组织中miR-188的相对表达量显著高于肿瘤组织(P<0.05);细胞转染结果表明,与Con组相比,miR-188 mimics组miR-188的相对表达量显著上调(P<0.05),而miR-188 inhibitor组显著...     

绵羊INHBB、SMAD4和FGF18基因的双荧光素酶载体构建及其与miR-370-3p的靶向验证

为研究绵羊输卵管功能相关的oar-miR-370-3p与抑制素亚基βB （inhibin subunit beta B,INHBB）、SMAD家族成员4（SMAD family member 4,SMAD4）和成纤维细胞生长因子18（fibroblast growth factor 18,FGF18）基因之间的靶向关系,本研究对多个物种（绵羊、人、小鼠、大鼠、猕猴、豚鼠和兔）中miR-370-3p的序列进行了比对,利用RNAhybrid程序预测绵羊miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR可能存在的结合位点,随后分别构建INHBB、SMAD4和FGF18基因3'UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics、mimics NC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。结果表明,绵羊miR-370-3p序列与其他6个物种不同,但具有一定的保守性。RNAhybrid程序预测到oar-miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR存在结合位点。PCR扩增结果和测序结果表明,INHBB、SMAD4和FGF18基因3'UTR的野生型和突变型载体构建成功。共转染INHBB、SMAD4和FGF18野生型载体和miR-370-3p mimics的双荧光素酶活性极显著或显著低于相应的对照组（P<0.01;P<0.05）;而3种突变型载体和miR-370-3p mimics共转染的双荧光素酶活性均与相应的对照组无显著差异（P>0.05）。表明INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR区域均能与miR-370-3p结合并抑制双荧光素酶活性,验证了INHBB、SMAD4和FGF18基因均是miR-370-3p的靶基因,为进一步研究oar-miR-370-3p影响绵羊输卵管功能与绵羊繁殖力的分子机制提供依据。     

ω-3PUFA在蛋黄中的富集效应及对蛋品质的影响

试验共设4个组,对照组含3%菜油,试验组分别含2%菜油+1%鱼油、1%菜油+2%鱼油和3%鱼油,研究日粮不同水平ω-3PUFA在蛋黄中的富集效应及对蛋品质的影响。各试验组ω-3PUFA在蛋黄中的沉积量随鱼油添加时间延长而显著提高(P<0.01),第8周ALA、EPA和DHA沉积量分别达到2.96%、3.2%和2.9%,以2%鱼油添加组升高幅度最大。蛋黄中TC含量下降,第8周各组蛋黄中胆固醇含量比第2周分别降低2.30%、4.38%、1.24%和1.88%,同期各组内差异不显著。各试验组蛋黄TG含量变化不大,MDA含量均不同程度有所提高。此外,添加鱼油提高了蛋壳强度和蛋壳厚度,蛋重下降。