猪NMB基因过表达载体的构建及其在猪睾丸间质细胞中的表达

为了构建猪神经介素B(pNMB)基因慢病毒过表达载体,以及研究其在猪睾丸间质细胞中稳定表达情况,试验采用RT-PCR方法扩增获得pNMB基因的CDS序列,插入到pMD-19T载体中,构建pMD19-T-pNMB重组质粒,对该重组质粒和慢病毒过表达质粒pCD513B-1进行双酶切,以获得的线性化pCD513B-1和线性化pNMB质粒构建pCD513B-1-pNMB重组慢病毒过表达载体;将重组慢病毒过表达载体pCD513B-1-pNMB和辅助质粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)共转染至HEK293T细胞中,包装获得pNMB过表达慢病毒,并用倍比稀释法测定病毒含量;用pNMB过表达慢病毒转染猪睾丸间质细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达的细胞,利用实时荧光定量PCR方法检测pNMB mRNA的表达情况。结果表明：RT-PCR扩增获得大小约为366 bp的目的片段,与GenBank中pNMB基因的CDS序列完全一致,RT-PCR扩增片段与目的片段序列完全相同;将pNMB基因克隆到pMD-19T载体中,成功构建出pMD19-T-pNMB重组质粒;XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒p...     

山羊ATF6基因重组慢病毒干扰载体的构建及鉴定

为了研究ATF6通路介导的山羊胎盘滋养层细胞(goat trophoblast cell,GTC)凋亡的作用机制,需要构建激活转录因子6(ATF6)基因慢病毒干扰载体用于试验。采用RNA干扰技术,设计合成以山羊ATF6基因CDS区为靶点的shRNA,构建重组慢病毒载体、慢病毒包装、慢病毒转染、RT-qPCR和Western blot等方法,筛选出干扰效率达60%的shRNA干扰片段,构建出可用于今后ATF6通路相关研究的重组慢病病毒干扰载体,为山羊妊娠相关研究提供材料。     

神经介素B研究进展

神经介素B(neuromedine B,NMB)是1983年从猪脊髓提纯分离的一种神经肽,含10个氨基酸,大分子肽含32个氨基酸,属于蛙肽家族,为铃蟾肽相关肽。NMB通过其受体发挥生物学作用,铃蟾肽受体家族有3～4种(BB1、BB2、BRS-3、BB4或BRS-3.5),NMB优先受体是BB1(NBM-R),与其他受体的亲和力较低。NMB及其受体在中枢神经系统和外周组织广泛分布,具有多种生物学作用,包括刺激平滑肌收缩,改变胃肠道的运动性,抑制垂体促甲状腺素的释放;参与摄食和体温调节,介导应激和恐惧反应,影响行为和记忆,促进肿瘤生长等。     

神经介素B及其受体NMBR参与抗A型流感病毒H1N1亚型感染的信号通路

NMB/NMBR通过调节A型流感病毒（IAV/H1N1/PR8）感染诱导的细胞因子表达而参与抗IAV的先天性免疫反应。为探究其发挥抗IAV/H1N1感染的信号通路，本文用PR8和WSN毒株分别感染MLE-12细胞和小鼠，用NF-κB抑制剂BAY11-7028单独或联合NMB处理MLE-12细胞，小鼠后腿肌内注射NMB和NMBRA，采用RT-PCR和qRT-PCR分析NMB、NMBR、IL-6、IFN-α和NP基因表达变化，采用Western blot分析NMB、NMBR、P65/p-P65、IκBα和NP蛋白表达的变化。结果显示，BAY11-7028可促使PR8和WSN感染的MLE-12细胞中NMB、NMBR、IL-6和IFN-α基因表达水平均下降和NP基因表达水平上升，并降低NMB、NMBR和p-P65蛋白表达水平和提升IκBα和NP蛋白表达水平。然而，NMB联合BAY 11-7028诱导PR8或WSN感染后的细胞中IL-6和NP表达出现极显著下降和IFN-α显著上升。此外，NMB抑制PR8和WSN感染的小鼠肺组织内p-P65和NP蛋白表达水平和促进IκBα蛋白表达水平；NMBRA联合NMB抵消NMB对PR8或WSN感染后的这些蛋白表达水平的调节作用。综上表明，NMB/NMBR通过调节PR8和WSN感染的MLE-12细胞和小鼠体内的NF-κB信号通路上P65蛋白磷酸化和IκBα的表达，进而影响下游细胞因子IL-6和IFN-α基因的表达，从而发挥抗IAV/H1N1感染的先天性免疫应答反应。     

猴B病毒gB基因杆状病毒表达载体的构建

根据B病毒E2490株(基因序列AF533768)人工合成猴B病毒gB基因,通过XbaI和EcoRI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切及测序鉴定,表明构建了猴B病毒gB基因杆状病毒表达重组质粒pFastHTA-gB。在此基础上,重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经平板抗性筛选,PCR鉴定,表明获得了转座的杆粒,为下一步进行昆虫细胞的转染和以猴B病毒gB蛋白为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。     

鸡gga-miR-199a慢病毒表达系统的构建

为建立一种稳定持续表达鸡gga-miR-199a的系统,将从鸡DF-1细胞扩增到的gga-miR-199a前体序列克隆入pLL3.7慢病毒载体质粒中用以包装慢病毒。同时构建了更换pLL3.7质粒中鼠源U6启动子更换为鸡源及人源U6启动子的pLL3.7慢病毒载体质粒;将其与慢病毒包装辅助质粒共转至HEK293T细胞中,收集浓缩病毒颗粒并侵染细胞并获得过表达gga-miR-199a的单细胞克隆。提取单细胞克隆总RNA进行gga-miR-199a-5P的定量检测。结果表明,经慢病毒侵染后的细胞中鸡gga-miR-199a表达量显著提高,且人源U6启动子的转录效率最高,该研究成功建立了一种稳定持续表达鸡gga-miR-199a的慢病毒系统,说明该系统有利于在鸡活体或原代细胞中开展miRNA功能的研究。     

小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒的构建与鉴定

本研究旨在构建Zbtb38（zinc finger and BTB domain containing 38）基因慢病毒过表达质粒载体。以小鼠脊髓组织为材料,采用重叠延伸PCR方法扩增小鼠Zbtb38基因的CDS序列,分别设计Zbtb38 CDS序列前段扩增引物1和后段扩增引物2,再以上述两对引物的扩增产物作为模板,设计引物3并进行融合PCR扩增,由此得到Zbtb38 CDS全序列。将获得的Zbtb38基因CDS全序列连接到质粒pGM-T,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用直接PCR鉴定阳性克隆并进行测序验证。利用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切方法将Zbtb38 CDS序列连接至慢病毒载体Plvx-puro,获得穿梭质粒Plvx-puro-Zbtb38,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生产慢病毒颗粒。结果显示,引物1扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1-1 794 bp,扩增产物实际测序长度为1 772 bp,引物2扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1 762-3 594 bp,扩增产物实际测序长度为1 818 bp,说明分段扩增目的片段已成功。引物3扩增的预期融合产物及菌落PCR扩增产物均包含Zbtb38 CDS全序列（3 594 bp）,与NCBI数据库Zbtb38基因的CDS序列比对后的重合率达99.99%,表明Zbtb38 CDS序列扩增成功。实时荧光定量PCR检测结果显示,病毒滴度达3.25×10⁸ Tu/mL,达到普通动物注射标准要求,提示慢病毒载体构建成功。综上所述,本试验成功构建了小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒载体。     

绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。     

猪MEF2C基因慢病毒表达载体构建及C2C12细胞转染条件的优化

MEF2C基因能够控制肌细胞分化过程中的基因转录,特别在骨骼肌、心肌和平滑肌中介导细胞的分化。本研究将猪 MEF2C 基因化学合成后经 Bam HI 和 Asc I 双酶切后克隆到慢病毒表达载体 pLen-ti6.3_MCS_IRES2-EGFP中,获得的重组质粒用限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;利用慢病毒阴性对照侵染靶细胞C2C12来确定最佳MOI值以及靶细胞最适抗生素Blasticidin剂量。结果显示猪MEF2C基因成功克隆到慢病毒表达载体中;该重组质粒侵染靶细胞C2C12的最佳MOI值为300;靶细胞抗生素的筛选剂量为4μg/mL,维持剂量为3μg/mL上述试验为建立MEF2C稳定过表达细胞系提供了前期工作基础。     

家兔DEPTOR基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与验证

为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体,并验证载体的有效性,试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区(CDS)序列,得到DEPTOR基因片段,同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上,获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上,获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法,将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明：...     

猪生长激素促分泌素受体基因真核表达载体的构建及鉴定简

本试验旨在构建猪生长激素促分泌素受体（pGHS-R）真核表达系统,并瞬时转染人源胚胎肾细胞（HEK293T）观察其表达情况。以猪基因组为模板,通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应（SOE-PCR）克隆出pGHS-R的编码区序列,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/pGHS-R,酶切鉴定并测序,加myc标签,瞬时转染HEK293T细胞,用Western blotting鉴定该重组质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的蛋白。结果显示,本试验成功扩增出pGHS-R编码序列,酶切和测序结果表明pcDNA3.1(+)-myc/pGHS-R构建正确,Western blotting方法证实转染的该质粒能在HEK293T细胞中正确表达目的蛋白。结果表明,本试验成功构建了pGHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础。     

干扰和过表达BAMBI基因对猪卵泡颗粒细胞表型和功能的影响

为研究转化生长因子-β（TGF-β）信号通路中的骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂（bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor,BAMBI）基因对猪卵泡颗粒细胞的调控作用,本研究设计构建BAMBI干扰和过表达载体,并将构建好的干扰（pSIREN-BAMBI-sh1、pSIREN-BAMBI-sh2、pSIREN-BAMBI-sh3）和过表达（pcDNA3.1-BAMBI）重组质粒转染猪卵泡颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR技术进行有效片段的筛选,并对TGF-β信号通路下游基因（TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5）和细胞凋亡基因（Bax、Bcl-2）mRNA的表达水平进行检测。最后,用MTT法和流式细胞术检测BAMBI干扰和过表达对卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响。结果表明,BAMBI干扰和过表达载体成功构建,pSIREN-BAMBI-sh2抑制BAMBI表达的效果最好,干扰效率最高。干扰BAMBI时,TGF-βRⅡ表达量显著上升（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著上升（P<0.05）;过表达BAMBI时,TGF-βRⅡ表达显著下降（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著下降（P<0.05）;上调BAMBI可显著抑制猪卵泡颗粒细胞增殖,极显著促进猪卵泡颗粒细胞凋亡（P<0.01）。研究结果表明,BAMBI基因显著影响猪卵泡颗粒细胞的生长发育,可能通过调节TGF-β信号通路间接影响猪的繁殖性能。     

神经调节肽U的研究进展

神经调节肽U(neurom ed in U,NMU)是一种结构上高度保守的神经肽,广泛分布在下丘脑、垂体、胃肠道以及泌尿生殖系统,具有刺激平滑肌收缩、抑制摄食、调节能量平衡、抑制胃酸分泌、延缓胃排空和参与下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节等多种功能,对肠道离子转运、局部血流和血压的调节甚至对疼痛和免疫调控等都有作用。作者就其主要功能和部分作用机制的研究进展作一综述。     

Construction and Identification of Lentiviral Overexpression Plasmid of Mouse Zbtb38 Gene

This study was conducted to construct zinc finger and BTB domain containing 38 (Zbtb38) gene lentiviral overexpression plasmid vector.Firstly,the CDS sequence of mouse Zbtb38 gene was amplified by overlap extension PCR method using mouse spinal cord tissue,and the Zbtb38 CDS sequence front amplification primer 1 and the latter amplification primer 2 were designed respectively.Using the amplification products of the above two primers as template,primer 3 was designed and subjected to fusion PCR amplification,thereby obtaining the full CDS sequence of Zbtb38.Then,the obtained Zbtb38 gene CDS full sequence was ligated to the plasmid pGM-T,and the recombinant plasmid was transferred into E.coli DH5α competent cells,the positive clones were identified and verified by direct PCR and sequencing.Finally,the Zbtb38 CDS sequence was ligated into the lentiviral vector Plvx-puro by XhoⅠ and BamHⅠ double digestion to obtain the shuttle plasmid Plvx-puro-Zbtb38,which was co-transfected with lentiviral packaging plasmids to produce lentiviral particles in 293T cells.The results showed that the primer 1 amplification product contained the first 1-1 794 bp of the Zbtb38 CDS sequence,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 772 bp.The primer 2 amplification product contained the 1 762-3 594 bp of the entire sequence of Zbtb38 CDS,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 818 bp,indicating that the fragmented amplification target fragment was successfully obtained.The expected fusion products amplified by primer 3 and the PCR amplification products of the colonies both contained the complete sequence of Zbtb38 CDS (3 594 bp),which was compared with the CDS sequence of Zbtb38 gene in NCBI database,and the coincidence rate was 99.99%,indicating that the Zbtb38 CDS sequence was successfully amplified.The Real-time PCR results showed that the virus titer reached 3.25×10⁸ Tu/mL,which met the experimental animal injection standard requirement,indicating that the lentiviral vector was successfully constructed.In summary,the mouse Zbtb38 gene lentiviral overexpression plasmid vector was successfully constructed in this experiment.     

Beclin-1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对B16F10细胞自噬及活力的影响

利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系，分析稳转细胞系的自噬水平和活力，为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体，转染至293T细胞，获得慢病毒颗粒，将病毒颗粒感染B16F10细胞，通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果，Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况，CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明，成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA，纯化的慢病毒滴度为1×10⁸ TU·mL^-1，建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制，mRNA的沉默效率约为75%（P<0.01），发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量，降低B16F10细胞活力。以上结果表明，干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性，促进B16F10细胞死亡，这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。     

褪黑激素受体1B及其基因的研究进展

褪黑激素通过与药理学特异性的高亲和性G-蛋白耦联受体相结合来发挥其生物学功能。作者介绍了褪黑激素受体1B的结构和功能,褪黑激素受体1B基因的克隆及基因结构、发育性表达与作用、定位与多态性,并讨论了该基因与繁殖季节性的关系。     

人雄激素受体的雄激素结合区cDNA在E.coli中的高效表达

将编码人雄激素受体（ｈＡＲ）的雄素结合区（ＬＢＤ）的ｃＤＮＡ片段（１００５ｂｐ）克隆到由Ｐ１启动子控制的硫氧还蛋白表达载体ｐＴｒｘＦｕｓ上,构建了表达质粒ｐＴｒｘＡＲ,并转化到大肠杆菌Ｇ１７２４中,经色氨酸诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一高效表达的融合蛋白产物,此融合蛋白 分子了量与理论值相吻合,氨基酸组分分析证明了ＬＢＤ目的基因的表达。