猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律

为了解猪轮状病毒(PoRV)在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律,本试验利用MARC-145细胞,从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV,并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实,命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株48h后,分别收集病毒液进行定量分析;同时,以SC-R分离株感染MARC-145细胞,在感染后不同时间分别收集感染病毒液,利用PoRV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析,绘制PoRV生长曲线。结果表明,用含3%胰酶营养液培养的细胞液中PoRV的RNA含量明显高于其他组;一步生长曲线显示细胞外病毒RNA含量呈"S型"曲线增长,感染后0⁸h为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;88h为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;8³6h为突破期,病毒RNA含量呈对数增长;感染48h增长速度减缓,维持在较高水平,逐步进入稳定期。胰酶可增加PoRV对细胞的感染性,3%是本试验最为适用的胰酶浓度;PoRV感染MARC-145后在细胞内增殖并逐步释到细胞外。     

猪轮状病毒的分离与鉴定

将疑似感染猪轮状病毒的内蒙古某猪场的腹泻仔猪粪便样品在MA104细胞上分离培养,得到一株能产生明显细胞病变的毒株(命名为PRV L1株).经纯净性检测,该毒株无菌生长、无支原体污染及外源病毒污染.特异性检测结果显示该PRV L1株能被猪轮状病毒单特异性血清中和,并可被猪轮状病毒单克隆抗体识别,其VP7基因序列与G5型猪轮状病毒VP7基因序列同源性为99％.动物回归试验结果表明,该毒株口服攻击3日龄仔猪,可引起典型的猪轮状病毒病发病症状,并能在发病仔猪小肠内容物中检测到猪轮状病毒.     

猪轮状病毒分离与鉴定

采用MA104细胞从广东省某猪场患有明显腹泻症状的仔猪粪便中分离了1株产生明显细胞病变(CPE)的病毒。电镜观察显示,病毒粒子呈现较为典型的轮状病毒的形态特征;对其VP6基因进行序列分析,结果表明该分离株与A群猪轮状病毒代表株OSU和Gottfried的核苷酸同源分别为86.3%和80.8%,氨基酸序列同源性分别为97.7%和93.2%。综合所见,所分离的毒株为A群猪轮状病毒。     

一株猪轮状病毒的分离与鉴定

将1份经RT-PCR检测猪轮状病毒阳性的临床腹泻粪样感染Vero细胞,连续盲传8代,出现病变,成功分离到1株病毒,经RT-PCR检验和电镜观察,鉴定该病毒为轮状病毒,命名为GD-01-2015。扩增该病毒的VP4和VP7基因进行分型和系统进化分析,结果发现,其VP4基因为P[7]型,与来自韩国的猪源毒株K71同源性达到99.8%;其VP7基因为G5型,与来自韩国的猪源毒株06-6-1同源性达到99.7%。由此可以推测GD-01-2015株与韩国猪源毒株有相似的进化来源。根据轮状病毒分类委员会(RCWG)提出的A群轮状病毒的最新分类方法,GD-01-2015株基因型为G5P[7]。本研究为监测轮状病毒的流行状况及其疫苗的研制提供了理论依据。     

猪A群轮状病毒BJ株的分离与鉴定

轮状病毒是引起幼龄动物和儿童病毒性腹泻的主要病原,轮状病毒的分离鉴定为该病的流行病学调查和分子生物学特性研究奠定了基础。本研究采集北京某猪场腹泻发病仔猪肠内容物,将其接种MA104细胞,分离得到一株能产生明显细胞病变的病毒。对分离毒株进行胶体金、实时荧光定量RT-PCR和免疫荧光等方法鉴定,并对分离毒株的VP4、VP6和VP7基因进行测序及序列分析。结果表明,分离毒株为猪A群轮状病毒。按照A群轮状病毒的最新分类方法,确定该分离株VP4、VP6和VP7基因的基因型分别为P[13]型、I5型和G11型。因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/BJ/2015/G11P[13]。     

猪轮状病毒的分离鉴定和全基因组序列分析

为了解广东省规模化猪场中猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的基因特征,本试验在广东省某猪场采集腹泻仔猪肠道组织样品,经实时荧光定量PCR(qPCR)进行病毒初步鉴定;分离获得病毒后,通过间接免疫荧光、电镜观察进一步鉴定,并对分离毒株进行全基因组高通量测序和遗传进化分析。结果显示,qPCR初步鉴定该腹泻仔猪病料为PoRV感染,从阳性病料中分离获得1株能引起典型细胞病变的毒株,在电镜下可观察到似车轮状的病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察有绿色荧光,将该PoRV分离毒株命名为GD2022,其完整基因型为G9-P[23]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1;基因遗传进化分析结果显示,GD2022为人轮状病毒、猪轮状病毒和狗轮状病毒基因组重组后的毒株。本试验结果丰富了PoRV基因组学和分子流行病学相关的研究资料,为轮状病毒防控提供了数据支持。     

猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律

为了解猪轮状病毒（PoRV）在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律,本试验利用MARC-145细胞,从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV,并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实,命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株48h后,分别收集病毒液进行定量分析;同时,以SC-R分离株感染MARC-145细胞,在感染后不同时间分别收集感染病毒液,利用PoRV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析,绘制PoRV生长曲线。结果表明,用含3％胰酶营养液培养的细胞液中PoRV的RNA含量明显高于其他组;-步生长曲线显示细胞外病毒RNA含量呈“s型”曲线增长,感染后0～8h为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;8～36h为突破期,病毒RNA含量呈对数增长;感染48h增长速度减缓,维持在较高水平,逐步进入稳定期。胰酶可增加PoRV对细胞的感染性,3％是本试验最为适用的胰酶浓度;PoRV感染MARC-145后在细胞内增殖并逐步释到细胞外。     

猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究

从吉林省某猪场发生腹泻的猪群粪便中,用MA-104细胞培养,分离到一株猪轮状病毒,盲传至4代,感染细胞出现明显病变,经电镜观察,见有典型的轮状病毒颗粒.其RNA电泳型为4:2:3:2型,属A群轮状病毒,同时对其蚀斑特性和血凝特性进行了初步研究,这株病毒被命名为JL94株.     

猪A群轮状病毒的分离与鉴定

目前国内对猪轮状病毒的研究较少,作者旨在对猪A群轮状病毒进行分离与鉴定,为后续猪轮状病毒致病机理和分子生物学特性研究奠定基础.用胰蛋白酶处理RT-PCR检测猪A群轮状病毒病原阳性的临床腹泻粪样,然后接种长成单层的MA-104细胞,进行病毒分离传代.再对分离毒株进行常规RT-PCR鉴定和电镜观察,并对分离毒株的VP6、VP7和VP8基因进行测序及序列分析.结果成功分离猪A群轮状病毒TM-a株,经序列同源性分析发现,与TM-a株VP6、VP7和VP8基因同源性最高的毒株分别为中国北京人源LL3354株、印度人源RMC321株和日本野猪源GUB-71株,其相似性为96.0％、95.1％和97.0％.该TM-a株轮状病毒不同基因表现出与人源轮状病毒和猪源轮状病毒的高度同源性,推测猪A群轮状病毒可能在人畜间传播,发生基因重组现象.     

猪A群轮状病毒SCJY-13株的分离鉴定及致病性分析

【目的】 在从腹泻仔猪粪便中分离鉴定猪A群轮状病毒(Rotavirus group A, RVA)并了解其致病性。【方法】 应用MA-104细胞从仔猪腹泻粪便中分离鉴定RVA, 将其经口感染健康初生仔猪, 观察其临床症状, 并利用实时荧光定量PCR检测排毒、HE染色观察病理变化、免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)试验了解病毒分布。【结果】 分离到1株可引起MA-104细胞明显细胞病变的G9P[23] RVA, 命名为RVA/Pig-tc/CHN/SCJY-13/2017/G9P[23](简称SCJY-13株), 病毒滴度为10^5.5 TCID₅₀/100 μL。经口感染SCJY-13株的仔猪在感染后11 h出现腹泻, 持续到感染后165 h完全恢复, 其发病率为100%(7/7), 病死率为28.57%(2/7)。感染后8 h可从仔猪肛拭子检测到病毒核酸, 直至感染后192 h, 峰值出现在感染后24 h。感染后54 h各段小肠病毒载量达到最高, 其中回肠中病毒载量最高, 显著高于十二指肠、空肠(P<0.05);HE染色和IHC检测结果显示, SCJY-13在感染仔猪小肠的绒毛及隐窝中大量聚集, 尤其是回肠段; SCJY-13株感染引起十二指肠、空肠和回肠绒毛固有层大量淋巴细胞浸润、黏膜上皮细胞和肠绒毛尖端空泡变性、柱状细胞增多、绒毛断裂脱落等, 以回肠段较严重。【结论】 SCJY-13株能引起新生仔猪100%发病, 其主要靶位区在回肠, 感染后排毒时间长。本试验结果为猪RVA的致病性研究提供了一定的参考依据。     

Isolation and Identification of Porcine Group A Rotavirus BJ Strain

Rotavirus infections are a major cause of viral diarrheas in young animals and children. Isolation and identification of rotavirus make a contribution to epidemiological survey and molecular biology study.A strain of porcine rotavirus was isolated in MA104 cell cultures from the intestinal contents of piglets with diarrhea in Beijing.The virus was identified to be porcine rotavirus by immunochromatography strip test, Real-time RT-PCR, immunofluorescence test and sequencing analysis.According to the sequence analysis, the virus was classified as group A porcine rotavirus, the genotype of VP4, VP6 and VP7 genes belonged to P[13], I5 and G11, respectively.The virus was designated Rotavirus A pig/China/BJ/2015/G11P[13].     

猪δ冠状病毒HeN10株的分离鉴定及致病性研究

本研究旨在获得猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）地方分离株,并对其生物学特性和致病性进行初步研究。使用猪睾丸（ST）细胞分离来自河南某猪场PDCoV阳性病料中的病毒,并通过观察细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）、反转录PCR、间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay,IFA）、电镜观察、S基因序列分析等方法进行鉴定,同时评价分离毒株在仔猪上的致病性。结果显示,阳性病料接种ST细胞后,病毒稳定增殖并连续传代至第10代;自第4代开始,感染细胞发生CPE,呈圆缩、拉网、碎裂、脱落状态;IFA鉴定为PDCoV阳性,且电镜观察可见带有刺突的冠状病毒粒子。将分离到的PDCoV命名为HeN10,其S基因序列与中国SD株相似性最高,达99.8%,与国内报道毒株CHN-JS-2017株和CHN-HeB1-2017株等处于同一分支。将HeN10株以5×10^6.3 TCID₅₀/头的剂量口服感染5头10日龄健康易感仔猪,可导致所有感染仔猪发生水样腹泻。本研究成功分离了PDCoV HeN10株,其与SD株等国内流行毒株处于同一分支,攻毒后可引起仔猪典型腹泻症状,可为下一步诊断方法及疫苗相关研究奠定一定的基础。     

牛A群轮状病毒G10型XJ-2022株分离鉴定及基因型分析

【目的】 试验旨在对新疆某规模牛场患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定及基因型分析。【方法】 采用抗原诊断试剂盒方法对在新疆某牛场随机采集的15份腹泻犊牛粪便样品进行检测,对抗原检测结果为阳性的样品进行反复冻融和过滤处理,然后将样品接种于Marc-145细胞进行病毒的分离和传代。对分离毒株进行间接免疫荧光试验（IFA）和负染电镜观察进一步确定病原。对分离株的VP6和VP7基因进行PCR扩增测序,并对其进行基因相似性比对和进化树分析。【结果】 抗原诊断试剂盒结果显示,3份粪便样品呈牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）抗原阳性。将阳性粪便样品分别接种于Marc-145细胞,仅有1份样品连续盲传至第9代出现明显的细胞病变效应（CPE）。IFA结果显示,接种该分离株的Marc-145细胞有亮绿色荧光,对照组未见荧光。电镜观察可见约65 nm的圆形病毒粒子,并命名为XJ-2022株。经PCR扩增获得VP6和VP7基因的目的条带,长度分别为1 356和342 bp。基因相似性比对和遗传进化分析表明,VP6基因与人源A群轮状病毒参考株DB2015-066（LC367318.1）相似性最高且遗传进化亲缘关系最近;VP7基因与牛源G10轮状病毒参考株XJX2（MN937506.1）相似性最高,遗传进化亲缘关系最近,确定该分离株为A群G10型轮状病毒。【结论】 试验成功分离到基因型为A群G10型BRV XJ-2022株,该毒株为新疆地区首次发现的多宿主来源的基因重配病毒。     

猪轮状病毒VP4基因重组腺病毒的构建及抗体水平评价

【目的】构建猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列（登录号：MH898990.1）合成PoRV VP4基因,将得到的目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV进行重组,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-VP4;腺病毒穿梭载体经过Pme Ⅰ内切酶线性化处理后与含有腺病毒骨架pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组获得重组质粒pAd-VP4,对重组质粒进行Pac Ⅰ酶切鉴定,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将重组质粒转染HEK293A细胞获得重组腺病毒rAd-VP4,对该重组腺病毒进行扩大培养并测定重组腺病毒的半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）;通过RT-PCR检测其体外表达情况,Western blotting检测其反应原性;将制备的重组腺病毒用不同病毒滴度和不同免疫次数对小鼠进行腹腔免疫,收集血清通过ELISA法测定IgG抗体水平。【结果】RT-PCR扩增出1条大小为2 343 bp的rAd-VP4重组腺病毒条带,测序结果正确,表明重组腺病毒rAd-VP4构建成功,测得rAd-VP4病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀,Western blotting结果表明,重组腺病毒rAd-VP4在蛋白水平上得到了正确表达,蛋白的分子质量约为87 ku。小鼠IgG抗体检测结果表明,在用10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4免疫后的第35和42天,小鼠血清中的IgG抗体水平显著高于10^5.3 TCID₅₀ TGE-PED-PRV三联活疫苗IgG抗体水平（P<0.05）;10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4在免疫后第35和42天产生的抗体水平显著高于10^5.5和10^4.5 TCID₅₀ rAd-VP4（P<0.05）,而10^5.5 TCID₅₀ rAd-VP4在免疫后第28天产生的抗体水平显著高于10^6.5和10^4.5 TCID₅₀ rAd-VP4（P<0.05）。10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4的2次免疫和3次免疫产生的IgG抗体在不同免疫时间均差异不显著（P>0.05）。【结论】本研究成功构建了重组腺病毒rAd-VP4,其病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀。10^6.5和10^5.5 TCID₅₀ rAd-VP4分别在第42和28天产生较高的IgG抗体水平,2次免疫和3次免疫对产生IgG抗体水平均无显著影响。试验结果可为开发PoRV重组腺病毒候选疫苗提供参考。     

鸡轮状病毒的分离鉴定及特性研究

用胰蛋白酶处理发病鸡的粪便和肠内容物，接种Marcl45细胞．盲传数代后．从山东不同地区发生流行性腹泻的鸡群中分离到1株病毒，并对分离病毒的生物学特性和理化特性进行了部分研究。结果表明病毒粒子呈轮状、大小为70～80nm；其病毒基因组的电泳图谱为5：1：3：2；病毒的TCID50为10^-4-19／0．1mL，能被轮状病毒阳性血清所中和；病毒对氯仿、乙醚有抵抗力；对pH3．0处理60min稳定；50℃ 30min能使其感染力下降10^2；1mol／L MgCl2不能增强其对50℃ 60min的抵抗力。接种2周龄SPF鸡．24h后陆续发病，表现为持续性水样腹泻；剖检可见病鸡脱水、小肠内有大量的液体和气泡、肠黏膜变薄；组织学变化表现为肠绒毛坏死、脱落．绒毛平均长度减少而隐窝深度增加，固有层中淋巴细胞浸润。其临床症状及病理组织学变化与自然发病相同。因此确定发生在山东鸡流行性腹泻的病原为A群轮状病毒，该研究为轮状病毒感染的防制提供了理论依据。     

鸡痘病毒FJ01株的分离鉴定

为调查福建规模化养鸡场病鸡的死亡原因,试验以福建省送检的鸡冠及头部皮肤有大量结节状痘痂的病鸡病料为研究对象进行了PCR鉴定。初步鉴定为鸡痘病毒（FWPV）株后,通过接种鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）分离病毒;用原代鸡胚成纤维细胞（CEF）和传代细胞DF-1细胞对病毒进行传代,观察该分离毒株在两种细胞上培养特性的异同;对被感染的CEF进行超薄切片观察病毒的分布及病毒粒子的形态;并针对该分离株的TK基因和FPV175基因序列进行同源性分析。结果显示,接种经抗生素处理后的病料匀浆液上清的CAM出现大面积单个白色隆起的痘斑,匀浆痘斑后同时接种CEF和DF-1细胞,两种细胞均能产生稳定可持续传代的细胞病变,但病变出现的时间及病变程度不同;透射电镜下观察到典型的FWPV粒子密集分布在CEF的胞浆中,清晰可见卵圆形外膜包裹着的两侧凹陷的核心。对其中23个病毒粒子进行统计测得病毒粒子的大小为（258~344） nm×（153~238） nm;针对FWPV TK基因和FPV175基因的PCR检测及测序结果与GenBank收录的FWPV（登录号：NC_002188.1）核苷酸序列同源性分别高达100%和99.8%。以上结果表明该分离毒株为FWPV,命名为FWPV-FJ01,为国内FWPV的防治提供了参考依据。     

犬腺病毒CAV-BJ02株的分离与鉴定

本研究旨在分离犬腺病毒（CAV）的北京地区流行株,采集北京地区某宠物医院2~4月龄发生咳嗽等呼吸道症状犬的鼻咽拭子,经胶体金和PCR检测,初筛为犬腺病毒阳性。经过处理后,将其处理液接种于MDCK细胞,进行连续传代培养,出现变圆、脱落、葡萄串样等特征性细胞病变。通过形态学观察、PCR鉴定及动物回归试验等方法对其进行鉴定。PCR扩增片段测序结果表明,该分离株为犬腺病毒Ⅱ型,遂将其命名为CAV-BJ02（GenBank：MN744708）株。用Reed-Muench法测得CAV-BJ02株的TCID₅₀为10^6.7·（100 μL）^-1。电镜下可清晰地观察到呈正六边形的二十面体、直径在86 nm左右的犬腺病毒颗粒。遗传进化分析结果表明,本株病毒为CAV-Ⅱ型。动物回归试验结果表明,CAV-BJ02株可引起犬发热等轻微临床症状,以口鼻分泌物为主要排毒方式,排毒期为5~6 d,不导致犬死亡。上述研究结果为深入了解北京地区CAV的流行情况,为犬腺病毒病的诊断、防治及后续相关研究奠定了理论基础。