禽腺病毒血清4型QHD2021株的分离鉴定和全基因序列分析

为了解河北秦皇岛地区禽腺病毒血清4型(FAdV-4)分离株的遗传变异情况和致病性,本试验对疑似患FAdV-4病死鸡的肝脏、心脏等组织进行PCR检测,将PCR检测为阳性的组织接种鸡肝癌细胞(LMH)进行病毒分离培养,对纯化后的FAdV-4进行全基因测序,对所得的序列进行同源性和遗传进化分析及致病性试验。结果表明：将PCR检测为FAdV-4阳性的肝脏、心脏匀浆于接种LMH细胞后72 h内出现明显细胞病变,初步确定分离毒株为FADV-4毒株,命名为FAdV-4 QHD2021株。全基因测序结果显示,QHD2021株全基因组全长44 225 bp,共编码14 741个氨基酸。与国外毒株相比短1 500 bp左右,但比国内毒株长约500 bp。同源性和遗传进化分析显示,QHD2021株与国内外FAdV-4流行毒株在同一支,与国内SD1601株的同源性最高,为94.3%。序列比对发现QHD2021株与国内流行株、国外经典株相比均出现1段1 966 bp的碱基缺失,包括ORF19、ORF27和ORF48的缺失。将经LMH细胞纯化的QHD2021株接种21日龄的SPF雏鸡后,可引起心包积液、肝炎等典型...     

禽腺病毒血清4型贵州株全基因序列分析

为了解禽腺病毒血清4型(FAdV-4)地方流行毒株的分子进化情况,基于实验室分离的2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株,分别对2株FAdV-4毒株进行PCR分段扩增,扩增产物克隆至载体,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后筛选出重组质粒进行测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,获得FAdV-4贵州株的全基因序列,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,通过PCR分段扩增成功获得了2株FAdV-4贵州株(GZ-BJ株和GZ-QL株)的全基因序列,长度分别为43352、43723 bp,FAdV-4 GZ-BJ株全基因序列长度比FAdV-4 GZ-QL株短371 bp,少6个ORF(22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF17、ORF28、ORF42),二者的氨基酸同源性为57.1%。2株FAdV-4贵州株同国内外不同地区FAdV-4毒株核苷酸同源性在88.7%~100%,与FAdV-4经典毒株ON1比对,2株FAdV-4贵州株和国内FAdV-4分离株均缺失ORF19、ORF27、ORF30。系统进化树分析显示,2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株仍属于Ⅰ群C种FAdV。研究结果表明,2株贵州株FAdV-4 GZ-BJ株和FAdV-4 GZ-QL株较国内外FAdV-4毒株均存在进化与突变,且FAdV-4 GZ-BJ株变化较大,但尚未改变其血清型,这为探索FAdV-4致病机理的分子机制研究提供依据。     

禽腺病毒血清4型贵州株全基因序列分析

为了解禽腺病毒血清4型（FAdV-4）地方流行毒株的分子进化情况,基于实验室分离的2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株,分别对2株FAdV-4毒株进行PCR分段扩增,扩增产物克隆至载体,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后筛选出重组质粒进行测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,获得FAdV-4贵州株的全基因序列,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,通过PCR分段扩增成功获得了2株FAdV-4贵州株（GZ-BJ株和GZ-QL株）的全基因序列,长度分别为43 352、43 723 bp,FAdV-4 GZ-BJ株全基因序列长度比FAdV-4 GZ-QL株短371 bp,少6个ORF（22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF17、ORF28、ORF42）,二者的氨基酸同源性为57.1%。2株FAdV-4贵州株同国内外不同地区FAdV-4毒株核苷酸同源性在88.7%~100%,与FAdV-4经典毒株ON1比对,2株FAdV-4贵州株和国内FAdV-4分离株均缺失ORF19、ORF27、ORF30。系统进化树分析显示,2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株仍属于Ⅰ群C种FAdV。研究结果表明,2株贵州株FAdV-4 GZ-BJ株和FAdV-4 GZ-QL株较国内外FAdV-4毒株均存在进化与突变,且FAdV-4 GZ-BJ株变化较大,但尚未改变其血清型,这为探索FAdV-4致病机理的分子机制研究提供依据。     

血清4型禽腺病毒广西分离株GX2019-010全基因组测序与分析

为了解广西地区血清4型禽腺病毒（FAdV-4）的基因特征,本研究对实验室前期分离的一株FAdV-4（命名为GX2019-010）进行了全基因组测序,对所获核苷酸序列进行同源性比对和遗传进化分析,并进一步分析了主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列。结果显示,GX2019-010全长43 719 bp,GC含量为54.9%,主要包括43个潜在蛋白质编码区域。核苷酸序列同源性比对发现,GX2019-010与致病株MX-SHP95的同源性为95.8%,与非致病株ON1和KR5同源性分别为95.0%和95.2%。遗传进化分析显示,GX2019-010与中国FAdV-4近几年的流行毒株在同一分支,而与国外FAdV-4毒株不在同一分支,说明FAdV-4存在遗传差异,主要的差异存在于基因组的右端,国内分离株均出现1 966 bp的缺失,其中包括ORF19、ORF48和ORF27基因的缺失,说明中国流行的FAdV-4具有地域性。对主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列分析发现,3个主要结构蛋白均有氨基酸位点的突变,其中Fiber-2的突变位点最多。本研究丰富了广西地区FAdV-4的基因库,为今后心包积液-肝炎综合征（HHS）的防控及流行病学调查研究提供了参考依据。     

禽腺病毒的分离鉴定及LMH细胞适应毒的生物学特性研究

为了对采集自北京平谷某养殖场发病鸡中出现心包积液综合征症状的病料进行病毒分离和鉴定,将病料接种LMH细胞进行病毒分离,并在LMH上连续传代,取C5和C15代细胞毒分别接种3周龄SPF鸡进行致病性试验。根据分离病毒在LMH上的CPE特征、病毒血清中和试验、Hexon基因序列比对分析、SPF鸡致病性回归试验,表明从发病鸡病料中分离的一株病毒为血清4型禽腺病毒;病毒在LMH细胞盲传3代后,就能很好地适应细胞培养,出现禽腺病毒典型的CPE;培养至第10代,病毒在接种后72 h,病毒含量即可达到107.4TCID50/0.1m L的峰值滴度;接种细胞毒的SPF鸡出现4型禽腺病毒导致的典型临床症状和特异性剖检病理变化,两组接种鸡的死亡率分别为100%和70%。结果表明,研究分离到的4型禽腺病毒毒株对SPF鸡具有高致死率,但病毒经过细胞连续传代后对鸡的致死率降低。     

禽腺病毒W株Hexon基因的分子特征及其致鸡胚侏儒化研究

从河南焦作某发生心包积液和肝肿大为病变特征的病鸡群采集肝脏组织,经分离、纯化、PCR鉴定和测序分析,确定病原为I群C种血清4型禽腺病毒(FAdV-4),命名为W株。该W株的ELD_(50)为10~(-3.576)/0.2 mL,Hexon基因全长2 814 bp,A、T、G、C碱基数和含量分别为654个(23.24%),514个(18.27%),679个(24.13%)和967个(34.36%)。Hexon基因编码蛋白的分子量为106.7 ku,共含有937个氨基酸,其中疏水氨基酸439个(46.80%),中性氨基酸265个(28.25%),亲水氨基酸233个(24.84%)。W株Hexon基因推导的氨基酸序列与FAdV-4 JSJ13株相比,在第181、939位2个氨基酸位点存在缺失;与FAdV-4 PK-01株相比,在第194、371、376位3个氨基酸位点存在突变;与FAdV-4 ON1株相比,有25个氨基酸位点存在突变。将W株经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚,与未接种病毒的对照组相比,接种W株病毒组在接种后第3天EE值均呈现显著性差异(P<0.05),第6天呈现极显著性差异(P<0.01),从而确定EE值和EE指数可以作为反映FAdV-4对鸡胚致侏儒作用的重要指标。     

2022年湖北Ⅰ群禽腺病毒流行病学调查及分离鉴定

禽腺病毒是全球家禽常见的传染病病原之一,目前对禽腺病毒进行流行病学调查,已给全球家禽业造成了巨大的经济损失。为了调查禽腺病毒在湖北地区的流行情况,在2021～2022年从湖北市场收集了224份鸡肝样本,为FAdV疫苗研制提供参考。基因测序结果显示：其中14株携带FAdV,Hexon L1环基因序列系统发育,12株为C型,2株为D型。在鸡肝癌细胞株（LMH）中培养并分离得到FAdV-11 HB200株,对分离物的Hexon基因进行了扩增和测序。遗传进化分析表明：FAdV-11 HB200与多个FAdV-11毒株处于同一分支。FAdV-C的流行率仍然占主导地位,相关部门应采取预防FAdV感染的措施。     

鸭腺病毒A型Hexon基因克隆与序列分析

为明确鸭腺病毒A型Hexon基因特征及其在腺病毒科病毒分类中的作用,本研究从前期分离鉴定的一株番鸭源鸭腺病毒A型分离株（JX2016株）中分段扩增获得其Hexon基因编码区。结果发现,鸭腺病毒A型JX2016株Hexon基因编码区为2 733 bp,编码910个氨基酸,与鸭腺病毒A型（FJ12025株）核苷酸同源性最高,达99.8%;与其他分离株Hexon基因核苷酸同源性均在99.4%以上;与鸭腺病毒2型（GR株,未明确分类地位）同源性仅为54.5%;与禽腺病毒A型Phelps株（鸡源）及P29株（鹅源）的核苷酸同源性分别为53.6%和55.2%。遗传进化树分析发现,所有鸭腺病毒A型分离株在遗传进化上均处于相同的亚分支,且与绵羊腺病毒D型（OAV287株）均处于富AT腺病毒属遗传进化分支。但鸭腺病毒2型（GR株）与禽腺病毒A型Phelps株（鸡源）、P29株（鹅源）却处于同一遗传进化分支,均属于禽腺病毒属遗传进化分支。基于Hexon蛋白的遗传进化分析,建议将鸭腺病毒A型重新命名为鸭源富AT腺病毒A型,将鸭腺病毒2型重新命名为鸭源禽腺病毒。     

高致病性禽腺病毒血清4型Hexon蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】原核表达禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)Hexon蛋白,并制备兔抗Hexon多克隆抗体,为FAdV-4 Hexon功能研究提供材料。【方法】采用基于PCR的长DNA序列准确合成(PCR-based accurate synthesis, PSA)方法,设计全长拼接引物,在引物两端各设计保护性碱基合成FAdV-4 Hexon基因;利用同源重组技术将其连接至pCzn1-Hexon表达载体,获得pCzn1-Hexon重组质粒进行原核表达,采用纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。以间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】重组原核表达质粒pCzn1-Hexon经双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组蛋白以包涵体的形式表达,分子质量约为41 ku;用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔后,通过间接ELISA方法检测抗体效价高达1∶512 000。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting和IFA检测到鸡肝...     

Cloning and Sequence Analysis of Hexon Gene of Duck Adenovirus A

In order to clarify the characteristics of the Hexon gene and the classification candidate of duck adenovirus A under the Adenoviridae family, the Hexon gene fragments of duck adenovirus A (designated as strain JX2016) were amplified. The results demonstrated that the cloned Hexon gene of duck adenovirus A (strain JX2016) was 2 733 bp in length, coding 910 amino acids. Nucleotide homology comparison showed that the strain JX2016 shared the highest nucleotide (99.8%) homology with reference strain FJ12025, also displayed higher than 99.4% nucleotide homology with other duck adenovirus A reference strains. However, the nucleotide homologies with strain GR (duck adenovirus 2, unclassified virus), Phelps (fowl adenovirus A) and P29 (goose adenovirus) were 54.5%, 53.6% and 55.2%, respectively. The genetic evolution analysis showed that all the duck adenovirus A strains were at the same subgroup, under the same Atadenovirus genus branch with ovine atadenovirus D (strain OAV287). Meanwhile, the duck adenovirus 2 (strain GR) at the same branch under Aviadenovirus genus branch with fowl adenovirus A (strain Phelps) and goose adenovirus (strain P29). Based on the Hexon protein genetic evolution analysis, we suggested renamed the duck adenovirus A as duck-origin atadenovirus and renamed the duck adenovirus 2 as duck-origin aviadenovirus.     

4株禽腺病毒hexon基因片段序列分析

目的验证购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（China Veterinary Culture Collection Center,CVCC）的4株禽腺病毒（FAdV-1 AV208、FAdV-4 AV211、FAdV-8 AV215、FAdV-11 AV218）的血清型。方法采用PCR的方法对4株FAdV hexon基因片段进行特异性扩增、克隆与测序,并与GenBank上公布的FAdV各血清型进行亲缘性分析。结果hexon基因片段核苷酸及其编码Hexon蛋白氨基酸亲源性分析结果表明,FAdV-1 AV208为禽腺病毒A血清1型;FAdV-4 AV211为禽腺病毒C中的血清4型;FAdV-8 AV215为禽腺病毒E中的血清8b型;FAdV-11 AV218为禽腺病毒C中的血清10型。结论FAdV-1 AV208、FAdV-4 AV211的血清型与CVCC标注一致;FAdV-8 AV215为FAdV-8b,相比CVCC该研究进一步细化了其血清型;而FAdV-11 AV218为FAdV-10,与CVCC标注的血清型不一致。该研究为今后正确使用CVCC标准毒株FAdV-8 AV215、FAdV-11 AV218提供了参考。     

表达禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白的重组耐热新城疫病毒的构建及免疫效果评估

【目的】 研究针对新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)的耐热基因工程疫苗。【方法】 利用反向遗传学操作技术将NDV耐热株的HN基因替换到LaSota疫苗株上, 再将禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)的Fiber2基因插入到其基因组上, 构建表达Fiber2蛋白的重组耐热NDV质粒pTS-HN-Fiber2。通过病毒拯救技术拯救重组NDV rTS-HN-Fiber2, 并测定其生物学特性和作为疫苗候选株的免疫原性和攻毒保护性。【结果】 rTS-HN-Fiber2的鸡胚平均致死时间>168 h, 且脑内接种致病指数为0, 属于弱毒的范畴; 在细胞上的生长曲线结果表明, rTS-HN-Fiber2与亲本LaSota株有相似的生长曲线, 但最终的生长滴度略低于LaSota株; rTS-HN-Fiber2在56 ℃处理15 min后, 病毒滴度下降约10³ TCID₅₀/mL, 而LaSota株56 ℃处理5 min几乎无感染性; 间接免疫荧光试验结果表明, rTS-HN-Fiber2能表达Fiber2蛋白。免疫和攻毒试验结果显示, rTS-HN-Fiber2能产生NDV抗体, 且能显著提高雏鸡在FAdV-4强毒下的存活率, 减轻FAdV-4强毒引起的组织病变, 降低组织中的病毒载量。【结论】 本研究成功构建了表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV, 该病毒保持了亲本LaSota株的弱毒生物学特性, 但热稳定性有显著提升; 重组NDV免疫雏鸡可产生针对NDV和FAdV-4强毒的保护, 该重组NDV可作为开发针对FAdV-4和NDV二联基因工程疫苗的候选病毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒云南株的分离鉴定及其ORF5基因遗传特性分析

用Marc145细胞从云南某猪场分离到两株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),将其命名为YN-1和YN-2。分离株在Marc145细胞上盲传4代后出现明显的细胞病变,其滴度为10^-3.6/0.1 mL。PCR方法对NSP2基因进行扩增结果表明,分离株缺失了90个核苷酸缺失,NSP2基因符合强毒特征。对分离株ORF5基因序列进行扩增和测序,进行同源性及遗传特性分析,结果表明,分离到的两株PRRSV位于进化树的同一个小分支上,其核苷酸同源性为99.5%,与山东株JN-HS、河南株Henan-1及越南株347-T-KSA位于同一个小分支上,其遗传距离较近,核苷酸同源性高达99.2%~99.8%,与国内经典毒株Ch-1a和VR-2332的核苷酸同源性仅为94.4%~94.5%,与国内其它强毒株的核苷酸同源性高达98%~99%,均属于强毒株。     

I群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立I群禽腺病毒4型血清学检测方法,本研究利用纯化的I群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了I群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法。结果显示,抗原最佳包被浓度为1 μg/mL;最佳封闭液为1%牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60min;最佳显色时间为10min。用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测。     

Whole-genome Sequencing and Analysis of Fowl Adenovirus Serotype 4 Strain GX2019-010 Isolated from Guangxi

To understand the genetic characteristics of fowl adenovirus serotype 4 (FAdV-4) in Guangxi region,the whole-genome sequencing were performed on a FAdV-4 strain GX2019-010 isolated from Guangxi in this study.Genome-wide nucleotide sequences were analyzed for homology alignment and genetic evolution,and the amino acid sequences of the major structural proteins Hexon,Penton and Fiber were further analyzed.The results showed that GX2019-010 had a full length of 43 719 bp and GC content of 54.9%,mainly including 43 potential protein coding regions.Genome-wide nucleotide homology comparisons revealed that GX2019-010 was 95.8% homologous to the pathogenic strain MX-SHP95,and 95.0% and 95.2% homologous to non-pathogenic strains ON1 and KR5,respectively.Genetic evolutionary analysis showed that GX2019-010 was in the same branch as the popular strains of FAdV-4 in China in recent years,but not in the same branch as the foreign strains of FAdV-4.This results indicated that there were genetic differences in FAdV-4.The main differences was at the right end of the genome and all domestic strains isolated in China were 1 966 bp missing including ORF19,ORF48 and ORF27 genes.It showed that FAdV-4 popular in China was territorial.Analysis of the amino acid sequences of the major structural proteins of Hexon,Penton and Fiber revealed that all of the three major structural proteins had mutations in amino acid sites,of which Fiber-2 had the most mutations.This study enriched the gene pool of FAdV-4 in Guangxi region and laid the foundation for future research on the prevention and control of HHS and epidemiological investigation.