表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌的构建及蛋白免疫原性分析

试验旨在构建能表达牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）E2抗原蛋白的重组乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）,为进一步研制BVDV乳酸菌口服活载体疫苗奠定基础。将BVDV E2基因克隆后测序,根据乳酸乳球菌的密码子偏嗜性进行优化,再将优化的基因片段插入表达载体pNZ8148中,并电转化乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞,构建重组乳酸菌pNZ8148-E2/NZ9000,经1 ng/mL乳链菌肽诱导表达后,对菌体物进行了SDS-PAGE和Western blotting分析。将重组乳酸菌pNZ8148-E2/NZ9000口服免疫6~12月龄健康犊牛,在免疫后不同时间点采集血液样品并分离血清,用间接ELISA方法检测抗体水平。结果显示,PCR扩增到了1 149 bp的目的片段,乳酸菌密码子偏嗜性优化后,GC含量从45.28%变为34.30%。重组质粒pNZ8148-E2经酶切鉴定插入片段与预期大小相符,在菌体裂解物中出现大小约42 ku的条带,与预期蛋白大小一致,且该蛋白可与BVDV E2抗体反应。在免疫犊牛的血清中检测到特异性抗BVDV E2蛋白的抗体。本研究结果表明,表达BVDV E2蛋白的重组乳酸菌口服免疫可诱导犊牛产生特异性的体液免疫反应,该重组菌具有较好的免疫原性。     

牛病毒性腹泻病毒E_0-E_2融合基因重组卡介苗的构建

为了增强重组卡介苗对牛病毒性腹泻黏膜病的免疫效果,本研究将敲除疏水氨基酸及密码子优化的E0基因与去除了C末端的疏水序列E2截短基因采用重叠延伸PCR的方法进行融合后,将其分别与p MV261/p MV361载体连接,电转化至卡介苗中,构建重组卡介苗。45℃热诱导重组卡介苗表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果证明E0-E2融合基因在卡介苗中成功表达,目的蛋白大小为66.5 ku,且具有反应原性。     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。     

牛病毒性腹泻病毒HB-bd毒株E2基因的克隆表达及免疫原性分析

为了研究牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的免疫原性,试验采用PCR技术扩增牛病毒性腹泻病毒HB-bd毒株去除跨膜区的E2基因,将获得的s E2基因克隆到p ET20b载体构建重组质粒p ET20bs E2,并转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞及诱导表达,应用SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA对表达产物进行分析,取纯化的表达产物加等量佐剂免疫家兔,观察免疫效果。结果表明:s E2基因得到了高效表达,表达的重组蛋白分子质量约为37.0 ku,表达产物能诱导免疫家兔产生高效价抗BVDV抗体。说明表达产物s E2蛋白具有良好的免疫原性。     

牛病毒性腹泻病毒间接ELISA方法的建立

持续性感染和免疫耐受是牛病毒性腹泻病的重要特征,也是该病的防控难点.本试验将2种生物型的牛病毒性腹泻病毒(BVDV):致细胞病变(CP)型(BVDV OregonC24株)和非致细胞病变(NCP)型(BVDV Yak株),灭活、浓缩作为抗原,分别免疫家兔制备高免血清.同时,使用BVDV全病毒蛋白作为包被原,建立了检测BVDV的间接ELISA检测方法.本试验利用该方法对高免血清进行检测,探讨CP型BVDV与NCP型BVDV抗原免疫原性差异.结果显示,CP型BVDV的高免血清效价均比NCP型BVDV高免血清的效价高,平均高35%.结果表明,CP型BVDV的免疫原性优于NCP型BVDV,且CP型BVDV与NCP型BVDV的血清效价具有明显差异.这为在实践中疫苗毒株筛选及生产提供了理论指导.     

牛胎儿组织中牛病毒性腹泻病毒50kDa假定受体的表达

牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）引起的疾病,统称为牛病毒性腹泻。ＢＶＤＶ是一种普遍存在的病毒,控制ＢＶＤＶ失败的原因之一是缺乏有关感染分子机制方面的资料,其中包括病毒－细胞间的相互作用。病毒和敏感细胞间的相互作用是病毒致病机制的一个重要因素。病毒－细胞相互作用的第一步是病毒吸附于宿主细胞的受体,这种相互作用通常决定了病毒的宿主范围。现已确定的病毒受体是细胞膜的正常组成成分,并经常起着生理学配基受体的功能。碳水化合物、脂类和蛋白质分子都能作为病毒的受体,多瘤病毒和正粘病毒结合于糖蛋白和糖酯的唾液酸－低…     

鹿源牛病毒性腹泻病毒敏感中药筛选的研究

为筛选鹿源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)敏感中药,试验采用组织细胞培养方法测试了4种中药在牛肾细胞(MDBK)体外培养中的最大安全浓度和对鹿源BVDV敏感性.结果表明:4种中药对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度分别是黄芪25、鱼腥草28、莪术油27、双黄连27;4种中药抗梅花鹿源BVDV作用由强到弱的顺序为莪术油、鱼腥草...     

牛病毒性腹泻病毒的分子生物学研究进展

牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）是导致牛腹泻的重要致病病毒之一,BVDV感染不仅能造成严重的临床症状,且可导致患畜的免疫力降低从而感染其他病原,致使患病动物的发病率和死亡率大大增加,给养牛业造成重大的损失。随着近年来分子生物学相关理论及技术不断发展,对于BVDV的研究逐渐深入,人们对该病毒的分子生物学方面有了一些新的了解,作者主要从BVDV的病毒粒子结构组成及功能、国内外的流行情况和BVDV基因的遗传与变异情况3个方面阐述近几年BVDV的分子生物学研究进展。     

牛病毒性腹泻病毒致病机理研究进展

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是危害养牛业的重要病原之一。BVDV感染能够引起广泛的临床症状，包括牛病毒性腹泻、粘膜病、持续感染与免疫耐受、繁殖障碍、血小板减少与出血综合征等，其相应的致病机理也非常复杂。持续感染是妊娠母畜在怀孕早期通过子宫内感染非致细胞病变（NCP)型BVDV引起的，是BVDV在自然环境中维持存在的一种重要形式。当持续感染动物再次感染抗原性相似或同源的致细胞病变（CP）型病毒时就会发生粘膜病。本文将粘膜病发生过程中CP型病毒的来源机制概括为五点：①外源细胞序列的插入；②病毒基因的重排和拷贝；③外源细胞序列插入同时伴有病毒基因的复制；④缺陷干扰粒子；⑤点突变。BVDV感染导致奶牛繁殖力下降的机制可能有两条：一是造成卵母细胞的质量下降，二是使性腺类固醇激素生成机制受到破坏，导致血浆中雌二醇、黄体酮等激素紊乱。血小板减少和出血性综合征是BVDV感染引起的又一重要临床症状，其致病机理主要有两种：①BVDV进入到外周循环，使外周循环中血小板受损程度增加，病理检查表现为血小板体积平均值较正常有明显增大；②BVDV感染造成骨髓生成血小板的能力下降，病理检查表现为血小板的体积平均值较正常减少。     

鹿源牛病毒性腹泻病毒敏感中药筛选的研究

为筛选鹿源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)敏感中药,试验采用组织细胞培养方法测试了4种中药在牛肾细胞(MDBK)体外培养中的最大安全浓度和对鹿源BVDV敏感性。结果表明:4种中药对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度分别是黄芪25、鱼腥草28、莪术油27、双黄连27;4种中药抗梅花鹿源BVDV作用由强到弱的顺序为莪术油、鱼腥草、黄芪、双黄连。     

牛病毒性腹泻病毒对新西兰白兔致病性分析及E2蛋白免疫效果的评价

【目的】 研究牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染对新西兰白兔的致病性以及BVDV E2重组蛋白的免疫效果。【方法】 将实验室培养保存的BVDV病毒纯化并按照Reed-Muench法测定其病毒滴度。在致病性试验中,将10只新西兰白兔随机分为感染组和对照组,每组5只。感染组用1 mL纯化的BVDV病毒攻毒（滴鼻500 μL、耳缘静脉注射500 μL）,对照组用等体积的生理盐水处理,连续3 d,每天1次,每天观察各组兔的临床症状并测量体温;分别于接种病毒后第6、9、12、15、17天通过耳缘静脉采集血液检测血常规;感染病毒第17天采集鼻拭子进行RT-PCR鉴定,采集后剖杀并采集气管、肺脏、脾脏和小肠组织,制备病理切片观察病理变化。在免疫效果评价试验中,将10只新西兰白兔随机分为免疫组和对照组,每组5只,免疫组用E2重组蛋白（1 mg/只）与佐剂混合后经肌内多点注射免疫新西兰白兔,对照组接种等体积生理盐水;共免疫2次,2次免疫间隔为14 d。在一免后0、7、14、21、28 d采集血清,通过间接ELISA方法检测血清中抗重组蛋白特异性抗体水平;在一免后第28天按致病性试验中方法攻毒,在攻毒第17天采集鼻拭子进行RT-PCR鉴定,采集气管、肺脏、脾脏和小肠组织制备病理切片观察病理变化及免疫组织化学检测。【结果】 纯化后BVDV的病毒滴度为4.16×10⁶ TCID₅₀/mL。与对照组相比,感染组部分新西兰白兔6 d内活动减少,采食略微减少,6 d后逐渐恢复正常,在感染第13天出现腹泻症状,从第5天开始体温略微升高,但均在正常范围内波动。与对照组相比,在攻毒第6和9天,感染组白细胞和血小板分别显著和极显著降低（P<0.05;P<0.01）;在攻毒第12、15和17天,感染组白细胞、血小板和淋巴细胞均极显著降低（P<0.01）。鼻拭子RT-PCR检测为阳性,气管、肺脏、脾脏及小肠组织表现出轻度至重度的组织病理学变化。间接ELISA检测结果表明,在一免后7 d时,血清抗体滴度为1：16~1：32;在一免后28 d时,血清抗体滴度为1：256~1：512;免疫攻毒组新西兰白兔鼻拭子经RT-PCR检测为阴性;组织病理学观察显示,免疫攻毒组气管及肺脏表现出轻微的组织病理学变化。免疫组化检测结果显示,免疫组结果均呈阴性,对照组结果均为阳性。【结论】 通过滴鼻及耳缘静脉注射BVDV的方式可以构建新西兰白兔致病模型,BVDV E2亚单位疫苗能够刺激机体产生特异性抗体,起到免疫防御的作用。     

牛病毒性腹泻病毒在绵羊垂直感染中的抗原分布

将新疆分离的病毒性腹泻病毒（BVDV）野毒株SHN－98和标准毒株Oregon C-24分别接种无BVDV感染的羔羊和怀孕100天左右的母羊，建立BVDV在绵羊垂直感染的动物模型，应用病毒抗原定位检测的免疫组化染色技术，探求BVDV在实验性感染绵羊经胎盘感染胚胎、羔羊过程中，病毒在感染组织、靶器官、靶细胞中的分布规律。结果表明：BVDV通过母羊的胎盘感染胚胎。BVDV在感染妊娠母羊体内主要分布于心肌、肝、肺、脾、淋巴结、胃肠粘膜、脑神经、子宫粘膜、胎盘等器官组织，其中以胃肠粘膜、脾、淋巴结、脑神经、子宫粘膜、胎盘等器官组织中分布量较多；BVDV在垂直感染胚胎体内主要分布于胸腺、淋巴结、脑、肝、肾、心肌、脾、肺、胃肠粘膜、脐带等器官组织，其中以胸腺、胃肠粘膜、脑神经等器官组织中分布量较多；BVDV在垂直感染羔羊体内主要分布于心、肾、胃肠粘膜、脾、胸腺、淋巴结、大脑、小脑、海马、视丘、视神经、眼球脉络膜等器官组织，其中以胃肠粘膜、大小脑、用、视神经、淋巴结等器官组织中分布较多，在组织分布中，BVDV对上皮细胞、神经胶质细胞、淋巴细胞有较强的亲嗜性，SHN－98和OregonC-24在垂直传播中组织器官的分布无明显差异。     

BVDV-E2截短基因重组卡介苗对牛的免疫效果评价

为评价牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对牛的免疫效果,将BVDV抗原抗体阴性牛随机分为rBCG-pMV361-E2-1(1 aa-297aa)、rBCG-pMV361-E2-2(1 aa-345 aa)、rBCG-pMV361-E2-3(1 aa-374 aa)、rBCG-pMV361-E2-4(45 aa-297 aa)、rBCG-pMV361-E2-5(45 aa-345 aa)、rBCG-pMV361-E2-6(45 aa-374 aa)、BVDV对照组、BCG对照组和PBS对照组,各组牛免疫相应疫苗后通过特异性抗体检测、淋巴细胞增殖试验、淋巴细胞亚群检测和细胞因子检测分析疫苗的免疫效果。结果显示,BVDV E2截短基因重组卡介苗均可诱导BVDV特异性抗体的产生,rBCG-pMV361-E2-1组抗体水平高于其他重组卡介苗试验组和BVDV对照组。淋巴细胞增殖试验结果显示,rBCG-pMV361-E2-2组SI为2.038±0.21,显著高于其他重组卡介苗试验组(P<0.01)。牛外周血CD4^+、CD8^+T淋巴细胞亚群检测结果显示,rBCG-pMV361-E2-5组牛外周血中CD4^+和CD8^+ T淋巴细胞亚群含量与PBS组比较,差异极显著(P<0.01)。IFN-γ检测结果显示,rBCG-pMV361-E2-1的IFN-γ水平显著高于其他试验组和对照组(P<0.01)。研究表明,rBCG-pMV361-E2-1可诱导接种牛产生较好的体液免疫应答,rBCG-pMV361-E2-1、rBCG-pMV361-E2-2和rBCG-pMV361-E2-5在诱导细胞免疫应答上效果较好。     

小分子药物索非布韦对牛病毒性腹泻病毒体外复制的影响

试验旨在研究小分子药物索非布韦是否具有抑制牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）复制的作用。通过MTT法测定了不同时间和不同浓度索非布韦对牛肾细胞（MDBK）增殖的影响;采用免疫荧光染色试验筛选出能有效抑制BVDV复制的索非布韦最适浓度,用实时荧光定量PCR、致细胞病变作用（CPE）和病毒半数组织细胞感染量（TCID₅₀）测定的方法检测索非布韦对BVDV复制的影响。结果显示,索非布韦处理MDBK细胞24和48 h能极显著抑制细胞增殖（P<0.01）;与对照组相比,当索非布韦浓度为800 μmol/L时免疫荧光染色检测BVDV感染MDBK细胞的双链RNA（dsRNA）含量极显著降低（P<0.01）;实时荧光定量PCR检测发现,与DMSO处理组相比,BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞,BVDV 5'UTR mRNA含量在病毒感染24和48 h时极显著降低（P<0.01）;BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞病变现象明显减弱;索非布韦处理24 h后能极显著减弱BVDV感染MDBK细胞后子代病毒颗粒的形成组与释放（P<0.01）,降低病毒滴度。综合上述结果表明,小分子药物索非布韦能有效抑制BVDV体外复制。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。