蛹虫草多糖提取工艺研究

为优化蛹虫草多糖的提取工艺,以蛹虫草多糖得率和相对标准偏差为指标,测试超声波水提法、超声波醇提法、水热回流法和醇热回流法蛹虫草多糖提取效果,确定最佳提取方法;再用正交试验方法检测水热回流法中4个因素(温度、次数、时间、料液比)对虫草多糖提取效率的影响,确定虫草多糖提取条件。结果表明:水热回流法虫草多糖得率6.2%,相对标准偏差RSD(%)1.39,是提取虫草多糖的最佳方法;提取温度100℃、提取时间90min,提取次数3次,料液比1∶20,为蛹虫草多糖提取的最佳工艺条件。     

蛹虫草中虫草素、腺苷综合提取工艺研究

以蛹虫草为材料,采用超声波水提法、超声波醇提法、水热回流法和醇热回流法4种提取方法,选择虫草素和腺苷的最优提取方法,并用正交试验方法考察超声波水提法中提取温度、提取次数、提取时间、料液比4个因素对虫草素、腺苷综合提取效率的影响,确定虫草素、腺苷综合提取最佳工艺。结果表明,超声波水提法是综合提取虫草素和腺苷的最优方法,其最佳工艺条件为:用10倍量的水于60℃超声波提取2次,每次40min。     

不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量测定

虫草素和腺苷是蛹虫草的重要活性成分,通过高效液相色谱(HPLC)法测定不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量,筛选能生产高品质蛹虫草的培养基。测定结果表明,用不同培养基培育的蛹虫草子实体中,其虫草素和腺苷含量存在显著差异,总体表现为粳米+家蚕蛹浸提液培养基>糯米+家蚕蛹浸提液培养基>粳米培养基>糯米培养基,其中用粳米+家蚕蛹浸提液培养基培育蛹虫草子实体中的虫草素和腺苷质量比分别高达15.37 mg/g和39.96 mg/g。此外,相同培养基培育的蛹虫草子实体、菌丝体和培养基质中的虫草素与腺苷含量存在极显著差异,总体表现为子实体>菌丝体>基质。试验结果表明,粳米培养基中添加家蚕蛹浸提液可显著提高蛹虫草中的虫草素和腺苷含量。     

蚕体和蛹粉代料培养基上的蛹虫草生长状况与品质检测

在实验室条件下以优选的蛹虫草菌株YCC-XD-2在家蚕蛹、蛾培养基和蛹粉代料培养基上培育蛹虫草,比较不同培养基上的蛹虫草的生长状况和虫草素含量,探究高产优质蛹虫草的培养方式。蛹虫草菌种在蚕体和蛹粉代料培养基上均生长良好,其中:蚕体培养基以蚕蛾培养基上的蛹虫草生长较好;蛹粉代料培养基以糯米+蛹粉培养基上的蛹虫草生长较好。蚕体培养基培育蛹虫草子实体中的虫草素含量显著高于蛹粉代料培养基培育的蛹虫草,其中,蚕蛾培养基培育蛹虫草子实体中的虫草素质量比高达21.97 mg/g。在相同培养条件下,蛹虫草子实体中的虫草素含量高于菌丝体和培养基质。试验结果表明,利用家蚕蛹、蛾培养基可以生产出高品质蛹虫草。     

吖啶橙诱变提高蛹虫草虫草素含量的研究

蛹虫草的活性成分与冬虫夏草基本相同,常被用作冬虫夏草的替代品。虫草素是虫草属特有的次生代谢产物,具有很高的药用价值。为提高虫草素含量,应用吖啶橙对蛹虫草无性型孢子进行诱变,筛选虫草素含量高的突变菌株,并对获得的稳定遗传的突变株进行再诱变,经二次诱变得到的突变菌株其虫草素含量可达290.60mg/L,比初发菌株提高了7.4倍。     

采用固相分离与反相色谱法制备柞蚕蛹虫草虫草素

虫草素是蛹虫草中具有药用功能的活性成分。采用超声波技术获得柞蚕蛹虫草虫草素萃取液后,利用固相萃取柱对虫草素进行预分离,再利用反相制备型高效液相色谱监测制备虫草素。试验结果表明,采用固相萃取柱可以高效地分离柞蚕蛹虫草萃取液中的虫草素,虫草素洗脱液中的虫草素质量分数达47.05%,经反相高效液相色谱监测制备的虫草素样品纯度达到99%以上,其萃取、分离、制备工艺简单,具有实用价值。     

利用磁化水培养富硒蛹虫草条件优化的研究

为了优化磁化水培养富硒蛹虫草的条件,试验采用正交试验优化磁化水培养富硒蛹虫草的条件。结果表明:最佳培养条件为富硒浓度7 mg/kg、磁场强度0.1 T、磁程15次,在此条件下得到的蛹虫草子实体生物学效率为82.36%,多糖含量为34.41 mg/g,虫草酸含量为60.32 mg/g,虫草素含量为3.15 mg/g,总硒含量为8.97 mg/kg。说明利用磁化水培养富硒蛹虫草能有效提高蛹虫草的生物学效率和活性成分的含量,具有良好的应用前景。     

人工培养蛹虫草与冬虫夏草的主要活性成分比较

蛹虫草为珍稀中药材,基于为培养出含有类似天然冬虫夏草主要活性物质的蛹虫草提供基础依据的目的,对人工培养蛹虫草及菌丝体、子实体和冬虫夏草及菌丝体中的氨基酸、多糖、虫草素等活性物质含量与组成进行了测定,结果表明:人工培养蛹虫草与冬虫夏草在氨基酸种类上完全一致,但人工培养蛹虫草中赖氨酸、酪氨酸含量显著升高,组氨酸则显著降低;二者组成的多糖基本一致,但冬虫夏草特有一个分子质量约100 kD的组分,该组分占多糖总量的1.38%,人工培养的蛹虫草的虫草素含量显著高于冬虫夏草。以上成分的细微变化是否是造成二者药理活性差异的原因还有待研究。     

复方蛹虫草含片的研制

为了制备复方蛹虫草含片,试验以含片的色泽、风味、口感、组织状态作为考察指标,进行了单因素考察和正交试验以确定含片的最佳处方。结果表明:复方蛹虫草含片的最佳处方是药材提取物的比例为42%,硬脂酸镁的比例为1%,阿斯巴甜的比例为7%,薄荷脑的比例为2%,甘露醇的比例为48%,说明复方蛹虫草含片的制备工艺简单可行。     

蛹虫草菌保藏方法对其生产能力的影响

蛹虫草菌的保藏方法对柞蚕蛹虫草的产量及活性物质含量影响较大,随着冷冻保藏时间的延长,蛹虫草菌注蛹后的生产能力逐渐降低;随着冷藏保藏时间的延长,蛹虫草菌注蛹后的生产能力及虫草素含量均逐渐降低。丰富培养基和PDA培养基中蛹虫草菌随继代培育次数的增加其生产能力均出现降低的现象,但PDA培养基中降低的速度较慢,故PDA培养基更适合蛹虫草菌的保藏。     

牡荆总黄酮提取工艺优化及其对产气荚膜梭菌抑菌活性研究

【目的】 探究牡荆总黄酮的提取工艺，并探讨牡荆提取物对产气荚膜梭菌的抑菌活性。【方法】 以芦丁作为对照品，采用分光光度法对牡荆中的总黄酮含量进行测定；以总黄酮含量为考察指标，先通过单因素试验研究乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比4个单因素对牡荆总黄酮提取量的影响，确定单因素情况下最佳工艺的水平范围；在单因素试验基础上，通过设计L9（3⁴）正交试验，利用NaNO₂-AL （NO₃）₃-NaOH显色法对牡荆总黄酮含量进行测定，绘制标准曲线，计算回归方程，通过精密度、稳定性、重复性、加样回收率进行方法学考察，验证标准曲线。通过将试验所得数据代入标准曲线，比较得出牡荆总黄酮的最佳制备工艺，并在此基础上通过微量二倍稀释法考察其提取物对产气荚膜梭菌的抗菌活性。【结果】 牡荆总黄酮最佳提取工艺条件为：乙醇浓度60%、提取温度50 ℃、提取时间2.5 h、料液比1：35。在此最优提取条件下，牡荆总黄酮含量最高（43.17 mg/g）。其因素影响顺序为料液比>提取时间>乙醇浓度>提取温度，料液比对牡荆总黄酮含量影响最大。最佳工艺下的牡荆提取物对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度（MIC）值为7.81 μg/mL。【结论】 在乙醇浓度60%、提取温度50 ℃、提取时间2.5 h、料液比1：35的条件下提取的牡荆总黄酮含量最高，所制备提取物对产气荚膜梭菌具有较强的抑菌作用，为生产高质量的牡荆提取物提供了理论依据。     

加味平胃口服液提取工艺研究

【目的】 确定加味平胃口服液的提取工艺。【方法】 采用L₉（3⁴）正交试验法对提取工艺进行研究。对含有挥发油的药材进行挥发油提取，药渣再混合其余药材进行水煎煮提取。在挥发油提取工艺中首先进行饮片粒度考察，选择合适的饮片大小，在此基础上选定溶剂倍量（A）、浸泡时间（B）和煎煮时间（C）3个因素，每个因素各取3个水平，进行正交试验；以挥发油的提取量为评价指标，对组方中苍术、厚朴、陈皮、木香和枳壳的挥发油提取工艺进行探索研究，并进行3次工艺验证。在水煎煮提取工艺中选定溶剂倍量（A）、煎煮时间（B）和提取次数（C）3个因素，每个因素各取3个水平，进行正交试验；以柚皮苷含量和苦参总碱含量（苦参碱+氧化苦参碱总含量）作为评价指标，对水煎煮提取工艺进行探索研究，并进行了3次工艺验证。【结果】 饮片粒度筛选结果显示，1~2 cm的饮片更合理。影响挥发油提取因素大小为煎煮时间（C）>浸泡时间（B）>溶剂倍量（A），挥发油提取工艺为8倍水，煎煮10 h；影响水煎煮提取因素大小为提取次数（C）>煎煮时间（B）>溶剂倍量（A），水煎煮提取工艺为8倍水，煎煮1.5 h，提取3次。【结论】 本研究通过试验验证得出了加味平胃口服液提取的具体方法、流程等，该工艺提取效率高、制备过程稳定可靠，可达到量产的工艺标准，具有重要的实用价值。     

紫锥菊根中菊苣酸提取工艺及对氧化应激肠道细胞的保护作用研究

【目的】优化紫锥菊根中菊苣酸提取工艺，并测定菊苣酸在肠道细胞中的抗氧化效果。【方法】试验选用有机溶剂乙醇作为紫锥菊根粉末（80目）提取溶剂，对提取溶剂浓度、提取温度、提取时间、提取次数以及原料与溶剂的比例等因素进行分析，得到每个因素下菊苣酸得率和该因素的对应曲线，再在单因素基础上，选择溶剂浓度（30%、40%、50%）、提取温度（60、70、80 ℃）、提取时间（1、2、3 h）和料液比（1∶12、1∶15、1∶18）4个因素3个水平设计正交试验。用不同浓度H₂O₂（100、200、400、600、800、1 000 μmol/L）处理人结肠腺癌细胞（Caco-2）与猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）建立氧化应激模型。分别使用不同浓度菊苣酸（0、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L）处理氧化应激前后的细胞24 h，应用MTT法，分别测定菊苣酸对两种肠道细胞氧化应激的保护和缓解效果。【结果】菊苣酸最佳提取条件为：50%浓度的乙醇在70 ℃下采用1∶18的料液比，超声辅助提取2 h，得率为1.89 mg/g。细胞抗氧化试验结果显示，菊苣酸对Caco-2和IPEC-J2两种肠道细胞氧化应激均具有保护和缓解效果，对Caco-2细胞的保护作用和缓解作用的半数抑制浓度（IC₅₀）值分别为172.6和207.5 μmol/L，对IPEC-J2细胞的保护作用和缓解作用的IC₅₀值分别为133.1和196.5 μmol/L。【结论】试验得到了紫锥菊根粉中菊苣酸的最佳提取方案，为工业化高效提取菊苣酸提供了参考；同时菊苣酸对氧化应激的肠道细胞具有很好的保护作用，经计算其保护作用的IC₅₀值较缓解效果更小，进一步证明了菊苣酸具有成为肠道抗氧化剂的潜力。     

清肺颗粒固态发酵培养基成分研究

【目的】 筛选最佳的清肺颗粒固态发酵培养基碳源、氮源、无机盐种类,优化清肺颗粒发酵培养基组成,提高组方中（R,S）-告依春的含量。【方法】 建立发酵物中（R,S）-告依春含量的高效液相色谱法（HPLC）检测方法;单因素试验筛选清肺颗粒固态发酵培养基的碳源（葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、玉米面、可溶性淀粉和清肺组方中药）、氮源（蛋白胨、黄豆粉、麸皮、酵母浸膏、硫酸铵、氯化铵和尿素）和无机盐（碳酸钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰和氯化钠）成分,HPLC测定每克固态发酵培养物中（R,S）-告依春含量;4因素（碳源、氮源、无机盐和水）3水平响应面分析优化各培养基成分比例,用筛选出的最适培养基成分替代基础培养基中相应物质,接种解淀粉芽孢杆菌,于37 ℃、130 r/min振荡培养22 h,再以每克固态发酵培养物中（R,S）-告依春含量为评价指标,以响应面分析筛选培养基各组分含量。【结果】 清肺颗粒最适固态发酵培养基碳源为组方中药粉,无机盐为CaCO₃,氮源为黄豆粉以及水;响应面分析优化的各培养基成分含量为：中药粉30%、黄豆粉10%、CaCO₃ 0.2%和水59.8%,此时固态发酵物中（R,S）-告依春含量达0.0184 mg/g,而未优化前清肺颗粒组方中（R,S）-告依春含量为0.0150 mg/g,二者差异极显著（P<0.01）,说明解淀粉芽孢杆菌的发酵工艺更有利于清肺颗粒组方有效成分的释放。【结论】 优化的固态发酵培养基易于解淀粉芽孢杆菌生长。     

1株黄曲霉颉颃菌的鉴定及其抑菌活性成分分析

【目的】 筛选黄曲霉颉颃菌,探究其最佳培养条件及有效抗菌成分,为实际生产中应用生物防治方法抑制黄曲霉污染提供新的理论依据。【方法】 通过平板对峙法及分子生物学鉴定方法对待测菌株进行筛选鉴定。以抑菌率作为衡量标准,判断所得黄曲霉颉颃菌的最佳培养温度、培养时间、接种量、转速、pH及装液量。通过硫酸铵沉淀法从颉颃菌无菌发酵上清液中提取蛋白,观测粗提物对黄曲霉菌丝生长的影响。通过离子交换色谱和凝胶过滤色谱进一步纯化粗提蛋白,并进行质谱测序及序列对比分析,筛选鉴定颉颃菌产生的有效抑菌成分。【结果】 筛选到1株解淀粉芽孢杆菌B10(菌种保藏号CCTCCNO:M2018353)。最佳培养条件为温度40 ℃,培养时间36 h,接种量3%,转速120 r/min,pH 6.0,装液量30 mL,最大抑菌率可达46.56%。其粗提蛋白能有效抑制黄曲霉生长,破坏菌丝正常形态,并从中筛选出几丁质结合蛋白、壳聚糖酶、葡聚糖酶等8种可能的有效抑菌成分。【结论】 本试验分离鉴定出1株抑制黄曲霉正常生长发育的解淀粉芽孢杆菌B10,其产生的多种蛋白成分对黄曲霉有显著抑菌活性。     

石榴皮水提物对猪源多重耐药大肠杆菌的抑菌作用研究

【目的】筛选腹泻仔猪中携毒力基因且多重耐药的大肠杆菌菌株,评估中药水提物对该菌株的抑菌活性,并探索中药抑菌机制。【方法】通过PCR方法与Kirby-Bauer(K-B)药敏纸片法评估临床大肠杆菌菌株的肠毒素基因携带情况和耐药性;通过微量肉汤稀释法评估中药水提物对多重耐药大肠杆菌菌株的抑菌活性,确定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration, MBC);通过电导率仪以及相关试剂盒检测评估石榴皮水提物对多重耐药菌株作用不同时间后菌液电导率、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)含量及菌体内ATP含量的变化;通过SDS-PAGE和蛋白含量检测评估菌体内可溶性蛋白的含量变化;通过扫描电镜观察大肠杆菌形态变化。【结果】PCR检测14株临床大肠杆菌中肠毒素基因携带率达到78.57%,抗生素药敏试验结果显示,所有菌株至少对2种抗生素耐药,均属于多重耐药菌株。中药药敏试验结果显示,黄连、黄芩、石榴皮水提物对多重耐药菌株抑菌活性较好,其中石榴皮水提...     

河北省奶牛源大肠杆菌的分离鉴定、致病性及中草药体外抑菌效果研究

【目的】 分析河北省奶牛源大肠杆菌的致病性及中草药体外抑菌效果。【方法】 于河北省收集30份具有典型临床症状的奶牛粪便样品,对样品进行细菌培养观察、生化鉴定、血清型鉴定、透射电镜观察、PCR扩增及致病性研究。采用传统煎煮法与醇提法提取9种中草药,通过96孔板-二倍稀释平板法测定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）及最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration,MBC）,筛选出抑菌效果较强的中草药;将中草药进行两两联合,采用牛津杯法测定抑菌圈直径（inhibition zone diameter,IZD）,并通过96孔板-二倍稀释平板法测定MIC和MBC,评价药物的抑菌效果。【结果】 分离获得12株奶牛源大肠杆菌,检出率为40%,均具有致病性,其优势血清型为O55,检出率为58.3%。在中草药水提取液中,五倍子、五味子抑菌效果最强,MIC和MBC均为7.80 mg/mL,其次为乌梅、夏枯草、石榴皮,具有较好的抑菌效果,MIC和MBC均为15.63 mg/mL;在中草药醇提取液中,五倍子抑菌效果最强,MIC和MBC均为3.97 mg/mL,其次为五味子抑菌效果较好,MIC和MBC均为7.80 mg/mL。在中草药两两联合中,五味子与乌梅联合用药表现出协同作用,抑菌效果最强,IZD为26.00 mm,MIC和MBC均为3.97 mg/mL,其次为五倍子与乌梅,IZD为23.66 mm,MIC和MBC均为7.80 mg/mL。【结论】 本研究成功分离到具有致病性的大肠杆菌,优势血清型为O55型,筛选出抑菌效果较好的单味及复方中草药,为大肠杆菌引起的奶牛腹泻临床应用中药防治提供科学依据。     

复方中药水提物对腹水综合征肉鸡肝脏TGF-β1/Smad通路的影响

【目的】 研究转化生长因子β1(transforming growth factor-β 1,TGF-β1)/Smad通路在肉鸡腹水综合征肝纤维化中的作用及复方中药水提物的防治机理。【方法】 选取健康Ross肉鸡258只,常规饲养至7日龄后,随机分为5组:空白组(C);模型组(M),低温、高脂和高蛋白饲料、高钠饮水的多因素法造模;复方中药水提物高、中、低剂量组(T1、T2、T3),在模型组基础上,每天饮水中分别添加2.0、1.0、0.5 g/kg复方中药水提物。观察临床症状和剖检变化,通过HE染色和Masson染色分别观察肉鸡肝脏组织结构变化与胶原纤维沉积,计算15、25、35、45日龄体重变化。利用实时荧光定量PCR检测各日龄肝脏中TGF-β1、转化生长因子β受体Ⅰ(transforming growth factor β receptor Ⅰ,TβRⅠ)、Smad2、Smad3和Smad7基因相对表达量;利用ELISA法检测各日龄肝脏中TGF-β1、TβRⅠ蛋白含量。【结果】 与空白组相比,模型组肉鸡腹部膨大、触压有波动感;腹腔内有大量淡黄色液体,肝脏充血肿胀、质脆,表面有瘀血点;肝脏组织结构紊乱,炎性细胞浸润,胶原纤维大量沉积,肝脏发生纤维化;体重极显著降低(P<0.01);除15日龄TβRⅠ蛋白外,肝脏中TGF-β1、TβRⅠ基因mRNA相对表达量与蛋白含量均极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05),Smad2、Smad3基因mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01),Smad7基因mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)。与模型组相比,复方中药水提物组的肉鸡上述结果均有不同程度改善,且高剂量组作用效果最显著。【结论】 肝纤维化参与了肉鸡腹水综合征的发生发展,机制与TGF-β1/Smad通路相关;由黄芪、当归、丹参、茯苓等制成的复方中药水提物可以调控TGF-β1/Smad通路,抑制肝纤维化的发生,可有效防治肉鸡腹水综合征。     

同时提取生地黄中地黄多糖和梓醇的工艺研究

为优化自生地黄中同时提取地黄多糖和梓醇的工艺,本研究采用单因素试验和正交试验进行优选,用苯酚硫酸法测定地黄多糖的含量和高效液相色谱法测定梓醇的含量,以地黄多糖和梓醇的得率为评价指标,考察固液比、提取时间和提取温度对得率的影响.最终确定最佳工艺参数为固液比1:8,提取时间为1.5 h,提取温度为90 ℃.该工艺稳定可行,适合工业化生产,可为新兽药开发利用提供参考.