PRRSV对仔猪免疫力的影响

为了研究PRRSV对仔猪免疫力的影响,试验将13头46日龄的健康仔猪随机分A、B、C 3组,48日龄时A组猪进行滴鼻接种PRRSV LC毒株(TCID50为1×10-5.25/0.1 mL)3 mL/头,B组猪滴鼻接种未接毒正常细胞培养物3 mL/头;50日龄时A组、B组猪免疫猪瘟疫苗4头份,C组猪肌肉注射生理盐水4 mL;免疫后1,7,14,21,28,35天利用ELISA和MTT等方法检测试验组猪猪瘟抗体水平和外周血T淋巴细胞转化率.结果表明,A组猪瘟抗体水平和T淋巴细胞转化率显著低于B组(P<0.05)有极显著的,说明PRRSV对仔猪免疫力有一定的抑制作用.     

荧光定量RT-PCR检测PRRSV方法的建立及初步应用

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5保守区域为靶基因,基于SYBR Green构建了以RNA为模板、反转录和PCR扩增一步完成的荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法。该方法对质粒和细胞培养物中病毒的检测限分别为1×100copies/μL和1×10-2TCID50/m L;组内和组间差异系数(CV)均小于5%。利用本方法检测126份临床组织样品,PRRSV阳性率为42.06%,与传统RT-PCR检测结果具有较好的一致性(Kappa=0.918),且敏感性显著高于传统RT-PCR。本研究建立的qRT-PCR方法为猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断提供了技术手段。     

检测PRRSV—Ⅰ、PRRSV—Ⅱ和PCV-2多重PCR方法的建立及初步应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virns,PRRSV）欧洲株（PRRSV-Ⅰ）、北关株（PRRSV-Ⅱ）常与猪圆环病毒2型（Porcine Circorirnstype 2,PCV-2）呈混合感染,严重影响养猪业的经济效益。本文根据GenBank上已发表的PRRSV北美型（PRRSV-Ⅰ）、PRRSV欧洲型（PRRSV-Ⅱ）、圆环病毒2型（PCV-2）的基因组全序列,分别设计了3对能特异性扩增PRRSV-Ⅰ、PRRSV-Ⅱ和PCV-2的引物,建立并优化了可同时检测PRRSV-Ⅰ、PRRSV-Ⅱ和PCV-2三种病毒的多重PCR方法,通过对临床病料的检测,证实了此方法具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点,适合大量样本的分析与鉴定。利用该方法能在24h内对样品进行检测并获得结果,因此本方法的建立对这3种病毒的早期快速诊断有十分重要的意义。     

纳米银体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

【目的】 研究纳米银（silver nanoparticles,AgNPs）体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的作用,并初步分析其抗病毒作用机制,为PRRSV的防控提供新思路。【方法】 使用0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL AgNPs处理Marc145细胞,采用CCK-8试剂盒评估AgNPs对Marc145细胞毒性,确定其安全浓度。通过显微观察、间接免疫荧光试验、病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs体外抗PRRSV感染Marc145细胞的效果。通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs对PRRSV的直接灭活效果。通过实时荧光定量RT-PCR方法分析AgNPs对不同感染复数（multiplicity of infection,MOI） PRRSV （0.0001~0.1）黏附和入侵Marc145细胞的影响,以及PRRSV感染Marc145细胞3、6、12、18和24 h后加入AgNPs对Marc145细胞增殖的影响。【结果】 AgNPs对Marc145细胞的最大安全浓度为1.5 μg/mL,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均具有良好的体外抗PRRSV活性,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均对PRRSV起一定灭活作用。AgNPs对不同MOI的毒株黏附和入侵Marc145细胞均有一定抑制作用,且不同时间（3、6、12、18、24 h）加入AgNPs对PRRSV增殖均有一定抑制作用。【结论】 AgNPs具有良好的体外抗PRRSV活性,体外抗PRRSV的作用机制包括直接灭活以及抑制病毒的黏附、入侵和增殖过程。     

广东省PRRSV流行株的分离鉴定及其Nsp2、ORF3、ORF5基因的遗传变异分析

为了探究广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况,分析所分离毒株的分子遗传进化特征,本研究用RT-PCR方法对广东11个地区66个养殖场的189份病料进行了PRRSV的检测,结果表明,样本的PRRSV总阳性率为48.7%(92/189),其中变异株占63.0%(58/92);阳性病例样本经处理后接种Marc-145细胞,成功分离到9株PRRSV。对分离到的9个毒株进行ORF3、ORF5基因和Nsp2主要变异区基因的扩增、克隆、测序和遗传变异分析。序列分析结果发现,其中2株Nsp2基因没有缺失,7株病毒的Nsp2基因发生了与高致病性PRRSV毒株相同的缺失,即第481位有一个氨基酸缺失,第532-560位有连续29个氨基酸缺失。同源性分析表明,分离毒株GDYF、GDZC、GDEP、GDSD、GDSH2、GDTH1、GDTH2与国内的HB-1(sh)/2002毒株及其它高致病性PRRSV同源性较高;GDX071108和GDSH1则与VR2332、RespPRRSVMLV、CH-1a的同源性较高,分离株之间的同源性为60.3%-100.0%。系统进化分析发现,GDX071108与PA8和RespPRRSVMLV的亲缘关系很近,与VR2332亲缘关系较近;而GDYF、GDZC、GDEP、GDSD、GDSH2、GDTH1、GDTH2则与JXA1、GD、HUB1、HUB2、HN2、HUN1、HNyz、HEB1、HUN4都在HB-1(sh)/2002的同一分支上。     

龙胆草及其提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

为研究龙胆草水提取物、龙胆草总黄酮、龙胆草总苷体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的作用,本试验建立Marc-145细胞模型,在研究其对Marc-145细胞最大安全浓度的基础上,结合细胞病变形态观察和MTT法,设立药物组、利巴韦林阳性对照组、病毒对照组和细胞对照组,对病毒进行阻断、抑制和直接灭活3种作用方式的测定。结果显示,龙胆草水提取物、龙胆草总黄酮、龙胆草总苷和利巴韦林的最大安全浓度分别为6.250、0.020、0.630和0.016 mg/mL。在体外抗PRRSV作用的试验中,龙胆草水提取物对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为43.1%、57.4%和56.4%,均低于阳性对照利巴韦林,且各作用方式下细胞均发生了明显病变。龙胆草总黄酮对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为66.1%、41.1%和42.7%,其抑制作用和直接灭活作用的抑制率均低于阳性对照利巴韦林,阻断作用下细胞轻微病变。龙胆草总苷对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为33.4%、78.2%和81.9%,其抑制和直接灭活作用较强,远高于阳性对照利巴韦林,且在这两种作用方式下细胞基本保持单层完好。综合3种作用方式,3种龙胆草提取物中龙胆草总苷抗PRRSV的效果最好,其次是龙胆草水提取物和龙胆草总黄酮。     

高致病性PRRSV（HuN株）NSP2基因的扩增与分析

从2006年高热病病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒（HuN株），利用RT-PCR扩增其NSP2基因，通过与标准毒株VR-2332进行比较，发现共有30个氨基酸缺失，其中29个为连续缺失，缺少氨基酸分别位于481、532～560位。将分离株与同时期分离自不同地区高热病毒株的基因序列（EF112445、EF112446、EF112447）相比较，发现全部都具有相同的缺失，这说明引起猪高热病的病原变异不大；与较早期分离的AY150312、AY262352毒株进行比较，发现缺失部位不同。该研究补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据，为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

6株高致病性PRRSV ORF5基因的遗传变异分析

为了监测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的基因变异情况,对四川省2014-2015年蓝耳病发病猪场分离到的6株PRRSV毒株ORF5基因进行了克隆测序及序列分析。同源性分析表明,6株PRRSV分离株ORF5基因核苷酸(氨基酸)与VR2332株的同源性为88.9%~89.4%(86.5%~88.7%),与CH-1a株同源性为93.7%~94.7%(90%~92%),与JXA1株同源性为97.2%~98.5%(95%~97%),与美国新出现的变异株NADC30同源性为85.9%~86.7%(85.5%~87.5%),与欧洲型代表株Lelystad virus同源性为62.7%~63.7%(56.5%~57.5%)。遗传进化树分析表明,6株PRRSV与JXA1、HuN4等高致病毒株亲缘关系近,并位于同一分支。氨基酸序列分析表明,6株PRRSV ORF5基因编码氨基酸在PRRSV毒力相关位点aa13、aa151和区分野毒与疫苗毒的位点aa137均与JXA1、HUN4等强毒株相同,表明6个分离株均为较强的野毒株。在中和表位(aa37~aa45)和非中和表位(aa27~aa30,aa180~aa197)等区域与国内外参考毒株VR2332、CH-1a、JXA1、HUN4、NADC30、HENAN-XINX、JL580等相比,也出现了不同程度的变异。抗原性分析结果表明,6株PRRSV ORF5基因编码产物的抗原表位主要位于aa30~aa39,aa50~aa60,aa128~aa132,aa136~aa141,aa146~aa155,aa161~aa183,aa191~aa200,与JXA1具有相似的抗原性特征,而与VR2332差异较大,主要表现在aa30~aa39相较于VR2332株抗原区域明显变窄。而在6个分离株中,SN9的抗原表位明显低于其他任何毒株。本研究结果表明,四川省PRRSV流行毒株仍然为JXA1变异株,但在当前高频度活疫苗免疫下,其基因的变异和抗原表位的改变在加剧,需加强对PRRSV基因变异的监控。     

脂质代谢和糖代谢在PRRSV感染宿主细胞中作用研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染可引起母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道疾病及公猪精液质量下降,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV不能自主复制,其生命周期的各个阶段均依赖于宿主的代谢系统。宿主细胞也可调节其代谢过程,以防止PRRSV复制和维持其正常生理功能。脂质代谢和糖代谢在PRRSV感染中均扮演了重要角色,PRRSV作为一种囊膜病毒对脂质代谢系统的依赖性较其他代谢系统更强。脂质参与了PRRSV生命周期的各个阶段,包括吸附、进入、复制、组装和释放,此外还与细胞炎症、免疫和凋亡有关。糖代谢也可干扰PRRSV的生命活动,从而促进或抑制PRRSV复制。文章综述了脂质代谢中脂肪酸、胆固醇、磷脂、脂滴和脂筏以及糖代谢中糖酵解和三羧酸循环在PRRSV感染宿主细胞中的作用,以期为阐明PRRSV的致病机制以及疫苗和抗PRRSV药物的研发提供基本理论依据。     

上海地区野鸟和家禽中PRRSV抗体的血清学调查

2005年3～5月，采用ELISA法对来自于上海地区的208份野鸟和357份家禽的血清样品进行了猪繁殖和呼吸综合征病毒（porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV）抗体的血清学调查。结果表明，受检的5种家禽存有不同程度的抗体阳性率，而野鸟的阳性样品集中于绿头鸭和麻雀。     

shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JXA1-R株在Marc-145细胞中复制及抗PRRSV细胞株的建立

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是世界上主要的猪传染性疾病之一,目前,疫苗和抗病毒药物只能提供有限的保护。本研究选择猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）JXA1-R株ORF1a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7的保守区域为靶序列,利用pSilencer2.1-U6 neo构建shRNA表达载体并转染Marc-145细胞。经实时荧光定量PCR、细胞病变及病毒滴度分析,结果显示,ORF1a-4-shRNA、ORF3-1-shRNA、ORF6-2-shRNA干扰质粒能明显抑制病毒基因的转录,并有效抑制PRRSV在Marc-145上的增殖,显著降低病毒滴度。最后筛选ORF6-2-shRNA表达质粒转染猪胎儿成纤维细胞,构建稳定转染细胞株,为抗PRRSV转基因猪的生产奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染与免疫过程中猪细胞因子的应答及意义

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是猪的一种严重的传染性疾病,其长年流行给养猪业造成重大经济损失。接种弱毒疫苗或灭活疫苗是控制PRRS的首选策略,但在现有技术水平下,由于疫苗毒株存在免疫抑制等因素,预防效果不理想。因而,深入研究PRRSV感染和/或接种疫苗后的免疫学应答机理是研究开发新型高效疫苗的必然基础。作者回顾性地综述感染PRRSV或接种PRRSV疫苗后宿主产生细胞因子的动态规律,探讨猪体防御PRRS的机制及开发新型高效疫苗的新思路。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是目前养猪业中一种严重的病毒性传染病,引起猪严重繁殖障碍和呼吸道疾病。该病的病原体属于动脉炎病毒属,是一种不分节段的单股正链RNA病毒,含有8 个开放阅读框(ORFs),ORF1 编码非结构蛋白,ORF2~ORF7 编码结构蛋白。其中ORF7 编码的核衣壳(N)蛋白和ORF6编码的非糖基化基质(M)蛋白为优势结构蛋白。猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组存在广泛的遗传变异性,M蛋白和N蛋白在所有的毒株之间相对比较保守,可作为血清学诊断的靶抗原。文章就猪繁殖与呼吸综合征病毒在分子生物学方面的研究情况做作一综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株ORF5基因在E.coli中表达的初步研究

根据已测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株序列设计1对引物,应用PCR方法从重组质粒PMD-ORF5扩增得到缺失信号肽序列的基因片段dORF5,将dORF5克隆至原核表达载体PBAD/Myc-His B上,成功地构建了重组表达质粒PBAD/Myc-His B-dORF5,转化大肠埃希菌TOP10感受态细胞,经阿拉伯糖诱导表达,SDS-PAGE可检测到分子质量约为19.4 ku的目的蛋白,经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达17.1%。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,这为进一步研究GP5蛋白的结构、功能和开发新型诊断试剂盒、新型疫苗提供了理论与物质基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是严重危害养猪业的病原,论文概述了PRRSV的生物学特性和基因组的结构及编码的结构蛋白,综述了PRRSV新型疫苗、反向遗传技术和分子诊断的研究进展,为PRRS的预防和诊断提供科学依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒多克隆抗体的制备及免疫学活性研究

为了给猪繁殖与呼吸系统综合征的诊断、血清学调查、双抗夹心试剂盒的研制与开发奠定基础,试验将在Marc-145细胞上传代的大量增殖的猪繁殖和呼吸系统综合征病毒纯化后并作为免疫抗原,采用ELISA方法检测多克隆抗体效价。结果表明:免疫获得的多克隆抗体效价为1∶12 800,该多克隆抗体有良好的中和活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HS株结构蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(VR-2332)基因序列,设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物.利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段,将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序.应用DNA Man软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株(VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV)的相应基因进行序列比较,并绘制系统进化树.结果表明,PRRSV HS株与美洲型的相应基因核苷酸同源性为83.6%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为38.9%～49%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为86.6%～99.6%,与LV株的同源性为54.2%～78.2%.系统进化树表明,PRRSV HS株属于美洲型,与HN1、VR-2332、RespMLV、16244B、BJ-4亲缘关系较近.     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的重组腺病毒的构建及其免疫原性分析

【目的】利用腺病毒AdMax系统表达载体表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein),并研究其免疫原性。【方法】参考GenBank中已公布的PRRSV N基因序列(登录号：KT945017.1),人工合成PRRSV N基因,并将其连接至腺病毒穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建重组穿梭质粒pDC316-N。将重组穿梭质粒pDC316-N与AdMax腺病毒系统的骨架质粒PBHGLOX(delta) E1,3Cre共同转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-N,对获得的重组腺病毒液进行PCR和测序鉴定,用鉴定正确的rAd-N病毒液感染293A细胞,对该重组腺病毒进行扩大培养,检测病毒的TCID₅₀,并用RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的表达和反应原性。用重组腺病毒免疫小鼠,收集血清用PRRSV抗体检测试剂盒检测其抗体水平,初步评价其对小鼠的免疫...     

PRRSV BJ-4株ORF5基因的原核表达与重组蛋白的纯化

为成功表达猪繁殖与综合征病毒(PRRSV)结构蛋白GP5，通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF5扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5)。将d ORF5克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在E.coli BL21细胞中成功表达了重组蛋白GST-dORF5，表达产物以包涵体的形式存在，表达量为20．8％。Western-Blot结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。利用融合肽进行亲和层析得到高纯度的重组蛋白，为进一步研究PRRS病毒结构蛋白的结构和功能奠定了基础。