褐黄血蜱卵蛋白质组分析

本研究旨在探明褐黄血蜱卵内蛋白组分,揭示蜱胚胎发育中的关键营养物质,为筛选可干扰胚胎发育的抗原分子奠定基础。采用液相色谱-串联质谱法对新鲜褐黄血蜱的卵蛋白成分进行分析,基于该蜱的唾液腺转录组翻译文库、中肠转录组翻译文库和Uniprot数据库对各蛋白成分进行鉴定。结果显示:从褐黄血蜱卵黄蛋白提取液中检出特异性肽段221条,由此鉴定蛋白53种,其中高可信蛋白12种,能够确定的功能蛋白有肌动蛋白(actin)和卵黄蛋白原Ⅱ(vitellogenin 2,Vg-2),且Vg-2与卵黄蛋白(vitellins, Vn)一级结构相同。蜱卵原生质所含蛋白较少;Vg-2是蜱卵内存在的唯一一种卵黄蛋白原。     

褐黄血蜱雌蜱不同消化阶段中肠蛋白组学分析

本研究旨在探明4个时间段褐黄血蜱（采自刺猬体表）中肠蛋白质成分,揭示参与血餐消化的蛋白种类及其含量变化规律。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对采集于刺猬体表的4个时间段褐黄血蜱的中肠蛋白组成分进行检测。基于该蜱的唾液、中肠转录组翻译文库及Uniprot数据库,利用软件Mascot 2.2对所获肽段及蛋白质进行鉴定。结果显示：在褐黄血蜱中肠蛋白提取液中共检测出特异性肽段3 046条,鉴定303种蛋白,其中271种为高可信蛋白;在所有的高可信蛋白中,23种含量较为丰富,125种在后期消化阶段（第2至第4阶段）的含量为0,123种的含量发生不同程度的变化（24种蛋白的含量变化明显,其中12种含量上升明显,12种含量下降明显）。确定148种高可信蛋白来自于刺猬血清,推断24种可信蛋白可能参与蜱虫对血餐的消化。     

褐黄血蜱产卵和孵化规律观察

褐黄血蜱是我国中东部各省、市、自治区的优势蜱种,其可携带多种病毒、细菌、支原体、螺旋体等病原,对人类健康和公共卫生安全构成潜在威胁.由于该蜱偏好于侵袭野生动物,尤其是刺猬,故长期被忽视.该论文对褐黄血蜱产卵和孵化进行观察,结果表明,褐黄血蜱卵呈椭圆形,其大小约535.63μm×361.56μm,重量0.064 mg.2...     

褐黄血蜱的形态学与分子生物学鉴定

鉴定采自河南信阳、湖南华容、山西太谷刺猬、犬的蜱。借助体视显微镜对蜱样进行形态观察;克隆、分析其COX1与ITS1序列,对比分析同源性并构建系统发生树。形态学鉴定和分子生物学鉴定结果表明,采自河南信阳、湖南华容、山西太谷刺猬、犬体表的蜱均为褐黄血蜱。湖南、河南、山西也成为褐黄血蜱的分布地。     

褐黄血蜱中肠内容物菌群结构分析

为了解褐黄血蜱的带菌情况及其公共卫生意义,本研究在无菌条件下采集褐黄血蜱中肠内容物,提取细菌总DNA为模板,采用通用引物PCR扩增细菌16S r DNA V3区,经DGGE电泳回收DGGE 16个优势条带,并选取其中13个条带进行测序分析,结果显示,选取条带分别与立克次氏体属、柯克斯氏体属、假单胞菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌属等高度相似。采用传统细菌学方法,从中肠内容物培养分离到2株细菌,经鉴定其中1株为蜡样芽胞杆菌。对各地区褐黄血蜱半饱血雌成蜱和吸血雄成蜱中肠菌群结构分析结果表明其带菌情况基本相同,但饱血雌成蜱3个地区间具有较大的差异;而饱血雌蜱和其它两种状态下的蜱肠道菌群也有差异。贝纳柯克斯氏体、菊欧文氏菌、肺炎克雷伯菌及软腐果胶杆菌是褐黄血蜱中肠内的优势菌。本研究利用PCR-DGGE技术分析褐黄血蜱中肠内容物,为蜱传播疾病的研究奠定基础。     

不同地区褐黄血蜱的基因变异及遗传进化分析

为探究不同区域褐黄血蜱的基因变异情况及其遗传进化关系,试验以采集自湖南、河南省的20只褐黄血蜱为研究对象,通过PCR扩增其内转录间隔区Ⅱ（ITS-2）和烟酰胺脱氢酶亚基Ⅰ（nad1）基因序列,并对所获序列进行基因变异分析;在所获ITS-2和nad1基因序列的基础上,对不同地区褐黄血蜱的遗传进化关系进行分析,并利用ITS-2和nad1基因序列分别构建褐黄血蜱的系统进化树。结果显示,褐黄血蜱ITS-2基因序列长度均为1 160 bp,nad1基因序列长度均为285 bp;两省褐黄血蜱ITS-2及nad1基因的种内差异分别为0~1.9%和0~0.4%;湖南省褐黄血蜱的种内差异分别为0~1.4%和0~0.4%,而河南省的种内差异分别为0~1.2%和0~0.4%;两省褐黄血蜱ITS-2及nad1基因的种间差异分别为37.0%~52.0%和13.6%~24.8%。系统进化树结果显示,所有来自于两省的褐黄血蜱共处于同一分支上。结果表明,来自于两省的褐黄血蜱之间均存在基因变异的现象,但湖南省褐黄血蜱的基因变异程度和遗传多样性均高于河南省;两省褐黄血蜱之间的亲缘关系较近,暗示两省褐黄血蜱之间有基因交流,未出现遗传分化。     

豪猪血蜱卵蛋白成分初步鉴定及其功能分类

旨在探明豪猪血蜱卵原生质蛋白成分,为探索干扰蜱类胚胎发育和新型控蜱策略奠定基础。采用FASP法消化豪猪血蜱卵蛋白提取物,LC/MS/MS法对其进行分析、检测,搜索褐黄血蜱卵巢转录组文库、唾液腺转录组文库和中肠转录组文库,分别检出特异性肽段359、312、357条,鉴定多肽108、170、161条,终而鉴定高可信蛋白103种。豪猪血蜱蜱卵原生质中富含酶类、蛋白酶抑制剂、转运蛋白、细胞骨架蛋白、蛋白质合成与修饰、分泌蛋白以及未鉴定的蛋白共8类蛋白。     

褐黄血蜱HSP70-b2及其类14-Mer肽的作用研究

褐黄血蜱(Haemaphysalis flava,H.flava)热休克蛋白70-b2(heat shock protein 70-b2, HSP70-b2)属于HSP70家族。为评估褐黄血蜱HSP70-b2的抗凝血活性、免疫原性及其类14-Mer肽的作用,本研究通过RACE技术扩增褐黄血蜱HSP70-b2基因全长;定点突变其编码类14-Mer肽段序列获得HSP70-b2^M基因全长;分别构建原核表达质粒,经原核表达、镍柱层析纯化获得可溶性重组蛋白,体外凝血四项试验评估rHSP70-b2与rHSP70-b2^M的抗凝血活性;将重组蛋白与弗氏(不)完全佐剂按推荐剂量乳化,皮下免疫Sprague Dawley(SD)大鼠,间接ELISA检测血清抗体效价,探究rHSP70-b2与rHSP70-b2^M的免疫原性。结果显示：HSP70-b2基因全长2 413 bp,开放阅读框长1 905 bp,编码蛋白中具有HSP70蛋白家族标签。成功将HSP70-b2中编码类14-Mer肽段的核酸序列突变为编码14-Mer肽段的核酸序列。与对照组相...     

液相色谱-串联质谱法在兽药残留检测中的应用

 随着兽药和药物添加剂在畜禽饲养过程中长期不合理的使用,残留在动物体内的兽药及其添加剂随着食物链进入人体,对人类的健康构成潜在威胁。加强对兽药残留的检测,对保护生态环境和人类的身体健康有着极其重要的现实意义。近年来,液相色谱—串联质谱技术以其良好的适用性、定性定量功能及高灵敏度等优点,在兽药残留的检测方面已得到了广泛应用。论文概述了液相色谱—串联质谱技术在饲料、畜产品和尿液中兽药残留以及违禁药物和有害添加剂检测的应用现状。     

植物乳杆菌抑菌蛋白的分离鉴定及抑菌特性研究

【目的】筛选新型广谱有效的抑菌蛋白,为全面解析植物乳杆菌抑菌机制和开发新型抗菌制剂奠定基础。【方法】以植物乳杆菌GX20200417-1为研究对象,采用牛津杯法测定其抑菌活性,以低温离心和超滤法初步分离获得胞外蛋白并测定其抑菌活性,对胞外蛋白进行不同温度、pH及蛋白酶处理,研究抑菌蛋白理化特性,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进一步分析鉴定植物乳杆菌代谢产物中的抑菌成分。【结果】植物乳杆菌GX20200417-1对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑菌作用;发酵上清液在发酵24 h的抑菌能力最强;胞外蛋白的抑菌能力与发酵上清液相近;植物乳杆菌抑菌蛋白具有较好的耐热特性,与对照组相比,在20~80 ℃时抑菌活性均无显著变化(P＜0.05),在pH 6.0~8.0时抑菌活性最佳,对蛋白酶敏感;经LC-MS/MS鉴定分析,检测出5种可信度较高且与抑菌作用相关的蛋白质,分别是片球菌素pediocin PA-1、溶菌素(lysin)、聚酮合酶(polyketide synthase)、辅助蛋白(accessory protein)和LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein,分子质量分别为5.348、7.348、8.348、6.348和19.662 ku;蛋白质功能分析结果表明,片球菌素pediocin PA-1与溶菌素主要通过破坏细菌细胞壁与细胞膜,从而达到抑菌效果。LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein可识别含有N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的肽聚糖,上调抗菌肽的表达;辅助蛋白主要参与细菌素的合成,聚酮合酶主要参与抗生素的合成,二者通过参与抑菌物质的合成间接发挥抑菌作用。【结论】本研究成功分离并鉴定植物乳杆菌GX20200417-1的5种抑菌蛋白;植物乳杆菌GX20200417-1可能通过其代谢产物中的多种抑菌蛋白协同发挥抗菌作用。     

青海血蜱不同发育阶段蛋白分析

考虑到不同发育阶段蛋白多肽及抗原特性方面的差异,本实验利用SDS-PAGE和Westernblotting对青海血蜱的卵、幼蜱、若蜱、成蜱的蛋白进行了分析。SDS-PAGE结果显示,卵出现了7条主带,幼蜱出现了16条主带,若蜱出现了14条主带,成蜱出现了12条主带。它们的蛋白多肽在数量、含量和分子量上存在差异,共同带只有4条,但相邻发育阶段之间的共同带较多。用感染羊血清和免疫羊血清作免疫印迹时,感染羊血清在分子量5.6万处有明显的反应带,免疫羊血清在分子量9.7万处有明显的反应带。     

基于iTRAQ技术的卵巢静止奶牛血清差异蛋白分析

旨在利用iTRAQ技术探究卵巢静止奶牛血清差异蛋白。本试验在奶牛产后60～90 d,根据发情表现、直肠检查和B超检查,按判定标准将试验奶牛分为卵巢静止组(IO)和正常发情对照组(CON),每组50头,采集血清。应用同位素标记绝对定量(iTRAQ)/质谱(MS)联用技术筛选差异蛋白,并应用免疫印迹以及ELISA方法鉴定奶牛卵巢静止血清差异蛋白。结果表明,试验共获得61种血清差异表达蛋白。GO分析表明,生物学过程包括34个注释,分子功能包括15个注释,细胞组成包括13个注释。蛋白质网络互作分析共得到57个节点,68条蛋白互作注释,蛋白质互作富集P<10^-16,得到11个信号代谢通路。经过筛选发现,糖酵解/糖异生、氨基酸的生物合成、胰高血糖素信号通路,维生素的消化与吸收可能与卵巢静止的发生存在相关性。与卵巢静止相关差异表达蛋白共有14种:其中GPX3、SCGB1D和PKM2表达下调,ADIPOQ、AHSG、APOA4、FETUB、ALDOB、SPAM1、LDHB、RBP4、IGFBP2、ITIH3及GLYCAM1表达上调。ADIPOQ、IGFBP2和RBP4通过生殖激素生物过程影响卵泡发育,GPX3通过氧化应激而影响卵泡发育。     

荷斯坦奶牛瘤胃微生物脲酶的分离与鉴定

本研究旨在从荷斯坦奶牛瘤胃中分离活性脲酶。从奶牛瘤胃中收集瘤胃内容物,通过离心和超声破碎的方法得到不含菌体细胞的瘤胃液(CFRF)和瘤胃菌体蛋白液(RCP),利用85%硫酸铵盐析,并透析后,用HiTrap Capto Q离子交换层析柱纯化脲酶。将纯化后的脲酶用活性PAGE分离,并利用改良的Fishbein染色法,确定脲酶条带位置,切胶,经胰蛋白酶消化后,用LC-MS/MS分析,并用SEQUEST软件在NCBI数据库搜索与质谱信号相匹配的肽段和蛋白质。结果表明从CFRF和RCP中分离出较高活性的脲酶,但经染色后只有RCP脲酶显示活性条带。经质谱分析,最终鉴定出了3种微生物来源脲酶,分别与嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)和嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)相似。这说明绕过纯培养微生物,直接从瘤胃中分离脲酶,来研究其性质和来源是可行的,尤其适合对未培养微生物的研究。     

青海血蜱cDNA表达文库的免疫学筛选和阳性克隆的鉴定

为获得抗青海血蜱免疫原基因，用免抗青海血蜱差异蛋白阳性血清和兔抗青海血蜱唾液蛋白阳性血清对青海血蜱cDNA表达文库进行了免疫学筛选，经过初筛和复筛共获得58个阳性信号。用所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25．8使之自动亚克隆为重组质粒，用此亚克隆质粒转化宿主菌JM109并从中提取重组质粒进行PCR、酶切和测序分析。序列分析表明：共获得新cDNA序列21个。将前5个cDNA登录GenBank／ncbi，获取登录号。所获阳性克隆为青海血蜱保护性抗原的筛选奠定了基础。