酵母双杂交技术筛选朊蛋白PrP23-231互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以pSos-PrP23-231载体为诱饵质粒,筛选小鼠脑cDNA文库中能与朊蛋白PrP23-231相互作用的蛋白。通过一次筛选,三次验证,从小鼠脑cDNA文库中得到2个阳性克隆,通过BLAST序列比对得到2个候选基因序列,并对验证后的阳性克隆的外源性片段进行测序及同源性分析,得到的蛋白编码基因可能与朊蛋白存在相互作用,其作用可能与疯牛病发病机制有关。     

应用酵母双杂交技术筛选E种肠道病毒HY12-VP1蛋白的互作蛋白

为筛选E种肠道病毒HY12毒株编码VP1蛋白的宿主互作蛋白,本试验应用PCR技术扩增出HY12病毒VP1蛋白基因的完整序列,并将其克隆到酵母载体pGBKT7中,构建重组诱饵质粒pGBKT7-VP1。将重组质粒转化到酵母菌株AH109中,通过对比重组质粒组和空白质粒组不同时间点的D_(600)值,检测其对酵母细胞的毒性,并把含有诱饵重组质粒的酵母菌涂布在缺陷型培养基上验证其自激活活性。将转有诱饵载体的AH109菌株与表达MDBK细胞的cDNA文库的Y187菌株混合培养,通过缺陷型培养基筛选杂交成功的菌落,并应用序列测定与比对分析和酵母回返试验等方法进行验证。提取阳性菌落的酵母质粒,通过缺陷型培养基及菌液PCR等方法,筛选到12个潜在HY12病毒VP1的互作蛋白,该结果为研究牛肠道病毒(BEV)感染机制及病毒结构蛋白VP1的功能等打下基础。     

酵母双杂交筛选与牛病毒性腹泻病毒NS4B互作的宿主蛋白

为探究NS4B蛋白在牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染和复制过程中的作用,利用酵母双杂交(yeast two hybrid, Y2H)技术筛选与BVDV NS4B蛋白互作的宿主细胞蛋白质。以构建的BVDV NS4B重组质粒pGBKT7-NS4B作为诱饵质粒,采用酵母双杂交技术,与牛肾细胞MDBK-cDNA文库进行杂交。将获得的阳性克隆菌落经质粒抽提、测序分析和免疫共沉淀试验,确定可与NS4B互作的宿主细胞蛋白。结果表明,成功构建了诱饵质粒pGBKT7-NS4B,该质粒可在酵母菌中表达NS4B蛋白。采用酵母双杂交技术从牛肾细胞基因组文库获得14个阳性克隆,阳性克隆经测序、互补试验、免疫共沉淀验证后明确可与BVDV NS4B蛋白互作的宿主蛋白为SYNGR2和RABACI。上述研究为进一步研究BVDV NS4B蛋白在BVDV感染和复制中的作用机制奠定了理论基础。     

非洲猪瘟病毒pE120R蛋白单克隆抗体的制备

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)衣壳蛋白pE120R,并制备单克隆抗体,为其功能研究提供材料。以pCAGGS-Flag-pE120R为模板扩增pE120R基因片段,构建原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达为可溶性pE120R蛋白,采用GST Beads纯化pE120R蛋白,免疫BALB/c小鼠,然后取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA方法筛选获得了1株能够稳定分泌pE120R单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果表明,成功构建了原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R,并获得较高纯度的pE120R蛋白。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果显示,pE120R单抗能特异性识别HEK293T细胞转染质粒表达的Flag-pE120R蛋白和肺泡巨噬细胞(PAMs)感染ASFV后表达的pE120R蛋白。该单抗的结合位点在30～60aa区域,并且该单抗亚类鉴定重链为IgG2a。本研究成功表达并纯化了可溶性的pE120R蛋白;制备了抗pE120R的单抗隆抗体,该抗体具有良好的特异性,为深入探讨AS...     

基于酵母双杂交技术的绒山羊波形蛋白互作蛋白鉴定

为进一步探索波形蛋白(vimentin)调控绒山羊绒毛生长的作用机制,以内蒙古遗传种子资源阿尔巴斯白绒山羊皮肤中的毛囊组织为材料,利用PCR技术和酵母双杂交技术对根据GenBank中山羊的vimentin蛋白序列,运用蛋白质互作在线软件预测和液相色谱质谱联用采集免疫共沉淀数据筛选出肌动蛋白(ACTB)和vimentin进行基因引物设计、克隆、酵母表达载体构建和蛋白互作鉴定。结果显示:成功克隆出绒山羊vimentin基因CDS区序列的长度为1 401 bp, ACTB基因CDS区序列的长度为1 128 bp;构建了酵母表达载体;试验组共转化pGBKT7-vimentin与pGADT7-ACTB的Y2HGold菌株在二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基和四缺板SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-GaL/AbA培养基上,均能生长出淡蓝色菌落,而在对照组共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基上长出白色菌落,表明共转化的pGBKT7-vimentin与pGADT-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac被激活,共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac未被激活。提示:vimentin与ACTB两种蛋白间存在相互作用。     

基于酵母双杂交技术的绒山羊波形蛋白互作蛋白鉴定

为进一步探索波形蛋白(vimentin)调控绒山羊绒毛生长的作用机制,以内蒙古遗传种子资源阿尔巴斯白绒山羊皮肤中的毛囊组织为材料,利用PCR技术和酵母双杂交技术对根据GenBank中山羊的vimentin蛋白序列,运用蛋白质互作在线软件预测和液相色谱质谱联用采集免疫共沉淀数据筛选出肌动蛋白(ACTB)和vimentin进行基因引物设计、克隆、酵母表达载体构建和蛋白互作鉴定。结果显示:成功克隆出绒山羊vimentin基因CDS区序列的长度为1 401 bp, ACTB基因CDS区序列的长度为1 128 bp;构建了酵母表达载体;试验组共转化pGBKT7-vimentin与pGADT7-ACTB的Y2HGold菌株在二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基和四缺板SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-GaL/AbA培养基上,均能生长出淡蓝色菌落,而在对照组共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基上长出白色菌落,表明共转化的pGBKT7-vimentin与pGADT-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac被激活,共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac未被激活。提示:vimentin与ACTB两种蛋白间存在相互作用。     

应用酵母双杂交方法筛选与猪瘟病毒Npro蛋白相互作用的宿主蛋白

为研究猪瘟病毒(CSFV)与宿主细胞间的相互作用,本研究采用酵母双杂交方法以猪瘟病毒Npro蛋白为诱饵,从猪外周血单个核细胞(PBMC) cDNA表达文库中筛选与之相互作用的蛋白,经共转化试验表明,共筛选到12个与Npro蛋白相互作用的宿主蛋白,应用Cytoscape 2.8.2软件绘制了蛋白质间相互作用关系图,根据GO分析结果,这些蛋白分别参与细胞代谢、细胞生长、免疫等过程,经双分子荧光互补(BiFC)试验表明筛得的部分宿主蛋白与CSFV Npro具有相互作用.本研究中筛选得到的蛋白质对CSFV复制的影响有待进一步深入研究.     

非洲猪瘟病毒H240R蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定

为制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)H240R蛋白单克隆抗体,首先构建原核表达质粒pET-29b-H240R,再进行蛋白表达与纯化,随后免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备、间接ELISA方法筛选获得单克隆抗体。结果显示,共获得4株杂交瘤细胞株,腹水效价均高于1∶40 000;亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体(12D6、21G3、8G7)重链亚类为IgG2b, 13D2重链亚类为IgG1,轻链亚类均为k。Western blot和Dot blot鉴定结果表明,21G3、13D2株单克隆抗体识别的抗原表位为线性表位,而12D6和8G7识别的是构象表位。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,4株单克隆抗体均能特异性识别HEK293T细胞中表达的H240R蛋白。制备了ASFV H240R蛋白单克隆抗体,为H240R蛋白的表位和功能研究奠定了基础。     

表达非洲猪瘟病毒p54蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK_（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为10^7.34/0.1 mL和10^7.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒pS273R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒（ASFV） pS273R蛋白,并制备其多克隆抗体,为ASFV pS273R的功能研究提供材料。试验通过大肠杆菌表达系统表达重组pS273R蛋白,采用镍亲和层析柱和分子筛纯化重组pS273R蛋白并免疫BALB/c小鼠制备血清,经Protein G琼脂糖树脂纯化鼠抗pS273R蛋白多克隆抗体,通过Western blotting、间接免疫荧光（IFA）和免疫沉淀试验（IP）分析多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示,在16 ℃、1 mmol/L IPTG诱导条件下,pS273R蛋白以可溶形式高效表达,经纯化并免疫小鼠后,通过Protein G可以纯化出高质量的鼠抗pS273R的多克隆抗体。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting、IFA和IP检测到HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-pS273R蛋白和ASFV感染肺泡巨噬细胞（PAMs）中的pS273R蛋白。本研究在大肠杆菌中实现了ASFV pS273R蛋白的高效表达,制备并纯化的抗pS273R多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,这为深入探讨ASFV pS273R蛋白的生物学功能奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒D250R蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】分析非洲猪瘟病毒（Africa swine fever virus,ASFV） D250R蛋白潜在的生物学功能,制备其多克隆抗体,为ASFV D250R蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】应用生物信息学软件分析D250R蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、生物功能及蛋白结构等。通过大肠杆菌表达系统表达重组D250R蛋白,采用镍亲和层析柱和分子筛纯化重组D250R蛋白,Western blotting检测纯化蛋白的反应原性,将纯化的D250R蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA方法测定多克隆抗体效价,用间接免疫荧光试验（IFA）检测多克隆抗体特异性。【结果】生物信息学分析结果显示,D250R蛋白共由250个氨基酸组成,理论分子质量为29 822.54 u,理论等电点为8.96,为亲水性蛋白,无信号肽及跨膜区。修饰位点预测结果显示,D250R蛋白可能存在15个磷酸化修饰位点,其中丝氨酸（Ser）6个、酪氨酸（Tyr）6个、苏氨酸（Thr）3个;2个N-糖基化修饰位点,分别位于第61和197位氨基酸处。生物学功能预测结果显示,D250R蛋白含有Nudix序列,具有解水解酶活性。蛋白结构预测结果显示,D250R蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲占比分别为49.20%、7.60%、15.20%和28.00%,三维空间结构存在较多α-螺旋,与二级结构预测结果基本一致。将ASFV D250R基因克隆至pET-32a （＋）获得pET-32a-D250R重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16℃、1 mmol/L IPTG诱导下,D250R蛋白以可溶性和包涵体2种形式表达,蛋白大小约44 ku,蛋白上清经镍亲和层析柱和分子筛层析纯化得到纯度较高的蛋白;Western blotting检测结果显示,重组蛋白具有良好的反应原性;间接ELISA检测结果显示,D250R蛋白抗体效价达到1：256 000,成功制备多克隆抗体;IFA检测结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性。【结论】本研究在分子层面分析了D250R蛋白的理化性质及蛋白结构,在大肠杆菌表达系统中实现了ASFV D250R蛋白的高效表达,纯化的D250R蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有较高的特异性,为深入探讨ASFV D250R蛋白的生物学功能及ASFV相关诊断试剂的研发奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p37蛋白生物信息学分析及其多克隆抗体制备

【目的】获取ASFV p37蛋白,并制备抗ASFV p37蛋白的多克隆抗体,为ASFV p37蛋白结构和功能研究提供材料。【方法】应用生物信息学工具对ASFV HLJ/2018(GenBank登录号：MK333180.1)p37蛋白进行分析,设计合成p37基因,并构建pET32a-p37重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE对重组蛋白的可溶性进行分析。收集菌体进行超声破碎,分离沉淀并使用8 mol/L尿素变性后离心,用0.45μm滤膜过滤离心后的上清,使用镍亲和层析柱纯化蛋白,通过SDS-PAGE、Western blotting对其纯化效果及特异性进行验证。将纯化后的p37蛋白按照50μg/只免疫小鼠,制备抗ASFV p37蛋白多克隆抗体。利用间接ELISA方法测定制备的多克隆抗体效价;通过Western blotting、间接免疫荧光试验检测该多克隆抗体的特异性。【结果】生物信息学分析表明,p37蛋白为稳定亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构主要含有α-螺旋(45.28%)、延伸链(15.09%)、无规则卷曲(31...     

非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

试验旨在构建非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）EP153R基因原核表达系统,表达EP153R重组蛋白（rEP153R）,并制备抗rEP153R的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1的EP153R基因序列（GenBank登录号：FR682468.1）合成EP153R基因序列,并将其插入pET-28a载体,构建pET-28a-EP153R重组质粒,经双酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,分别在16和37 ℃条件下经IPTG诱导12 h进行最适诱导温度筛选。在最适温度下进行重组蛋白的表达,并利用SDS-PAGE、Western blotting进行初步鉴定。切取SDS-PAGE蛋白胶25 ku处条带,利用液相色谱－质谱联用技术鉴定重组蛋白是否正确表达。用纯化的rEP153R免疫小鼠,制备抗rEP153R的多克隆抗体,通过间接ELISA检测其抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果显示,重组菌在16 ℃表达量较高,并以包涵体形式表达,产物在25 ku处出现明显的条带,与预期蛋白大小相符,表明rEP153R成功表达。液相色谱－质谱联用技术鉴定结果显示,匹配到YIGLINK、NESVLLR和KYIGLINK 3个rEP153R的特异性肽段,证实该蛋白为rEP153R。间接ELISA检测多克隆抗体效价为1∶128 000;Western blotting结果显示,制备的抗体具有较好的特异性。以上结果表明本研究成功表达了rEP153R,并制备了其特异性抗体,为进一步研究该蛋白生物学功能、非洲猪瘟活载体疫苗鉴定等提供了技术支持和材料。     

非洲猪瘟病毒K205R蛋白基因原核表达的研究

本研究合成非洲猪瘟的K205R基因,将K205R基因克隆至pET-30c(+)质粒,构建重组原核表达质粒pET30C-K205R。该重组质粒的阅读框架正确,表达的融合蛋白的N端和C端均带6×组氨酸。pET30C-K205R-BL21菌株经培养和诱导表达后,可生产K205R可溶性蛋白,K205R可溶性蛋白可用Ni柱纯化。纯化表达K205R蛋白的ELISA试验证明,表达的K205R蛋白与猪阳性非洲猪瘟血清具有较好的特异性反应。     

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

非洲猪瘟病毒的分子病原学及致病机理研究进展

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种烈性传染病,具有急性、高热、高病死率等特征,主要暴发于非洲、东欧国家、俄罗斯及高加索地区。目前,该病缺乏有效的疫苗和治疗方法,给病情爆发地区的养猪业造成严重的影响。ASFV的主要靶细胞是网状内皮细胞和单核-巨噬细胞,造成细胞凋亡,影响宿主的免疫系统,进而表现出相应的疫病特征。ASFV具有基因组较大、基因型较多且易变异等特征。文章主要从分子病原学和致病机理方面对ASFV的研究情况进行综述,为ASF的防控提供理论依据。     

Research Progress on Molecular Etiology and Pathogenesis for African Swine Fever Virus

African swine fever (ASF) is a devastating disease caused by African swine fever virus (ASFV), characterized by acute feature, high fever, high mortality and other characteristics. ASF mainly outbreaks in African, Eastern Europe countries, Russia and Caucasus region. At present, there are no vaccine available and effective control strategies against ASFV spread, therefore, ASF has a serious impact on the pig industry in the affected countries. The major target cells of the virus are swine reticuloendothelial cells and monocyte-macrophage cells. ASFV can result in apoptosis and affect the host's immune system, and then show the characteristics of the corresponding disease. ASFV has the characteristics of large genome, more genotype and more variability. In this paper, the molecular etiology and pathogenesis of ASFV are reviewed, so as to provide theoretical basis for prevention and control of ASF.