WGCNA鉴定奶山羊妊娠至泌乳期乳腺发育关键基因

旨在通过加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）筛选奶山羊不同生理阶段乳腺发育的关键基因。本研究从GEO数据库中下载奶山羊不同生理阶段（妊娠46天、70天、90天、110天和产后40天）的乳腺组织微阵列数据集GSE14008，使用R语言的WGCNA包对数据进行共表达分析。将得到的模块与生理阶段进行关联分析，选择目标模块，并根据连接度选出枢纽基因。使用DAVID网站对模块进行富集分析后，使用String网站构建模块的蛋白互作网络，并使用Cytoscape软件得到核心基因，最终与枢纽基因取交集得到目标基因。对18个样本的8 443个基因进行加权基因共表达分析，得到30个模块，并选出4个与不同生理阶段相关的目标模块及每个模块的30个枢纽基因，同时也得到4个模块的蛋白互作网络及每个网络的20个核心基因。最终，4个模块共得到13个与乳腺发育相关的目标基因（UQCR、RGL2、NOTCH1、PTBP1、PPP5C、FZR1、UBE2L3、TNF、MAT2A、ITGB2、GPR18、JAK1、CSN2）。本研究通过WGCNA、GO富集分析和PPI网络等生物信息学技术，阐明了不同生理时期乳腺发育的关键过程，及在这些过程中起关键作用的基因，这为进一步研究乳腺发育机制提供了新的思路和线索。     

基于转录组学分析自然感染绵羊肺腺瘤病毒患羊肺肿瘤组织中转录差异基因及病毒致瘤机制的研究

绵羊肺腺瘤病(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的绵羊传染性肺肿瘤疾病。为探究JSRV对绵羊肺脏的致瘤机制,本研究从自然感染JSRV的羊(OPA患羊)肺肿瘤组织和健康羊肺组织中提取总RNA,构建二者的cDNA文库后采用Illumina Hi Seq 4000高通量测序平台进行转录组学测序(RNA-Seq),采用DESeqR筛选健康绵羊与患病绵羊肺组织中的转录差异基因,并以P<0.05和log2(Fold change)≥1筛选转录显著差异基因。通过GO和KEGG数据库对转录显著差异基因进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析,并采用RT-qPCR对随机选择的10个转录显著差异基因进行验证。结果显示,与对照组相比,OPA羊肺肿瘤组织中共筛选到1 360个转录上调基因和783个转录下调基因,其中154个转录显著上调基因,212个转录显著下调基因。GO功能分析显示,转录显著差异基因显著富集在178个GO条目中,包括114个生物过程(BP)、19个细胞成分(CC)和45个分子功能(MF),主要涉及生长因子活性、复制后修复、NAD⁺二磷酸酶活性、核苷代谢过程和...     

利用加权基因共表达网络分析筛选天农麻鸡胴体性状候选基因

旨在通过转录组测序(RNA-Seq)与加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)筛选慢速型黄羽肉鸡天农麻鸡胴体性状相关候选基因。本研究以104只天农麻鸡为素材,在126日龄时进行屠宰,测定胸肌重等7个胴体性状,采集胸肌组织进行RNA-Seq。基于RNA-Seq数据获得基因表达矩阵后,结合表型进行WGCNA分析,确定目标模块,筛选目标模块的枢纽基因,并分别进行KEGG通路富集、蛋白质互作网络(protein-protein interaction network,PPI)构建和相关性分析。104份胸肌组织RNA-Seq质控后获得15 092个基因的表达量。与胴体表型进行WGCNA,共得到19个模块,其中4个模块与胴体性状极显著相关。功能富集结果表明,目标模块内基因主要富集在ECM-受体相互作用、黏着力等通路。以|Module membership|> 0.8、|Gene significance|> 0.2为标准筛选到58个枢纽基因,并通过PPI网络构建鉴定到5个网络节点基因,整合相关性分析确定COL1A2和SPARC为最重要候选基因。本研究通过大样本量转录组分析,发现ECM-受体相互作用等通路在天农麻鸡胴体性状调控中发挥主要作用,筛选到COL1A2和SPARC是影响全净膛率性状的重要候选基因,研究结果为鉴定选育分子标记,解析胴体性状分子机制奠定理论基础,为慢速型黄羽肉鸡育种提供重要参考。     

绵羊FSHR基因生物信息学分析及其器官表达规律研究

为了验证及进一步研究促卵泡素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)基因在绵羊繁殖力中的作用机制,试验采用生物信息学方法分析了绵羊FSHR基因结构、FSHR蛋白性质和结构、同源性、遗传进化、信号通路、蛋白互作网络和器官表达规律。结果表明:绵羊FSHR DNA全长196 149 bp,而编码蛋白质的mRNA序列全长只有2 431 bp,FSHR基因含有10个外显子;FSHR基因编码695个氨基酸,FSHR蛋白属于不稳定的脂溶性蛋白;FSHR蛋白是有7个跨膜结构的膜受体,包含LRR_5、GnRH_trans、7tm_1三种功能结构域,这三种结构域分别行使不同功能,共同激活G蛋白偶联机制,激活腺苷酸环化酶,使细胞内CAMP或Ca~(2+)内流增加,从而对细胞的生命活动进行调节;FSHR基因不但与繁殖相关基因Gdf9、Bmp15有关,还与抑制肿瘤转移基因Kiss1有关;FSHR的同源性分析和进化树构建结果显示,绵羊和山羊亲缘关系最近,其次是牛,与斑马鱼亲缘关系最远;FSHR基因在绵羊睾丸和卵巢中特异性高表达,并在各物种间的表达具有一致性。说明FSHR基因表达可能受内含子极为复杂和重要的调控,且在繁殖中起重要作用。该基因在睾丸中特异性高表达,与促卵泡生成素(FSH)对雄性动物曲细精管的发育、成熟和精子生成作用相吻合。     

人工感染沙门菌牦牛脾中相关差异表达基因筛选

旨在从基因组转录水平解析牦牛抗沙门菌感染相关免疫基因及其调控网络。以牦牛沙门菌为模式病原体,以牦牛为研究对象,在12、24、48h三个不同时间段利用RNA-Seq测序技术对感染牦牛的外周免疫器官脾进行转录组测序。通过比较分析三个时间段感染牦牛和健康牦牛转录组数据,筛选出差异基因,然后对这些差异基因进行GO、KEGG功能分析,并进行共表达网络分析。结果共筛选出413个差异基因,其中185个表现为上调,228个表现为下调,GO分析显示,与生物过程相关的类别比例最大,其中最为富集的是细胞过程、代谢过程、生物调节、生物过程的调控及单一有机体过程。KEGG分析显示,各时间段富集前20的通路中,与感染、免疫相关的通路占有较大比例,这些通路涉及的差异基因主要为趋化因子。WGCNA分析显示,处于网络枢纽的基因共66个,处于网络中心的基因是SCOC和NOCT。本研究在组学层面上探讨了牦牛脾细胞与沙门菌的分子互作机制。     

3个候选miRNA在不同光周期绵羊垂体中的表达及潜在功能预测

季节性发情是限制肉羊生产效率的重要因素，然而，当前绵羊季节性发情的分子机制尚未解析。本研究旨在对季节性发情3个候选调控因子(oar-miR-127、oar-miR-200a和oar-miR-200b)进行表达水平及潜在功能分析，以探索其在绵羊季节性发情中的调控作用。根据序列信息对3个miRNA进行了靶基因预测，构建了miRNA-mRNA互作网络，并对靶基因开展了功能富集分析；利用qRT-PCR技术检测了oar-miR-127、oar-miR-200a、oar-miR-200b和共同靶基因在长短光照周期转换过程的表达水平。结果表明，oar-miR-127、oar-miR-200a和oar-miR-200b可分别靶向2 890、534个和451个靶基因，三者与靶基因形成了复杂的互作网络；这些靶基因显著富集到基因表达的昼夜节律调节等生物过程及胰岛素、甲状腺激素和GnRH等繁殖相关信号通路；3个miRNA在光周期转换过程中均呈现下调的表达趋势(在SP21高表达，在LP21低表达)，靶基因与3个miRNA呈相反的表达趋势，暗示其可能受到miRNA的负调控。以上结果说明oar-miR-127、oa...     

绵羊不同妊娠时期卵巢转录组差异表达比较分析

[目的]探究随着绵羊体内胎儿的发育,母体卵巢转录组表达水平的变化。[方法]试验绵羊为苏格兰黑面羊和特克赛尔羊F₁代杂交品种,3个妊娠时间分别为妊娠23 d、妊娠35 d和妊娠100 d。从NCBI的高通量测序数据SRA存储库下载3个妊娠时期绵羊卵巢转录组的18个样本数据。使用Z-Score方法对转录组数据进行标准化处理。将妊娠23 d、妊娠35 d的绵羊卵巢组织进行比对,妊娠35 d、妊娠100 d的绵羊卵巢组织进行比对,使用R语言的limma包进行基因差异表达分析,筛选DEGs,以P-Value<0.05和|logFC|≥2作为筛选DEGs条件。利用DAVID在线软件对DEGs进行注释及功能富集分析,并以P-Value<0.05作为信号通路显著富集标志。[结果]在妊娠23 d与妊娠35 d组绵羊卵巢中筛选出54个DEGs,妊娠35 d与妊娠100 d组绵羊卵巢中筛选出68个DEGs,两组均包含HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2和HSP90B1基因。妊娠23 d与35 d组绵羊卵巢的54个DEGs显著富集到包括内质网蛋白质加工信号通路、核糖体信号通路、雌激素信号通路、癌症蛋白聚糖信号通路、扩张型心肌病信号通路、肥厚型心肌病信号通路6条通路;妊娠35 d、妊娠100 d组绵羊卵巢的68个DEGs显著富集到包括癌症相关信号通路、黏着斑信号通路、抗原加工与提呈信号通路、细胞外基质受体相互作用信号通路、细菌侵袭上皮细胞信号通路、内质网蛋白质加工信号通路、核糖体信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt信号通路、癌症蛋白聚糖信号通路和前列腺癌信号通路11条通路。[结论]在妊娠期间雌激素信号通路上的HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2和HSP90B1基因表达有很大变化,这些基因可能对绵羊妊娠维持有着重要的作用。     

利用蛋白互作网络分析鸡热应激反应的分子机制

为深入探讨鸡热应激反应过程的分子机制,研究尝试利用蛋白互作网络分析鸡的脑组织、肝组织、腿肌组织的差异表达基因。结果发现:脑组织差异基因互作网络包含52个基因及124个互作,肝脏组织包含201个基因及466个互作,腿肌组织包含99个基因及131个互作,且不同组织的互作基因分别富集到不同的生物学功能中,例如细胞死亡、核酸绑定,细胞骨架等。进一步比较三个组织的蛋白互作网络,发现不同组织的交集网络包含大量的细胞骨架相关基因(脑与肝脏组织交集)、细胞外基质基因(脑与腿肌组织交集)、次级代谢相关以及核酸绑定相关基因(肝脏与腿肌组织交集)。研究还发现,HSPH1与BAG3的蛋白互作在三种组织中均存在。以上结果说明细胞死亡、细胞骨架以及核酸绑定等生物学功能以及相关基因在鸡热应激过程中具有重要作用。     

鸡MBL2基因生物信息学分析及组织表达

为了研究鸡甘露聚糖结合凝集素的特征与功能，本试验通过PCR技术扩增莱航鸡MBL2基因序列，并通过生物信息学软件分析鸡MBL2基因的基本特征，并预测其功能、构建蛋白互作网络；构建真核表达载体并注射小鼠，在小鼠肝脏中进行瞬时表达；制备多克隆抗体，采用免疫组织化学技术，检测MBL-C蛋白在鸡体内的组织分布。结果显示，莱航鸡MBL2基因全长765 bp，编码254个氨基酸；MBL-C蛋白分子式为C₁₁₉₂H₁₉₂₇N₃₃₃O₃₇₉S₁₃，具有信号肽；蛋白分子结构由α螺旋、β转角、延展链以及无序结构构成；进化分析显示鸡MBL2蛋白符合生物进化规律；富集分析显示该蛋白参与补体活化过程，组成细胞外区域，与内肽酶及水解酶活性有关；蛋白互作网络显示MASP1/2、LOC418892等蛋白与MBL2有互作关系；免疫组化结果证实鸡MBL-C蛋白主要由肝脏分泌，其表达量随日龄增加升高。     

藏绵羊PRDX5基因的克隆及其在睾丸中的表达

过氧化物氧化还原酶5 (PRDX5)是一种硫氧还蛋白,参与机体多种生物学过程。为了研究PRDX5基因在藏绵羊(Ovis aries)睾丸发育和精子发生过程中的作用,本研究以不同发育阶段(3月龄、1周岁和3周岁)的藏绵羊为研究对象,克隆了PRDX5基因的CDS区,并对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot和免疫组织化学染色法,对PRDX5基因在藏绵羊睾丸不同发育阶段的表达和分布进行了检测。结果显示,PRDX5基因CDS区全长659 bp,可编码219个氨基酸;蛋白质结构预测显示PRDX5以α-螺旋为主,无信号肽;系统进化树显示,藏绵羊PRDX5基因与山羊(Capra hircus)亲缘关系最近;1周岁(性成熟期)和3周岁(成年)藏绵羊睾丸中PRDX5 mRNA相对表达量极显著(P <0.01)高于3月龄(性成熟前),但PRDX5蛋白表达量极显著(P <0.01)低于3月龄,且两者在性成熟后趋于稳定;PRDX5蛋白在藏绵羊睾丸不同发育阶段的支持细胞和间质细胞中均有表达。推测PRDX5基因可能通过调节细胞内ROS的水平影响精子发生...     

利用中芯一号SNP芯片检测隆林猪全基因组拷贝数变异

【目的】检测隆林猪的全基因组拷贝数变异。【方法】采集33头隆林猪的耳组织样本,通过酚-氯仿法提取DNA后,使用猪中芯一号50K SNP芯片进行基因分型,得到的原始数据通过Genomestudio软件和Linux系统进行处理,使用CNVPartition和PennCNV软件分别检测拷贝数变异(copy number variation, CNV),并利用Bedtools软件将CNV合并为拷贝数变异区域(copy number variation region, CNVR),使用Biomart对CNVR进行基因定位,利用David网站对定位到的基因进行GO和KEGG富集分析,使用猪QTL数据库对共同CNVR进行QTL注释。【结果】CNVPartition软件共检测到260个CNVs,合并为47个CNVRs,其中缺失型40个、获得型5个、混合型2个,共定位到84个基因,显著富集到13条信号通路;PennCNV软件共检测到96个CNVs,合并为15个CNVRs,其中缺失型9个、获得型1个、混合型5个,共定位到8个基因,显著富集到8条信号通路;2个软件检测结果定位到的基因主要富集在嗅觉相关通路和...     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。     

中华蜜蜂GABARAP基因克隆、生物信息学分析及原核表达载体的构建

【目的】对中华蜜蜂(Apis cerana cerana)中自噬相关蛋白Atg8家族成员γ-氨基丁酸相关受体蛋白(gamma-aminobutyric acid receptor type associated protein, GABARAP)基因进行克隆鉴定和生物信息学分析,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,以期为后续探究该基因的功能奠定基础。【方法】根据GenBank中西方蜜蜂(Apis mellifera)GABARAP基因序列(登录号:XM₀01120069.5)设计引物,采用巢式PCR对中华蜜蜂GABARAP基因进行扩增、克隆;运用生物信息学软件对其氨基酸序列相似性、二级结构、三级结构进行比对和预测分析;构建GABARAP基因原核表达载体,利用Western blotting对GABARAP蛋白进行鉴定后并用IPTG诱导纯化。【结果】经巢式PCR扩增得到中华蜜蜂GABARAP基因序列;使用在线BLAST工具对氨基酸相似性进行分析显示,中华蜜蜂GABARAP与西方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂、东方熊蜂的氨基酸序列相似性为100%;...     

高效液相色谱法测定巴氏杀菌乳中糠氨酸含量的不确定度评定

目的 对高效液相色谱法测定巴氏杀菌乳中糠氨酸含量的不确定度进行评定。方法 依据《NY/T939—2016 巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》测定巴氏杀菌乳中糠氨酸的含量。通过建立数学模型,全面分析试验过程中各不确定度的来源,并对其进行量化评定,计算合成相对标准不确定度和扩展不确定度。结果 当牛奶中糠氨酸含量为7.3 mg/100 g 蛋白质时,测量结果的扩展不确定度为0.4 mg/100 g蛋白质（k=2）。结论 方法中测量不确定度的主要来源为糠氨酸标准物质称量、标准工作液的配制、标准曲线的拟合和样品水解液中蛋白质含量测定终点判定。     

绿色荧光蛋白的真核表达及其单克隆抗体制备

【目的】构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox virus, rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体。【方法】首先合成3′-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV(SWPV-JX20G株)同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His。重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定。【结果】PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色。EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体...     

白藜芦醇对体外培养的水牛卵丘细胞增殖活力及其相关基因mRNA表达的影响

【目的】研究白藜芦醇(resveratrol, RES)对水牛卵丘细胞体外培养过程中细胞增殖活力、激素分泌、卵丘扩展及抗凋亡和抗氧化能力的影响。【方法】用不同浓度(0(对照组)、1、10、20、30、40、50和60μmol/L)RES培养卵丘细胞,用CCK-8试剂盒测定细胞增殖活力,筛选最佳RES处理浓度及时间用于后续试验。用ELISA法测定培养液中卵丘细胞分泌的雌二醇(estradiol, E₂)和孕酮(progesterone, P₄)的含量,实时荧光定量PCR法测定卵丘细胞扩展、凋亡和抗氧化相关基因的相对表达量。【结果】与对照组相比,在体外培养24～36 h内,1、10和20μmol/L RES组水牛卵丘细胞的增殖活力均有升高趋势,10μmol/L RES处理36 h细胞活力最强,因此用于后续试验中细胞的处理。体外培养36 h时,10μmol/L RES组细胞增殖能力和E₂、P₄的分泌显著增加(P<0.05);10μmol/L RES组卵丘细胞扩展相关基因穿透素3(PTX3)、前列腺素...     

广灵驴FTO基因克隆、序列分析及组织差异表达

【目的】对广灵驴脂肪和肥胖相关基因(fat mass and obesity-associated gene, FTO)进行克隆及序列分析,同时检测其在广灵驴各组织中的表达差异,以探究广灵驴FTO基因结构对其生理代谢功能的影响。【方法】运用RT-PCR技术扩增并克隆广灵驴FTO基因CDS序列,进行基因及蛋白质功能分析,同时运用实时荧光定量PCR方法检测FTO基因在广灵驴7种组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌及皮下脂肪)中的差异表达。【结果】广灵驴FTO基因CDS区序列长1 518 bp,编码505个氨基酸,序列提交至NCBI,登录号:MZ169553。广灵驴FTO基因与马、猪、牛、人、羊驼、绵羊和山羊的相似性为99.3%、90.3%、89.5%、90.8%、90.7%、89.2%和89.2%;系统进化树分析发现,广灵驴与马的亲缘关系最近。FTO蛋白分子质量为58.35 ku,理论等电点为5.07,脂肪系数为80.36,不稳定系数为48.82,平均疏水指数为-0.550,为不稳定的酸性亲水蛋白。FTO蛋白无信号肽和跨膜区,主要定位于细胞质中,具有34个磷酸化位点与5个糖基化位点...     

有机酸肠道调节剂对奶牛产奶量、采食量和主要DHI指标的作用效果研究

目的 为研究有机酸肠道调节剂对奶牛产奶量、采食量和主要DHI 指标的作用效果。方法 选择388 头泌乳母牛,根据体重、产奶量、泌乳天数,按照随机区组设计分为两组,1组为对照组（日粮不添加肠道调节剂）、2组为试验组（日粮中每头每天添加48 g有机酸为主要成分的肠道调节剂）。结果 试验组比对照组产奶量平均提高了1.1 kg/d·头（P<0.05）,干物质采食量平均增加0.84 kg/d·头（P<0.05）,乳脂肪含量增加0.20 个百分点（P<0.05）,乳中脂蛋比显著高于对照组（P<0.05）,对乳蛋白含量、体细胞计数（万个/mL）、体细胞评分、乳尿素氮含量无影响。结论 在日粮中添加有机酸肠道调节剂能够提高奶牛产奶量、干物质采食量和乳中脂肪含量。     

非洲猪瘟病毒360-12L蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】获得抗原性好的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。【方法】根据GenBank ASFV参考序列(登录号:NC₀44959.2)合成360-12L基因,并插入pET-28a(+)载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将经测序鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导培养,筛选最佳诱导温度,同时分析其可溶性。随后通过亲和层析纯化蛋白,并对所获得的12L重组蛋白进行SDS-PAGE分析。将获得的12L重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以获得鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定所制备的多克隆抗体效价,并用间接免疫荧光试验进行验证。【结果】成功构建了ASFV 12L蛋白原核表达质粒,重组菌pET-28a-12L-BL21在37℃6 h时表达量较高,主要以包涵体形式表达,可在54.7 ku处出现明显条带。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体效价>1∶512 000,间接免疫荧光试验结果表明,所制备的...     

丝状支原体山羊亚种LPPA蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】建立基于丝状支原体山羊亚种(Mmc)膜脂蛋白LPPA的间接ELISA方法。【方法】扩增Mmc LPPA基因并将其克隆至pCold-Ⅰ载体,构建重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,测序鉴定正确后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经IPTG诱导表达后纯化得到Mmc LPPA重组蛋白,采用SDS-PAGE验证该重组蛋白是否表达,并采用Western blotting和传统经典的琼脂扩散血清学试验分析其与Mmc阳性血清的反应原性。以该重组蛋白为包被抗原,建立Mmc重组LPPA蛋白的间接ELISA抗体检测方法,对该方法进行反应条件优化后开展特异性、重复性试验,并将其初步应用于184份山羊血清样本。【结果】通过PCR扩增得到Mmc LPPA基因,成功构建了重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,经诱导表达后得到Mmc LPPA重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,获得了大小约23 ku的LPPA重组融合蛋白;琼脂扩散及Western blotting试验证明该蛋白反应原性良好。ELISA方法反应条件优化结果显示,LPPA抗原蛋白的包被浓度为2.0μg/100μL,血清稀释度为1∶300,3%BSA封闭...