乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立

本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法.优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×10⁸ CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理方案.结果表明,qPCR检测可特异性扩增大肠杆菌,1×10⁸ CFU/mL的大肠杆菌经90 ℃水浴30 s全部致死后,采用10 μg/mL的 PMA暗孵育15 min后冰上曝光10 min为最佳处理方案,这种处理方案可最大程度抑制死细胞信号,而对活细胞几乎没有影响,样品中微生物初始浓度不低于1×10⁸ CFU/mL时较稳定,得到标准曲线回归方程y=-3.356x+47.413,R²=0.9989,最低检测限为10³ CFU/mL,加标样本检测结果与实际相符.该方法为利用PMA-qPCR检测食品中的活大肠杆菌杆菌奠定了基础.     

PMA-PCR诊断技术研究进展

叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）是一种光反应的DNA结合染料,具有极高的DNA亲和结合能力。PMA可进入死亡和外膜损伤严重的微生物内部,插入DNA结构中,经可见光刺激发生光裂解后,同DNA结合发生共价交联反应,共价交联产物可以抑制DNA的PCR扩增。基于PMA的这一特性,PMAPCR可用于鉴别活死细菌、真菌、病毒等微生物。在实际应用中,PMA-PCR检测结果受样本浊度、活死微生物比例、PMA浓度、暗处理条件（温度、暗处理时间）、曝光条件（光源、光处理时间）、样本处理方法以及目的基因扩增长度等多种因素影响。PMA-PCR已被应用于动植物疫病防控、食品安全、公共卫生等多个领域,具有广阔的应用前景。     

山羊伪结核棒状杆菌PMA-PCR检测方法的建立

本试验旨在建立伪结核棒状杆菌的活菌检测方法,为临床检测及疫病防控提供理论依据。利用PMA可选择性穿透死菌细胞膜,在强光作用下与死菌DNA共价交联,阻止以其DNA为模板的PCR扩增这一原理,将PMA与PCR鉴定相结合,并对PMA最佳曝光时间、最适工作浓度进行优化,建立伪结核棒状杆菌PMA-PCR活菌检测方法,并对其特异性进行分析。结果表明最佳曝光时间为15 min,PMA能够完全抑制死菌PCR扩增的最低浓度为20μmol/L,不抑制活菌PCR扩增的最大PMA浓度为30μmol/L。特异性试验结果显示,仅伪结核棒状杆菌可扩增出目的条带,而在链球菌、多杀性巴氏杆菌中未扩增出目的条带。对不同比例的死/活菌检测发现,该方法可以有效针对活菌进行检测,活菌的最低检测浓度为1×104 cfu/mL。本研究为伪结核棒状杆菌的活菌检测提供了一定的理论依据,也为由伪结核棒状杆菌诱发的山羊疫病防控奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒多重PMA-qPCR检测方法的建立及应用

本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合，建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针，建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示，本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性，与其他常见猪病毒性原无交叉反应；同时，该方法具有较高灵敏度，p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为10²copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷，本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时，PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响；对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知，两者的灵敏度均为10² copies/μL;将多重PMA-q...     

3种死菌悬液制备方法对PMA-qPCR结果的影响

本试验利用热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法3种制备结核分支杆菌死菌悬液的方法,比较不同灭菌方法制备的死菌对PMA-qPCR偶联技术结果的影响,选择结核分支杆菌死菌悬液的最佳制备方法制备后续试验中用到的结核分支杆菌死菌;探索PMA-qPCR偶联技术的适用范围和局限性.结果表明,热灭活法和超声裂解致死法制备的结核分支杆菌死菌悬液影响PMA-qPCR检测的Ct值的变化;紫外线照射法制备的结核分支杆菌死菌悬液对PMA-qPCR检测的Ct值没有影响;热灭活法是制备结核分支杆菌死菌悬液的最佳方法;PMA-qPCR偶联技术不适用于细胞膜无损伤致死法制备死菌的检测.     

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。     

EMA与PCR结合检测大肠杆菌O157方法的研究

为了建立1种快速检测样品中大肠杆菌O157并能区分死细菌与活细菌的检测方法,将叠氮溴化乙锭(EMA)与PCR结合,以O157特有的抗原基因rfbE为靶基因,以O157的纯培养物为模板扩增,进行灵敏度、特异性、曝光时间及最佳EMA浓度筛选实验。结果显示:该检测方法的灵敏度为1.2×102CFU/mL,最佳曝光时间为1 min。终浓度≥1μg/mL的EMA,能有效抑制O157死菌的扩增,而当EMA终浓度≤16μg/mL时对活菌靶基因的扩增没有明显的抑制作用。EMA-PCR能有效减少O157活菌检测过程中假阳性结果的出现。     

叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR测定布鲁氏菌活菌数方法的建立

为简便、快速测定宿主体内或细胞内布鲁氏菌的活菌数,本研究以布鲁氏菌单拷贝bcsp31基因为检测靶标,设计特异性引物,经优化反应条件及叠氮溴化丙锭(PMA)最佳使用浓度与曝光时间,建立了一种测定布鲁氏菌活菌数的叠氮溴化丙锭--荧光定量PCR方法(PMA-qPCR),并评估了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,建立的qPCR标准曲线Ct值与质粒标准品拷贝数对数值之间线性关系良好;特异性试验结果显示,该方法对布鲁氏菌S2株扩增结果为阳性,对大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌扩增结果均为阴性;其对布鲁氏菌S2的检测限为10~3cfu/mL,比常规PCR方法敏感性高100倍;重复性试验结果显示,批间及批内重复试验的变异系数均为0.63%～2.04%,重复性好。利用该方法对不同比例布鲁氏菌S2活菌/死菌混合样品定量测定,结果显示随活菌比例的增大,测得的活菌数与常规qPCR测定值越接近,表明经优化处理的PMA有效抑制了qPCR对死菌DNA的扩增,但对活菌的qPCR扩增无影响。将该方法与平板计数法共同测定TSB纯培养的布鲁氏菌S2活菌数,结果二者的测定值无统计学差异。随后利用这两种方法同时测定两种不同浓度的S2侵染巨噬细胞后的胞内活菌数,结果显示两种方法测定值虽然均差异显著(p0.05),但测得的活菌数均在一个数量级且变化趋势一致,并均与侵染的活菌数呈正相关。上述结果表明,本研究建立的PMA-qPCR检测方法可以对布鲁氏菌活菌实现快速定量检测,为布鲁氏菌活菌数测定相关研究提供可行技术。     

肠毒性大肠埃希菌肠毒素LTa基因特异性EMA-PCR检测方法的建立

由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,为避免因样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,本研究根据肠毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素LTa基因设计特异性引物,利用叠氮溴乙锭(EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法。肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200均能扩增出大小为438bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。经EMA处理,除了完全死菌组外,含有10mL/L～1 000mL/L活菌的混合悬液均可扩增出目的片段。因此,成功建立了一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法,该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性,灵敏度可达19cfu/mL。     

实验条件下山羊绒洗净因素对口蹄疫病毒的影响

模拟我国和蒙古国洗净羊绒企业山羊绒洗涤工艺,进行了不同的洗涤水温及作用时间、不同的烘干温度及作用时间对口蹄疫病毒灭活作用的检测。结果表明,水温在64℃以下处理60min不能灭活羊绒中的口蹄疫病毒NM-zg99毒株,65℃处理60min、66℃处理45min、75℃处理10min、80℃处理5min能灭活羊绒中的口蹄疫病毒;高温烘干对羊绒中口蹄疫病毒的灭活与温度和作用时间密切相关,70℃处理约35min、75℃处理约25min能灭活口蹄疫病毒,80～90℃处理20min、95～105℃处理15min、110℃处理10min能使口蹄疫病毒失活。该试验结果为我国制定进口洗净毛、绒检验标准提供了参考数据,并对洗净羊绒企业改进羊毛、绒洗涤工艺具有指导意义。     

灭菌乳中活阪崎肠杆菌PMA-PCR检测方法的建立

In order to detect viable Enterobacter sakazakii in pasteurized milk，a new method was established by combination of propidium monoazide （PMA） and polymerase chain reaction （PCR）.PMA concentration and exposure time were optimized to find optimal conditions for distinguishing between dead and viable E.sakazakii. The results showed that to kill the viable E.sakazakii must be exposed to 100 ℃ for 20 min in water bath. The optimum light exposure time to intercalate the DNA of dead E.sakazakii and to photolyze the free PMA in solution was 15 min. The minimum concentration of PMA to completely inhibit the PCR amplication of dead bacterium was 5 μg/mL. The maximum concentration of PMA did not inhibit the PCR amplification of viable bacterium was 15 μg/mL. After PMA treatment，viable E.sakazakii in a mixture containing different proportions of dead and viable bacterium could be selectively detected by PCR，and the determination limit was 40 CFU/mL. In the pasteurized milk，the determination limit was 100 CFU/mL. This study laid a foundation for use of PMA-PCR to detect the E.sakazakii in the food.     

Establishment of a Duplex TaqMan Real-time PCR Method for Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus Types 1 and 2

【Objective】 This study was aimed to establish a duplex TaqMan Real-time PCR method for rapid detection of Bovine viral diarrhea virus types 1(BVDV1) and 2(BVDV2).【Method】 Specific primers were designed based on the 5'-non-coding region of 95 strains of BVDV1 and BVDV2 in GenBank.The positive plasmids containing the target fragments of BVDV1 and BVDV2 were constructed.The reaction conditions were optimized, the standard curve was constructed, the specificity, sensitivity and reproducibility of the duplex TaqMan Real-time PCR method were tested, and the established duplex TaqMan Real-time PCR assay was used to detect the clinical samples collected from Jilin province.【Result】 The results showed that the optimal annealing temperature of the duplex TaqMan Real-time PCR was 57.0 ℃, the optimum primer concentration was 0.5 μmol/L, and the optimum probe concentration was 0.3 μmol/L.The standard curves of BVDV1 and BVDV2 were Y=-3.54X+37.36 (R²=0.990) and Y=-3.18X+35.95 (R²=0.997), respectively.There was no specific amplification of Infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV), Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) and Bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3), with intra- and inter-batch CV less than 3%, and the lower limit of detection was 10 copies/μL.The results of clinical samples showed that the overall positive rate was 23.1% (36/156), of which 17.9% (28/156) were positive for BVDV1 and 5.1% (8/156) were positive for BVDV2.【Conclusion】 In this study, a duplex TaqMan Real-time PCR method was established, which could identify BVDV types 1 and 2 simultaneously, quickly and accurately, and provided technical support for the prevention, control and purification of BVDV.     

基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72（p72s）蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5 000;反应条件为：抗原于37 ℃孵育1 h后经4 ℃包被酶标板过夜、于37 ℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37 ℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为：当待检血清的D_{450 nm}值≥0.365时,判定为阳性;当D_{450 nm}值＜0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量（0.110~0.554 mg/mL）;批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%（94/124）和32.26%（40/124）。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。     

非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具...     

犬轮状病毒单克隆抗体制备及胶体金试纸条检测方法的建立

【目的】研发犬轮状病毒(Canine ratavirus, CRV)免疫学诊断试剂,制备并鉴定CRV特异性单克隆抗体,建立可用于检测CRV的胶体金免疫层析法。【方法】以CRV临床分离株SL006株为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,用杂交瘤细胞法进行细胞融合,通过间接免疫荧光法(IFA)筛选可稳定分泌CRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并制备腹水,亲和层析法进行纯化获得单克隆抗体。对获得的单克隆抗体进行鉴定,经条件优化建立胶体金试纸条检测方法,对试纸条的灵敏度、特异性、重复性和应用情况进行评价。【结果】获得了4株杂交瘤细胞,分别命名为2C12、4A5、1H3、5F3,IFA效价分别为1∶6 400、1∶12 800、1∶1 600和1∶3 200;重链亚类分别为IgG2b、IgG2a、IgG1和IgG2a,轻链亚类均为kappa;制备的胶体金试纸条检测线包被单克隆抗体4A5,对照线包被羊抗鼠IgG,金标垫包被胶体金标记的单克隆抗体2C12,对CRV病毒液的检测灵敏度为10^4.2 TCID₅₀/mL,检测犬源其他病毒犬细小病毒(Canine parvo...     

Prokaryotic Expression of BPIV3 NP Protein and Its Immunoenhancing Effect on the BPIV3 Inactivated Vaccine

【Objective】 This study was aimed to verify whether the NP protein of Bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3) could enhance the immune effect of BPIV3 inactivated vaccine【Method】 The antigenicity of the protein encoded by NP gene was analyzed by bioinformatics softwares,and the antigenic region was screened.The truncated NP gene sequence of BPIV3 was amplified by PCR and connected to pET-32a(+) plasmid.Then the high-purity BPIV3 NP protein was obtained by E.coli prokaryotic expression system and Ni affinity chromatography.It was confirmed by Western blotting.BPIV3 was inactivated with 0.3% formaldehyde and mixed with Freund's adjuvant 1:1 to prepare inactivated vaccine.Eight New Zealand White rabbits were randomly divided into four groups with two rabbits in each group,including inactivated vaccine group,NP protein group,inactivated vaccine and NP protein mixed group and control group.Blood samples were collected before and every 7 days after immunization.The levels of specific antibodies and neutralizing antibodies in New Zealand White rabbits of the four groups were measured and compared by indirect ELISA and virus neutralization test.【Result】 DNAStar analysis showed that the average antigen index of amino acid region 193-368 of NP protein was 0.4-1.7,and the hydrophilic index was 0-1.5,which proved that this region had strong antigenicity and hydrophilicity.The NP gene was amplified by PCR and the recombinant expression vector was constructed.Gene sequencing showed that the recombinant expression vector was consistent with the expected results.The results of SDS-PAGE showed that NP protein was highly expressed with a molecular weight of 50 ku and expressed in the form of inclusion body.Western blotting showed that the expressed protein had strong reactivity.The results of ELISA showed that 28 days after immunization,the specific antibody titer of the control group was 0,and the specific antibody titers of inactivated vaccine group,NP protein group and inactivated vaccine and NP protein mixed group reached 1:2¹¹,1:2¹⁷ and 1:2¹⁸,respectively.The results of virus neutralization test showed that 28 days after immunization,the neutralizing antibody titer of the control group was 0,and the neutralizing antibody titers of inactivated vaccine group,NP protein group and inactivated vaccine and NP protein mixed group were 1:2^3.32,1:2^4.48 and 1:2^4.98,respectively.【Conclusion】 BPIV3 NP protein could enhance the immune effect of BPIV3 inactivated vaccine.Adding NP protein to the inactivated vaccine could be used as a new vaccination method of BPIV3 inactivated vaccine.     

绵羊肺炎支原体P6058aa-928aa蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】 建立基于绵羊肺炎支原体表面脂蛋白P60的间接ELISA方法。【方法】 利用生物信息学软件对P60蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性最佳的区域,扩增目的基因后构建重组表达载体并进行基因测序,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导抗原性最佳蛋白表达并进行诱导时间优化;利用SDS-PAGE分析该蛋白分子质量大小及其表达形式。以重组蛋白作为抗原,绵羊肺炎支原体阳性血清作为抗体,通过Western blotting方法分析其反应原性。以重组蛋白为包被抗原,建立抗原性最佳蛋白的间接ELISA抗体检测方法,用该方法对20份阴性血清进行检测,计算阴阳临界值;检测该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份绵羊临床血清样本进行检测。【结果】 经DNAStar分析,P60蛋白第58－928位氨基酸区域的平均抗原指数在0.8~1.7之间,亲水指数为0~2.0,证明该区域(P60_58aa-928aa)抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到P60_58aa-928aa基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,诱导10 h时蛋白表达量较高,蛋白分子质量为42 ku,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达;Western blotting结果表明,构建的重组蛋白具有良好的反应原性。对ELISA各条件进行优化结果显示:抗原包被浓度为0.5 μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶100,最佳孵育时间为1.5 h,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,判定阴阳性血清的临界值为0.36。对口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、牛支原体(Mb)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)的标准阳性血清的检测均为阴性,证明该方法特异性较强;敏感性试验结果表明,血清稀释度为1∶2 048时仍为阳性;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均<10%,证明该方法具有较好的重复性。利用所建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份羊血清检测结果表明,二者的阳性符合率为81.6%,阴性符合率为92.6%,总符合率为88.0%。【结论】 本研究建立的间接ELISA方法可用于临床样本的检测,为绵羊肺炎支原体的疫苗免疫效果评价和疾病诊断提供了较为可靠的方法。     

猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定

【目的】确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因。【方法】对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)的RT-PCR检测,将阳性样品接种MA104细胞传代进行PoRV的分离;对分离毒株进行电镜观察、间接免疫荧光试验、PoRV VP4和VP7基因序列测序和动物回归等试验。【结果】猪小肠病料样品经终浓度15 μg/mL的胰酶处理37 ℃孵育2 h,接种MA104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70 nm,平均大小为65 nm,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和RT-PCR检测均为PoRV阳性,确定该分离株为PoRV。分离株VP4和VP7基因序列分析显示,VP4基因型与P[23]基因型相似性最高,VP7基因型与G5基因型相似性最高,根据A群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G5P[23]型。动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24 h左右陆续出现水样腹泻、呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到PoRV。【结论】通过MA104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株PoRV,该分离株属于G5P[23]型PoRV,为哺乳仔猪发生腹泻的病原。     

口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究

利用单克隆抗体技术制备抗口蹄疫病毒的单克隆抗体,特异性试验表明其只与O、A、Asia 1型3种血清型FMDV抗原结合。进而采用胶体金标记技术,以胶体金标记的抗口蹄疫病毒单克隆抗体、多克隆血清抗体和葡萄球菌A蛋白为主要材料,研制口蹄疫快速检测试纸条。该试纸条检测O、A、Asia 1型3种血清型灭活口蹄疫病毒均为阳性,检测水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒4种灭活抗原及小反刍兽疫病毒疫苗株均为阴性,试验结果与口蹄疫实时荧光定量RT-PCR方法的完全一致,表明其具有良好的特异性。敏感性试验结果是,试纸条的检测极限为1∶160稀释的样品,其敏感性相当于实时荧光定量RT-PCR方法的1/64。由于试纸条具有操作方便、检测快速等优点,因此该试纸条可以用于大量临床样品的快速检测和现场检测。     

猪链球菌自溶素的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】 建立快速、准确检测猪链球菌自溶素（atl）抗体的间接ELISA方法。【方法】 根据GenBank登录的猪链球菌atl基因序列设计1对引物,采用PCR方法从猪源链球菌中获得atl基因序列;构建pET-32a-atl和pGEX-4T-1-atl重组质粒,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达;以表达纯化后的atl-His融合蛋白为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;以兔多克隆抗体为一抗,用Western blotting方法检测atl-GST融合蛋白的反应原性;以纯化后的atl-GST融合蛋白为包被抗原,猪链球菌感染阳性血清作为标准血清,建立猪链球菌自溶素抗体的间接ELISA检测方法。利用本试验建立的ELISA方法与商用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒同时对184份血清样品进行检测并用本试验建立的方法进行临床样品检测。【结果】 从猪链球菌中成功扩增出atl基因;构建的重组质粒,经诱导表达和纯化,获得大小为40 ku的atl-His和48 ku的atl-GST融合蛋白;经Western blotting验证,兔抗atl-His抗血清与atl-GST融合蛋白具有良好的反应原性;间接ELISA结果显示,该检测方法的阴阳临界值为0.318,阳性血清稀释至1：1 280检测仍为阳性;批内批间变异系数均<10%,表明该方法具有良好的重复性及敏感性。本试验所建立的ELISA方法检测出96份阳性样品,商用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒检测出66份阳性样品,符合率为71.7%。应用建立的方法检测458份不同饲养阶段的猪血清样品,其中检出277份阳性样品,阳性率为60.4%。【结论】 本试验成功建立了检测猪链球菌自溶素抗体的间接ELISA方法并进行了初步应用,为猪链球菌病血清流行病学调查奠定了基础。