热应激诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡及其对HSP70基因表达的影响

为探讨热应激对乳腺上皮细胞凋亡的影响,以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,取对数生长期的乳腺上皮细胞分别置于39℃和41℃热处理1 h(以37℃正常培养的细胞为对照),在37℃恢复培养0、6、12 h后收集细胞,采用MTT法检测细胞生长抑制率,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,比色法分析Caspase-3活性,荧光定量PCR检测HSP70基因的表达水平。结果表明,39℃热应激组细胞生长抑制率和死亡率高峰期均发生在热修复6 h,细胞死亡率为15.42%,而41℃热应激组发生在热修复12 h,细胞死亡率高达23.18%;高温处理后,Caspase-3活性呈上升趋势;39℃热应激组在热恢复6 h,HSP70基因表达量显著高于对照组,41℃热应激组在热恢复0、6、12 h,HSP70基因的表达量分别为对照组的3.53倍、5.61倍和2.93倍。综上可知,高温应激激活了Caspase-3活性,从而诱导乳腺上皮细胞凋亡,并随高温强度的增加而作用增强,同时高温诱导了HSP70基因过表达,协助细胞获得热耐受性。     

转化生长因子β_1对奶牛乳腺组织细胞凋亡及HSP_(70)蛋白表达的影响

应用乳酸脱氢酶(LDH)活力测定、透射电镜、免疫组化和Caspase-3活性分析等技术,检测转化生长因子猹1(TGF-β1)对奶牛乳腺组织细胞活性、凋亡和HSP70蛋白表达的影响.用10 ng·mL-1 TGF-猹1处理乳腺组织48 h,分别在不同时间点收集组织和培养液检测各指标,以0 h不加TGF-β1作为对照组.结果显示,随TGF-猹β1作用时间的延长组织细胞活率逐渐降低,24 h和48 h组显著低于对照组(P<0.05),LDH活性逐渐升高,6、12、24和48 h组极显著高于对照组(P<0.01).处理12、24和48 h组织DNA发生断裂;Caspase-3活性在24 h达到高峰,并极显著高于对照组(P<0.01);上皮细胞逐渐由腺泡脱落,腺泡塌陷,但间质结构基本完整;超微结构观察显示,48 h时上皮细胞呈现染色质凝集、线粒体肿胀等明显凋亡特征,而成纤维细胞胞浆致密、线粒体丰富,结构较完整.处理3～12 h后组织过表达HSP70,且均显著高于对照组(P<0.05).结果提示:TGF-猹1以促进上皮细胞凋亡的方式促进奶牛乳腺发生退化.     

苦参碱对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及抗氧化能力的影响

【目的】探究苦参碱对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。【方法】利用含0(A组),25(B组),50(C组),75(D组)和100μg/mL(E组)苦参碱的培养基培养奶牛乳腺上皮细胞。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测BMECs活性,采用流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测苦参碱对BMECs凋亡的影响,并检测苦参碱对BMECs抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的影响,采用real-time PCR对BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因的相对表达量进行检测。【结果】用药5d时,低质量浓度(25和50μg/mL)苦参碱对BMECs增殖具有促进作用,高质量浓度(75和100μg/mL)苦参碱对细胞增殖具有抑制作用;B~E组BMECs的凋亡率均极显著高于A组(P0.01);B~E组BMECs培养上清液中NO和乳酸脱氢酶(LDH)水平明显高于A组。B~E组BMECs的过氧化氢酶(CAT)活性均比A组高,其中C组极显著高于A组(P0.01);B~E组的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均极显著高于A组(P0.01),E组的超氧化物歧化酶(SOD)水平极显著高于A组(P0.01),各组MDA含量无显著性差异。与A组相比,苦参碱上调了B~E组BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因的相对表达量。【结论】低质量浓度苦参碱能够促进BMECs增殖,高质量浓度苦参碱则会抑制BMECs增殖;不同质量浓度苦参碱均可提高BMECs的抗氧化能力,其中50μg/mL苦参碱提高BMECs抗氧化能力的效果最明显。     

IFN-γ对奶牛乳腺上皮细胞转分化的影响

[目的]用转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导奶牛乳腺上皮细胞-肌纤维母细胞转分化(EMT),以不同浓度的IFN-γ为阻断剂,探讨干扰素-γ(IFN-γ)对奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)表型重塑的作用。[方法]将原代培养的BMEC分为对照组、诱导组(TGF-β_110ng/m L)、药物组(IFN-γ20 ng/m L)及阻断组(TGF-β_110 ng/m L+IFN-γ10、20、50、100 ng/m L)。培养72 h后,观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)和胶原Ⅰ(COLⅠα1)的mRNA相对表达量。[结果]诱导组α-SMA、CTGF和胶原Ⅰ mRNA相对表达量显著增加(P0.05);药物组CTGF的mRNA相对表达量与对照组相比无显著差异(P0.05),α-SMA和COLⅠα1mRNA相对表达量显著下降(P0.05);阻断组IFN-γ明显抑制了TGF-βl诱导的转分化。[结论]IFN-γ能够负性调控TGF-β_1诱导的奶牛乳腺上皮细胞-肌纤维母细胞转分化(EMT),减少COLⅠα1分泌。     

高温条件下miRNA-24对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的非编码小RNA分子,本研究旨在分析高温条件下miRNA-24对乳腺上皮细胞生长、凋亡的作用及其初步机制。【方法】体外培养奶牛乳腺上皮细胞,高温(41℃)处理所培养的细胞;应用miRNA基因沉默技术,抑制高温处理过的乳腺上皮细胞中miRNA-24的表达;采用细胞计数法分析细胞增殖情况;Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞术检测miRNA-24对乳腺上皮细胞凋亡的作用,Western blot检测凋亡相关因子表达变化。【结果】抑制miRNA-24的表达,高温条件下的乳腺上皮细胞增殖能力显著增强(P0.05),凋亡细胞数显著减少(P0.05),促凋亡因子caspases-8和caspases-3表达量下调。【结论】内源性miRNA-24对乳腺组织发育具有重要的调控作用,抑制miRNA-24的表达可以缓解高温诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡发生率、促进细胞的生长发育。     

奶牛乳腺上皮细胞HSP70 mRNA荧光实时定量PCR标准曲线的建立

为构建奶牛乳腺上皮细胞HSP70 mRNA表达水平差异的标准品,以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞总RNA为模板,反转录成cDNA,用该cDNA为模板进行PCR,扩增目的基因片段,构建pGEM-T-HSP70重组质粒,鉴定测序后,用荧光PCR构建标准曲线。结果构建的HSP70质粒经PCR扩增后,得到了明显的259 bp条带,测序结果与目的条带完全一致,且质粒原始浓度为2.5×1010copies/mL,倍比稀释至2.5×103copies/mL,均能得到良好的标准曲线(R=0.99),提示构建的HSP70标准质粒成功。     

胆碱对热应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响

[目的]本试验旨在揭示胆碱对热应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的抑制作用.[方法]奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T细胞)于含10％胎牛血清的DMEM培养基中进行体外培养,将细胞分为对照组、胆碱组(100μmol·L-1)、热应激组(42℃,2 h)、热应激+胆碱组.采用CCK-8法分析添加胆碱对MAC-T细胞的药物毒性及细...     

奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控

【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43(P0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列。【结论】克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录。     

谷氨酰胺对奶牛乳腺上皮细胞生长、增殖及HSP70 mRNA表达的影响

研究旨在分析谷氨酰胺(Gln)对基础状态乳腺上皮细胞生长、增殖及热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。取对数生长期的奶牛乳腺上皮细胞用于试验,细胞在含有不同浓度(0,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0和16.0mmol·L-1)Gln的DMEM培养液中培养24 h,收取细胞及培养液;细胞在含8 mmol·L-1Gln的DMEM培养液中培养不同时间(0,3,6,12,24,48,72 h)后,收取细胞及细胞培养液。采用MTT法检测细胞存活率,比色法检测LDH活性,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测细胞内热休克转录因子1(HSF-1)和HSP70的表达水平。结果显示:Gln能促进奶牛乳腺上皮细胞生长增殖,Gln浓度为2.0 mmol·L-1时细胞存活率最高,4.0~8.0mmol·L-1时仍维持较高水平;细胞内HSP70与HSF-1的表达趋势一致,8.0 mmol·L-1的Gln诱导24 h,二者表达量均达峰值,分别为细胞活性最佳剂量2.0 mmol·L-1表达量的8.49倍(P0.01)和5.90倍(P0.01),表明Gln能促进奶牛乳腺上皮细胞的生长、增殖,并通过启动HSF-1 mRNA的转录活性诱导基础状态乳腺上皮细胞高表达HSP70 mRNA。     

单一或连续高温处理对奶牛乳腺细胞的生长及凋亡的影响

用细胞流式、台盼蓝染色、免疫组织化学等方法研究单一高温(40 ℃1 h)或连续高温(40 ℃1 h&#183;d-1)3～7 d对乳腺上皮细胞细胞周期、凋亡及热休克蛋白(HSP70)表达的影响.结果表明:40 ℃1 h单一高温处理乳腺上皮细胞后24 h,G2比例极显著高于对照组(37 ℃)(P＜0.01),细胞死亡率在热处理后6 h达到最大值,并极显著高于对照组(P＜0.01).高温(40 ℃1 h)诱导细胞HSP70的表达,HSP70阳性细胞比率在热处理后3 h达到最大值.连续的40 ℃1 h&#183;d-1诱导细胞产生G2期阻滞;连续4 d以上的40 ℃1 h热处理显著地抑制了细胞的增殖(P＜0.05).结果提示:高温诱导乳腺细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,并诱导乳腺细胞HSP70的表达.     

单一或连续高温处理对奶牛乳腺细胞的生长及凋亡的影响

用细胞流式、台盼蓝染色、免疫组织化学等方法研究单一高温(40 ℃1 h)或连续高温(40 ℃1 h·d-1)3～7 d对乳腺上皮细胞细胞周期、凋亡及热休克蛋白(HSP70)表达的影响.结果表明:40 ℃1 h单一高温处理乳腺上皮细胞后24 h,G2比例极显著高于对照组(37 ℃)(P＜0.01),细胞死亡率在热处理后6 h达到最大值,并极显著高于对照组(P＜0.01).高温(40 ℃1 h)诱导细胞HSP70的表达,HSP70阳性细胞比率在热处理后3 h达到最大值.连续的40 ℃1 h·d-1诱导细胞产生G2期阻滞;连续4 d以上的40 ℃1 h热处理显著地抑制了细胞的增殖(P＜0.05).结果提示:高温诱导乳腺细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,并诱导乳腺细胞HSP70的表达.     

SOCS1基因过表达对猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响

【目的】明确细胞因子信号转导抑制因子1基因（SOCS1）过表达对乳腺发育关键信号通路（JAK/STAT）相关基因表达的影响,为揭示SOCS1基因调节猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的作用机制提供参考依据。【方法】构建SOCS1基因过表达载体pcDNA3.1-SOCS1和阴性对照载体pcDNA3.1-NC,分别转染猪乳腺上皮细胞,然后通过CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测转染后JAK/STAT信号通路相关基因的表达变化。【结果】以过表达载体pcDNA3.1-SOCS1和阴性对照载体pcDNA3.1-NC分别转染猪乳腺上皮细胞,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组的SOCS1基因相对表达量极显著高于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组（P<0.01,下同）;转染48和72 h后,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组猪乳腺上皮细胞的OD值极显著低于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组,说明过表达载体pcDNA3.1-SOCS1能有效抑制猪乳腺上皮细胞的增殖能力;过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组的细胞凋亡率...     

不同中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响

为探讨中药对小鼠乳腺上皮细胞泌乳功能的影响,选取5种与泌乳相关的中药(王不留行、甲珠、通草、蒲公英、漏芦)研究其对体外培养的小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响。采用荧光定量RT-PCR及毛细管电泳技术分别对β-酪蛋白的mRNA和蛋白表达水平进行检测,并应用激光共聚焦显微镜技术检测泌乳信号转录因子Stat5的含量变化。结果表明,通草、蒲公英和漏芦能显著促进β-酪蛋白的表达,王不留行和甲珠能极显著促进小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达。提示王不留行、甲珠和通草可通过影响乳腺上皮细胞乳蛋白基因的表达而促进泌乳,其机理尚待进一步研究。     

β-酪蛋白基因在不同乳腺上皮细胞中表达的初步分析

应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对山羊乳腺上皮细胞（GMEC）中β-酪蛋白mRNA进行检测以评价GMEC乳蛋白合成的功能.同时,比较商品化小鼠乳腺癌细胞C127、人乳腺癌细胞系T47D中β-酪蛋白基因的转录表达.结果表明,原代培养山羊乳腺上皮细胞GMEC-1能够检测到β-酪蛋白基因的表达,在激素诱导下,GMEC-3细胞中能检测到β-酪蛋白基因mRNA,但C127和T47D细胞系中均无法检测到.     

不同温湿指数对藏獒外周血淋巴细胞凋亡及HSP70蛋白表达的影响

选择体重、年龄相近的藏獒10只,研究不同温湿指数(THI)对藏獒的生理常数、外周血淋巴细胞凋亡及HSP70蛋白表达的影响.研究结果表明:(1)夏季高温季节,随THI升高,藏獒的直肠温度和呼吸频率也逐渐升高,极显著高于春季非热应激组；(2)夏季高温热应激显著增加了藏獒外周血淋巴细胞的凋亡率,淋巴细胞早期凋亡率在THI为83.58时达到最高,与非热应激组相比差异极显著；(3)夏季高温热应激诱导外周血淋巴细胞HSP70蛋白的表达,与非热应激组相比差异极显著.结论:(1)夏季高温热应激显著提高了藏獒的直肠温度和呼吸频率；(2)热应激诱导藏獒外周血淋巴细胞发生凋亡；(3)热应激诱导藏獒外周血淋巴细胞HSP70蛋白过表达.     

谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞凋亡及Bcl-2、HSP70表达的影响

为探讨谷氨酰胺预处理抗高温应激损伤的作用,以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,取对数生长期的奶牛乳腺上皮细胞,分为对照组、谷氨酰胺组、高温组、谷氨酰胺+高温组,采用MTT法检测细胞存活率、Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡、荧光定量PCR检测Bcl-2基因和HSP70基因的表达水平、比色法分析Caspase-3活性。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞经谷氨酰胺预处理后,HSP70 mRNA表达量极显著增加(P 0. 01),提高了热应激状态下细胞的热耐受性和存活力;与高温组相比,谷氨酰胺+高温处理组Bcl-2 mRNA表达量在热恢复0、6、12 h分别提高3. 23倍(P 0. 05)、2. 49倍(P 0. 05)、1. 89倍(P 0. 05),Caspase-3活性分别下降68. 04%(P 0. 01)、40. 89%(P 0. 05)、52. 06%(P 0. 01)。综上,谷氨酰胺预处理促进了奶牛乳腺上皮细胞Bcl-2和HSP70表达,缓解了高温应激引起的Caspase-3活性上升,抑制了热应激所致的奶牛乳腺上皮细胞凋亡。     

茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用

用过氧化氢(H2O2)建立体外奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激损伤模型,研究不同质量浓度茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的影响。MTT法检测细胞存活率,比色法检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,分光光度法检测天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的活性。结果显示:与H2O2损伤模型组相比,20～100μg.mL-1茶多酚处理组的奶牛乳腺上皮细胞存活率、SOD活性显著升高,而MDA含量、LDH与Caspase-3相对活性与细胞凋亡率均下降,其中以100μg.mL-1茶多酚处理组效果最显著,说明一定质量浓度的茶多酚可以缓解氧化应激所致的奶牛乳腺上皮细胞的损伤,提高细胞存活率,抑制乳腺细胞凋亡。结论:茶多酚对乳腺上皮细胞氧化应激损伤具有保护作用,其保护作用可能与降低MDA含量,增强SOD活性及抑制Caspase-3活性有关。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

[目的]探讨在生化培养箱中进行奶牛乳腺上皮细胞原代培养的可行性。[方法]采用组织块法,在体外进行乳腺上皮细胞的分离培养,探索其在生化培养箱中合适的培养条件。用倒置显微镜观察、细胞爬片吉姆萨染色和角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定。[结果]通过倒置显微镜观察发现,上皮细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有铺路石样。细胞染色可见上皮细胞胞体较大,胞核深蓝色,圆形或椭圆形,核仁清晰可见,一般为2-4个。免疫组化鉴定结果显示,培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白14和18。[结论]原代奶牛乳腺上皮细胞可以在生化培养箱中成功培养。     

四种二肽对奶牛乳腺上皮细胞增殖及β-酪蛋白分泌的影响

通过添加不同浓度的二肽:蛋氨酸-蛋氨酸、赖氨酸-赖氨酸、蛋氨酸-赖氨酸、赖氨酸-蛋氨酸二肽,用CASY细胞活力分析仪检测奶牛乳腺上皮细胞的增殖和活力,用荧光定量PCR、HPLC检测β-酪蛋白的基因表达情况,确定培养24 h时四种二肽的最佳添加浓度分别为80、100、50、80μg.mL-1。以最佳二肽浓度添加时细胞的增殖分别为1.28×105、1.66×105、1.79×105、.85×105cells.mL-1,活力分别为93.72%、95.59%、94.35%、95.65%,培养液中β-酪蛋白含量分别为1.34、1.38、1.44、1.63 mg.10-5cells。为进一步利用小肽提高乳蛋白产量、调控乳蛋白合成提供理论依据。     

猪TGF-β1基因多态性及组织表达谱分析

转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是TGF-β超家族的重要成员,是一类多功能的细胞因子,在细胞生长、分化、迁移、免疫调节和细胞外间质(ECM)形成等过程中具有重要作用。因此,本研究通过采用PCR-SSCP方法,对猪TGF-β1基因内含子6的单核苷酸多态性进行检测和分析。结果表明:在晋汾白猪中检测到两种基因型(AA、AB),而在新山西黑猪中检测到三种基因型(AA、AB、BB),晋汾白猪和新山西黑猪在TGF-β1基因的多态位点的基因型分布差异极显著(P0.01)。研究成功建立了TGF-β1基因变异信息及其组织表达情况,将为进一步分析猪TGF-β1基因变异与猪繁殖性能的相关分析提供基础资料。