抑制素基因免疫技术的研究进展

抑制素(Inhibin,INH)是一种由雌性动物的卵泡颗粒细胞和雄性动物的睾丸支持细胞分泌的糖蛋白激素.抑制素免疫可以促进卵巢卵泡发育,提高动物的繁殖力.抑制素基因免疫是近几年发展起来的动物繁殖新技术.通过对基因免疫的优点、效果、影响免疫效果的因素以及基因免疫在养禽业中的应用前景和存在的问题加以阐述,提出了未来研究的方向.     

抑制素基因免疫对黄牛孪生的影响

为增强肉牛的繁殖力,应用本实验室构建的抑制素真核融合表达质粒pCISI,提纯后辅以不同的免疫佐剂注入96头母黄牛体内,采用AMI-900兽用B超对其中84头发情牛进行卵泡检测,并对其中78头妊娠牛进行早期胚胎数目检测。结果发现:抑制素质粒pCISI能促进双大卵泡发育(80.95%,68/84),诱发排双卵(60.71%,51/84),诱导黄牛孪生(41.03%,32/78);普鲁卡因佐剂(48.78%)比脂质体(32.43%)效果明显。研究表明,抑制素基因免疫能有效提高黄牛的繁殖率。     

细菌DNA和gm-csf基因对抑制素基因免疫的作用

40只小鼠分为4组,分别注射pC ISI(抑制素质粒)、pC ISI+细菌DNA、pC ISI+pGM-CSF和生理盐水(8.5 g.L-1)。pC ISI剂量为20μg,与佐剂等量混合,2周后加强免疫1次。试验结果表明,细菌DNA佐剂组诱导77.8%(7/9)的个体产生了抑制素阳性抗体,抗体以IgG2α型为主,gm-csf佐剂组产生的抗体以IgG1型为主;基因佐剂联合抑制素基因免疫激发的淋巴细胞增殖能力显著高于抑制素基因单独免疫组(P<0.05);细菌DNA佐剂组阳性鼠的动情期血浆雌二醇高于阴性鼠(P<0.05),免疫对动情期孕酮水平无显著影响(P>0.05)。上述结果表明,细菌DNA和gm-csf能增强抑制素基因的免疫效果。     

抑制素基因免疫对南阳黄牛生殖激素的影响

选择40头南阳黄牛,用3.0 mg抑制素基因重组质粒(pCIS,免疫组,n=30)或同剂量的生理盐水(对照组,n=10)间隔21 d注射2次,分别在首次免疫当天、首次免疫后第10天和第21天、加强免疫后第10天和第45天收集血清,应用放射免疫法(RIA)测定处理后不同时期血清中激素水平.结果表明:在5个采血时间点内,加强免疫后第10天抗体阳性牛比率最高,为37.5%,与其他采血时间点有显著差异.免疫组促卵泡素(FSH)平均含量比对照组高,但差异不显著;17-β雌二醇(E2)和孕酮(P4)水平在加强免疫后2组有显著性差异.另外.抑制素抗体阳性牛的FSH、E2和P4比阴性牛高,但差异不显著.这些结果说明抑制素基因重组质粒可促进肉牛产生特异性抗体,且对FSH、E2和P4水平有影响.     

不同因素对抑制素基因免疫肉牛反应性的影响

为探讨佐剂、质粒纯度和免疫次数3种因素对抗抑制素抗体效价的影响，以分析抑制索基因免疫是否使内牛产生免疫应答，利用已构建的抑制索真核融合表达质粒pCISI对内牛进行了免疫试验．结果表明，抑制素pCISI基因免疫内牛后佐剂处理组比无佐剂组免疫效果明显．对抗体P/N（待测血样的吸光值P与阴性血样吸光值N的比值）来说，普鲁卡因佐剂显著优于脂质体，但就抗体阳性率来说，普鲁卡因和脂质体差异不显著．无论是抗体P/N值还是抗体阳性率，高纯度组的效果略高于低纯度组，但差异不明显．随着免疫次数的增加抗体P/N值和抗体阳性率均升高，两者差异显著，说明了抑制素基因免疫内牛可诱导产生抗抑制素抗体，纯度对抗体的产生和抗体阳性牛比例没有影响，但免疫佐剂与免疫次数有影响．     

抑制素基因免疫对母羊生殖内分泌的影响

用抑制素基因重组质粒(pCIS)免疫生产母羊,剂量分别为每只0.2 mg、0.4 mg和0.8 mg,以生理盐水为对照.结果表明:免疫组抗抑制素抗体阳性率达46.7%.加强免疫后第45天,免疫组的促卵泡素(FSH)水平显著高于对照组(P＜0.05).首次免疫后第20天与加强免疫后第45天抗体阳性羊的促卵泡素水平显著高于抗体阴性羊(P＜0.05).与对照组相比,免疫组的雌激素(E2)与孕激素(P)水平无显著变化(P＞0.05).抑制素基因免疫能调节绵羊的促卵泡素水平,但对雌激素与孕激素的水平无显著影响.     

抑制素基因免疫对母羊生殖内分泌的影响

用抑制素基因重组质粒（pCIS）免疫生产母羊,剂量分别为每只0．2mg、0．4mg和0．8mg,以生理盐水为对照。结果表明：免疫组抗抑制素抗体阳性率达46．7％。加强免疫后第45天,免疫组的促卵泡素（FSH）水平显著高于对照组（P〈0．05）。首次免疫后第20天与加强免疫后第45天抗体阳性羊的促卵泡素水平显著高于抗体阴性羊（P〈0．05）。与对照组相比,免疫组的雌激素（E2）与孕激素（P）水平无显著变化（P〉0．05）。抑制素基因免疫能调节绵羊的促卵泡素水平,但对雌激素与孕激素的水平无显著影响。     

双拷贝抑制素基因免疫对肉牛卵泡和黄体的影响

 【目的】探讨不同剂量的双拷贝抑制素pcISI基因免疫对肉牛生殖能力的影响。【方法】将58头同期发情肉牛随机分为6组, 每组肉牛分别注射0.75（T1）、1.5（T2）、2.25（T3）、3.0 mg/头（T4）pcISI质粒、3.0 mg/头 pcMV-S空质粒（C1）和3 mL/头 生理盐水（Ｃ2）,初次免疫21d后进行加强免疫,以探讨抑制素pcISI基因疫苗对肉牛卵泡和黄体发育的影响。【结果】4个剂量组的大卵泡数均高于对照组,除了T1外,其它3个剂量组均与对照组差异显著（P＜0.05）;T3和T4的中卵泡数均高于对照组,且差异显著（P＜0.05）;T3和T4的小卵泡数均高于对照组,且差异显著（P＜0.05）。无论左侧还是右侧,各剂量组成熟卵泡直径均高于对照组,除了T1外,其它3组两侧成熟卵泡均与对照组差异显著（P＜0.05）。无论左侧还是右侧,4个剂量组黄体直径均高于对照组,且均与对照组差异显著（P＜0.05）;T3黄体最大,T1最小,且T3与T1差异显著（P＜0.05）。加强免疫后10 d（BM10）抑制素抗体与成熟卵泡大小相关显著（r＝0.629,P＜0.05）,与黄体大小相关极显著（r＝0.651,P＜0.01）。【结论】双拷贝抑制素pcISI基因免疫可促进肉牛卵泡和黄体发育,2.25mg为最佳免疫剂量,抑制素抗体水平与卵泡和黄体发育有一定的相关性。     

抑制素基因疫苗的构建

使用猪抑制素α亚基上的第1－32位所基酸所对应的DNA片段作为目的基因，并与乙肝表面抗原基因串联，插入原核表达质粒（pUC18)中，构建重组原核表达质粒，经过在大肠杆菌中扩增后提取目的基因片段，手稿真核表达质粒(pcDNA3.0）中，构建重组真核表达质粒，经过扩增和提取，并经过测定获得了抑制素基因疫苗。     

黄牛对抑制素pCISI基因免疫的反应性

为分析抑制素基因免疫对黄牛的影响,优化免疫方法,将3.0 mg抑制素真核融合表达质粒pCISI以不同纯度并配以不同的免疫佐剂分2次导入72头母黄牛体内,采用ELISA法检测血样中抗抑制素抗体效价。结果表明:抗体阳性牛占59.72%(43/72);添加佐剂的重组质粒较空质粒组免疫效果明显(P<0.05),普鲁卡因佐剂显著优于脂质体(P<0.05);高纯度疫苗组阳性牛的比例略高于低纯度组,但差异不明显(P>0.05)。这说明应用抑制素质粒pCISI免疫黄牛后可产生抗抑制素抗体。     

抑制素基因免疫多克隆抗体制备

为制备成本低廉、效价高的抗抑制素抗体,将6只2．5—3kg的健康大白兔分为3组（n=2）,分别皮下多点注射100μg纯化的抑制素质粒pCISI（T1、T22组）或100μg生理盐水（S对照组）,T1组加强免疫1次,而T2组加强免疫2次,每隔10d采血1次,用辛酸-硫酸铵法纯化抗血清;用ELISA法检测血清中抗抑制素抗体水平,以P／N值〉2判为阳性。ELISA检测结果表明,T1、T2组血清中均检测到抗抑制素抗体,效价为1：6400。研究结果表明,抑制素质粒pCISI免疫大白兔可产生较高效价的抗抑制素抗体,且只须加强免疫1次。     

抑制素基因免疫京白鸡后在心脏组织中的表达

[目的]探讨基因免疫的安全性。[方法]抑制素基因免疫京白鸡后,取其心脏组织制备石蜡切片,再利用免疫组化方法检测心脏组织切片中是否有抑制素基因残留（即是否有阳性点的存在）。[结果]在心脏组织切片中,试验组和对照组均无阳性点。[结论]抑制素免疫后京白鸡的心脏组织中无外源抑制素表达,说明抑制素基因免疫是安全的。     

抑制素基因免疫诱导单胎绵羊孪生的研究

应用抑制素基因免疫重组质粒 (PCIS)免疫绵羊 ,首次免疫后 ,绵羊能够产生抗抑制素抗体 ,加强免疫后抗体增加显著 (P <0 0 5 ) ,免疫羊的抗体阳性率可达 4 6 7%。免疫组与对照组促卵泡素 (folliclestimutatinghormone ,FSH)的含量在加强免疫第 4 5天时差异显著 (P <0 0 5 )。在首次免疫第 2 0天与加强免疫第 4 5天 ,抗体阳性羊的促卵泡素含量显著高于抗体阴性羊 (P <0 0 5 )。免疫羊的双羔率达 39 2 % ,显著高于对照组 (P <0 0 5 ) ,比对照组提高 2 9 2 %。     

抑制素α(1～32)基因免疫对大鼠卵泡发育和生殖激素的影响

 选择 40只 3 0日龄雌性大鼠分为 4组 ,分别用含重组抑制素α(1～ 3 2 )基因真核表达质粒pcINH 0 μg(对照组 )、15μg(试验组 1)、2 5μg(试验组 2 )、40 μg(试验组 3 )的脂质体进行主动免疫 ,间隔 2 0d后用不含脂质体的重组基因质粒加强免疫 1次。结果发现 ,抗体阳性鼠占 50 % (13 / 2 6) ,但加强免疫 10d后的抗体P/N值没有升高 ,而且免疫剂量的增加并没有提高阳性鼠的比例 ;抗体阳性鼠卵巢上的成熟卵泡数比阴性鼠多 2 .3 ,但统计差异不显著 (P >0 .0 5)。首次免疫 10d后阳性鼠血浆FSH浓度显著升高 (P <0 .0 5) ;但血浆雌二醇水平无显著差异 (P >0 .0 5)。加强免疫 10d后血中促卵泡素水平没有升高。本试验结果证明 ,应用重组抑制素真核表达质粒免疫动物可以产生抗抑制素抗体。     

影响奶牛子宫复旧因素的研究

应用电测径器、B-型超声实时断层扫描仪(B-超)以及放射免疫等仪器和技术,对19头产后娟珊牛和50头荷兰黑白花牛的子宫复旧过程、规律以及影响其复旧速度的因素进行了研究。结果表明,两个品种正常牛子宫孕角、空角和子宫颈复旧的平均时间分别为32.3±2.1,28.0±3.6,38.3±4.0(娟珊牛)和35.5±4.5,30.8±5.9和37.5±5.0(黑白花牛)。两个品种牛子宫角直径大小分别和血浆中3甲基组氨酸(3MH)和羟基脯氨酸(HP)的含量呈显著(r=0.39,P<0.05)和极显著(r=0.52,P<0.01)正相关;产后患子宫感染及胎衣不下的牛,子宫复旧时间比正常组牛极显著延长(P<0.01)。产后脂肪肝的发病率为63.2%(娟珊牛)和46.7%(黑白花牛)。患脂肪肝的娟珊牛子宫复旧的时间比同品种正常牛显著延长(P<0.05)。娟珊牛产后第1次排卵的平均时间是13.2±1.2 d;黑白花牛为15.4±3.0 d。2个品种牛产后第1次排卵时间和子宫复旧时间呈显著正相关(r=0.64,P<0.05)(正常组牛)和非显著负相关(r=-0.53,P<0.2>0.1)(患子宫病组牛)。产后48h1次性肌肉注射外源性激素后,除雌二醇可显著延长子宫空角复旧的速度外,孕酮、催产素和前列腺素 F_(2α)(PGF_(2α))对子宫复旧速度均无显著影响。     

抑制素基因免疫京白鸡后在卵巢组织中的表达

为了了解用融合表达质粒DNA免疫后,外源DNA在卵巢组织中的表达情况,探讨基因免疫的安全性,在pC IS免疫京白鸡后,取卵巢组织,用免疫组织化学的方法检测切片中是否有抑制素基因表达（即是否有阳性点的存在）。结果发现,在卵巢组织切片中,实验组和对照组均无阳性点。抑制素基因免疫后,经过长时间的代谢,京白鸡的卵巢组织中无外源抑制素表达。     

抑制素基因免疫黄牛的黄体发育与免疫纯度及剂量的关系

为探讨双拷贝抑制素pcISI基因疫苗纯度和剂量对肉牛黄体发育的影响,将150头同期发情的南阳黄牛随机分为8个试验组和2个对照组,试验组用pcISI按2种纯度、4种剂量(0.75、1.50、2.25、3.00 mg/头)进行免疫处理,2个对照组分别用空质粒和生理盐水进行处理;初次免疫21 d后进行加强免疫。结果表明:无论用高纯度还是低纯度疫苗免疫,2.25 mg/头剂量处理对黄体的作用效果最明显,且抗体水平与黄体发育密切相关,2.25 mg/头抑制素融合表达质粒组的黄体显著大于0.75 mg/头组(P<0.05),抗体阳性牛两侧黄体显著比抗体阴性牛的大(P<0.05)。     

奶牛交巢穴不同埋线时间对子宫复旧的影响

为摸索母牛产后交巢穴不同埋线时间与子宫复旧的相关性,选择20头黑白花奶牛作为研究对象,5头为空白对照组,15头在其产后不同时间进行交巢穴埋线,按照判定标准详细记录每头奶牛的恶露排出及子宫复旧情况。结果显示,产后1～6h埋线效果最好,而1h以内和6h之后埋线效果差异不显著,但均比1-6h之间埋线的效果差。     

患子宫内膜炎奶牛免疫应答变化规律的研究

利用流式细胞仪及ELISA技术,通过对血液中CD4+、CD8+和血液及子宫分泌物中三种免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)含量进行检测,探讨在炎症状态下,各指标的动态变化与诊断子宫内膜炎的相关性。结果表明,在感染后期CD8+占主导地位,CD4+/CD8+也随之降低。而产后奶牛血液中IgA、IgG、IgM均呈现升高趋势(...     

产后早期子宫投药对奶牛子宫内膜炎及繁殖性能的影响

通过对奶牛在产后第7、9、11天进行子宫投注抗生素或复合中药制剂以考察其对产后子宫内膜炎的发生及产后繁殖性能的影响。结果表明,产后早期进行子宫投注复合中药和抗生素能够降低产后子宫内膜炎的发病率,在一定程度上缩短了产后首次发情及配种间隔,提高了产后100 d内受胎率,复合中药效果显著(P0.05)。对奶牛进行产后早期子宫投药能够降低子宫内膜炎的发病率,在一定程度上提高了奶牛产后的繁殖性能。