羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

苹果蠹蛾β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及mRNA表达稳定性检测

【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67bp、3′非编码区268bp和开放阅读框1 131bp,编码一个由376个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的蛋白质相对分子质量为41.793 7ku,等电点为5.29,含有3个actin蛋白家族的典型识别特征以及6种类型的特定功能位点,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达99%。实时定量PCR和半定量PCR结果表明,β-actin基因在苹果蠹蛾发育不同时期以及杀虫剂处理后表达量无显著差异(P0.05)。【结论】苹果蠹蛾β-actin基因可作为可靠的内参基因应用于基因mRNA的表达定量研究。     

基于线粒体COⅠ和COⅡ基因的沙果小食心虫与梨小食心虫的分子鉴定

【目的】建立基于线粒体COⅠ和COⅡ基因序列的沙果小食心虫、梨小食心虫分子鉴定方法。【方法】田间采集试虫,利用PCR和基因测序技术,扩增2种食心虫的线粒体COⅠ和COⅡ基因,将获得的COⅠ和COⅡ基因序列在GenBank中进行BLAST比对,并通过GeneDoc软件分析基因序列相似性,利用Mega 5.05软件分别计算基于COⅠ和COⅡ基因序列的遗传距离,并分别构建COⅠ和COⅡ基因的系统发育树。【结果】在分析的2种食心虫样本中,沙果小食心虫COⅠ基因的种内相似度在99.4%以上,梨小食心虫COⅠ基因的种内相似度在99.6%以上,2种食心虫COⅠ基因的种间相似度为95.0%~95.6%;沙果小食心虫COⅡ基因的种内相似度在99.0%以上,梨小食心虫COⅡ基因的种内相似度在99.3%以上,2种食心虫COⅡ基因的种间相似度为94.6%~95.5%;2种食心虫COⅠ基因种间存在30个稳定变异位点,COⅡ基因种间有26个稳定变异位点。2种食心虫种内遗传距离为0.001~0.006(COⅠ)和0.001~0.010(COⅡ),种间遗传距离为0.046~0.052(COⅠ)和0.047~0.057(COⅡ),基于COⅠ和COⅡ基因的种间遗传距离均显著大于种内遗传距离。分别构建COⅠ和COⅡ基因单倍型的系统发育树,结果显示,在2个基因的系统发育树上,2种食心虫的基因序列分别位于不同的进化支,且置信度均达到100%,同种食心虫的基因序列位于相同的进化枝。【结论】可以根据本研究所用的COⅠ和COⅡ基因序列的差异性,进行沙果小食心虫和梨小食心虫的分子鉴定。     

梨小食心虫卵黄原蛋白基因的鉴定及表达分析

为明确重要果树害虫梨小食心虫(Grapholita molesta)卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)基因功能及其生殖调控机制,为GmVg基因功能的深入研究奠定理论基础,克隆鉴定了梨小食心虫卵黄原蛋白基因(GmVg)并进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析GmVg在梨小食心虫不同发育时期、不同性别和不同组织的表达模式。结果表明,GmVg基因全长5 573 bp,开放阅读框(ORF)5 364 bp,编码1 787个氨基酸,信号肽长度为15个氨基酸,分子式为C₉₀₄₁H₁₄₀₉₀N₂₅₄₄O₂₇₄₃S₅₇;氨基酸组成中丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Gln)和丝氨酸(Ser)占比最大,分别为8.2%、7.9%和7.8%,酸性残基的数量(Asp+Glu)为187个,碱性残基的数量(Arg+Lys)为204个,预测蛋白质分子质量和等电点分别为204.1 ku和8.79,具有Vitellogenin-N、DUF1943和VWD共3个典型保守结构域。GmVg成虫期的表达量显著高于...     

新疆巴什拜羊BPI基因cDNA全长的克隆及序列分析

【目的】克隆巴什拜羊杀菌/通透性增强蛋白(BPI)的cDNA序列,为研究该蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到中性粒细胞后提取RNA。根据GenBank中牛BPI基因的cDNA序列设计兼并引物,用RT-PCR方法扩增巴什拜羊BPI基因部分序列,再根据已知的巴什拜羊BPI基因部分序列设计RACE引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,分别回收克隆的目的基因片段,再与pMD18-T载体连接,分别转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后进行拼接,获得巴什拜羊BPI基因全长cDNA序列,并对序列进行分析。【结果】克隆的巴什拜羊BPI基因cDNA序列全长1 922bp,其中开放阅读框为1 452bp,共编码483个氨基酸;BLAST分析表明,巴什拜羊BPI基因的核苷酸序列与绵羊、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾核苷酸的一致性分别为99%,91%,78%,74%,64%,61%,58%,53%和50%;氨基酸进化分析显示,巴什拜羊首先与绵羊聚为一类,其次与牛聚为一类,该聚类分析结果与生物学分类结果表现一致。【结论】通过RACE方法成功地克隆了1 922bp的巴什拜羊BPI基因cDNA全长序列,且基因进化树聚类结果与生物学分类结果相一致。     

梨小食心虫和梨实蜂的发生与防治

本文介绍了梨小食心虫和梨实蜂的生活史、习性以及为害症状。并提出了相应的防治方法．以供种植者参考。     

梨小食心虫的天敌资源

对文献资料中的梨小食心虫天敌和山西太谷县主要果品产区的天敌资源进行了调查,查明梨小食心虫天敌共255种,其中,寄生性252种(中国48种),捕食性3种,分属昆虫纲(膜翅目、双翅目、缨翅目、鞘翅目)和蛛形纲(蜱螨目),共5个目20个科,具有应用潜力的天敌昆虫7种,已经成功应用于生产中的天敌昆虫5种;山西省分布共10种,均为膜翅目寄生性天敌,在太谷县分布有3种,其中,齿腿姬蜂属(Pris-tomerus sp.)和瘤姬蜂属(Pimplini sp.)可以与梨小食心虫同时羽化。     

桃园梨小食心虫迷向素应用试验初报

在兰州桃园投放梨小食心虫迷向素,观察其对梨小食心虫的控制效果。结果表明,桃园连续应用梨小食心虫迷向素的第3年,诱集到的梨小食心虫成虫数量比第1次应用当年减少16倍以上,比应用前1 a减少了25倍以上;梨小食心虫折梢率比应用第2年降低7.7%以上,平均蛀果率降低5%,应用效果良好。     

10种杀虫剂对梨小食心虫Grapholita molesta(Busck)卵的室内触杀效果

筛选对梨小食心虫卵具有高效触杀作用的药剂,旨在为该虫卵期的科学防治提供依据。采用浸渍法测定三唑磷、辛硫磷、哒螨啉、噻嗪酮、灭多威、除虫脲、丙溴磷、氟铃脲、仲丁威、丁醚脲10种药剂对梨小食心虫卵的室内触杀效果。结果表明,25%丁醚脲EC、20%氟铃脲WDG、20%哒螨灵WP和25%噻嗪酮SC的各稀释倍液的校正死亡率均低于0.1%,对梨小食心虫卵基本没有触杀效果;90%灭多威WP 500倍液对梨小食心虫卵的触杀效果最高(死亡率99.33%),其次为100g/L丙溴磷乳油2 000倍液处理(死亡率97.67%);40%辛硫磷EC 500和1 000倍液、100g/L丙溴磷EC 2 500倍液、90%灭多威WP 1 000倍液的触杀效果均高于80%。综合考虑,建议使用90%灭多威WP的500~1 000倍液、40%辛硫磷EC 500~1 000倍液或50%仲丁威EC 500倍液进行梨小食心虫的卵期防治。     

梨小食心虫成虫行为节律研究

【目的】研究梨小食心虫成虫行为节律,为开展梨小食心虫化学生态学研究及其综合治理奠定基础。【方法】在人工气候箱(温度(24±0.5)℃、相对湿度(70±10)%、光周期为15h光期和9h暗期)条件下,系统观测了梨小食心虫成虫羽化、交配及产卵行为节律。【结果】梨小食心虫成虫的羽化具有明显的昼夜节律,主要发生在光期05:00-10:00这个时段,此时成虫的羽化数量占总羽化数量的90%以上,其中以05:00-06:00羽化率最高,与其他时段差异显著;成虫的求偶交配行为多发生在羽化后第3天,呈"一"字形交配,单次交配持续时间为11～35min,平均为22.07min,成虫交配活动主要发生在17:00-21:00,交配率超过90%;梨小食心虫雌成虫的产卵节律与其交配节律颇具相似性,其产卵活动也主要发生在17:00-21:00,该时段所产卵量达到总产卵量的87.43%,显著高于其他时段。【结论】梨小食心虫成虫的羽化、交配及产卵行为具明显的生物节律,其中羽化行为主要发生在上午05:00-10:00,交配和产卵行为主要发生在傍晚17:00-21:00。     

梨小食心虫普通气味结合蛋白2（GmolGOBP2）cDNA的克隆与原核表达

【目的】克隆梨小食心虫(Grapholita molesta)普通气味结合蛋白2(GmolGOBP2)的全长cDNA序列并进行原核表达,为研究该蛋白在梨小食心虫化学感受系统中的作用奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆GmolGOBP2的全长cDNA序列,并使用原核表达载体pET-32a在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,用SDSPAGE和Western blot检测其表达情况。【结果】GmolGOBP2的cDNA全长序列为637bp(GenBank登录号:JN857940),开放性阅读框长度为483bp,编码161个氨基酸残基,成熟蛋白分子质量为15.98ku,等电点为4.85。GmolGOBP2预测蛋白的N末端具20个氨基酸残基组成的信号肽序列,并且氨基酸序列中具有6个保守半胱氨酸的典型气味结合蛋白家族标志。将GmolGOBP2编码序列重组到表达载体pET-32a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,梨小食心虫普通气味结合蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出分子质量约为32ku的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子质量大小一致。【结论】克隆并原核表达了GmolGOBP2的cDNA序列,可用于研究该蛋白分子结构及其在化学感受系统中的功能。     

梨小食心虫滞育与非滞育幼虫抑制性消减文库的构建与分析

【目的】分离和鉴定梨小食心虫（Grapholita molesta（Busck））滞育相关基因。【方法】分别以梨小食心虫滞育和非滞育幼虫为材料,通过抑制性消减杂交技术（SSH）,构建梨小食心虫滞育与非滞育正、反向差减cDNA文库,从中筛选梨小食心虫滞育相关基因,并对其进行测序和分析。【结果】在获得的128个滞育特异和132个非滞育特异的EST中,有滞育差异表达EST 42条（17条功能未知）、非滞育差异表达EST 46条（22条功能未知）。对差异表达EST同源检索后推测,其功能大部分与滞育或非滞育特性相关。在滞育个体中,代谢酶和滞育关联蛋白基因表达量较高;在非滞育个体中,贮存蛋白和信号传递基因表达量较高。【结论】这些EST基本反映了梨小食心虫在滞育与非滞育期间的基因表达谱,为今后深入研究梨小食心虫滞育的分子机理奠定了基础。     

成虫饲养密度对梨小食心虫寿命及生殖力的影响

【目的】明确成虫饲养密度对梨小食心虫寿命及生殖力的影响,为梨小食心虫的室内继代饲养提供参考。【方法】利用室内继代饲养的梨小食心虫,在雌雄比1∶1条件下,分别设置5,10,15,20和25对5个饲养密度,较系统地观察雌雄虫寿命、产卵前期、产卵期、产卵量、后代孵化率等主要生物学参数并进行比较分析。【结果】饲养密度为15对时,雌成虫寿命显著低于其他饲养密度下的雌成虫寿命,雄成虫寿命显著高于其他饲养密度下的雄成虫寿命,雌成虫寿命极显著低于雄成虫。饲养密度为5对时,产卵前期显著高于其他饲养密度下的产卵前期,不同饲养密度梨小食心虫产卵期无显著差异。饲养密度为5对时,单雌产卵量显著低于饲养密度为10对、15对和25对下的单雌产卵量。在不同饲养密度下,梨小食心虫后代卵孵化率无显著差异,其单雌日产卵量均呈先增后减的趋势。饲养密度为10对、15对、25对时,其产卵高峰单雌日产卵量显著高于饲养密度为5对时的产卵高峰单雌日产卵量。回归分析表明,饲养密度(x)与总产卵量(y)之间的关系符合S型曲线方程。【结论】梨小食心虫成虫寿命因不同的饲养密度和性别而异,在500mL烧杯空间内,以饲养密度15对最佳。     

梨小食心虫触角感器的超微结构

【目的】明确梨小食心虫触角外部形态及其感器种类与分布,以期为深入了解其化学感受系统,揭示其寄主选择行为机制奠定基础。【方法】取当天羽化的梨小食心虫雌、雄成虫各10头,对触角进行处理后,利用扫描电镜对梨小食心虫成虫触角形态及感器进行了观察。【结果】梨小食心虫成虫触角呈丝状,触角感器共有7种,分别为毛形感器、锥形感器、刺形感器、栓锥形感器、腔锥形感器、耳形感器和Bhm氏鬃毛,其中毛形感器和锥形感器各有2种类型。梨小食心虫雌、雄成虫之间触角感器的类型、分布均无明显差异。不同感器在触角上的数量与分布不同。【结论】梨小食心虫有丝状触角,其上共分布有7种类型的感器,且雌、雄成虫之间触角感器的类型及分布规律相似。     

梨小食心虫人工饲料的研究

【目的】研究人工饲料中营养成分不同配比对梨小食心虫生长发育和繁殖的影响,寻找适宜梨小食心虫生长发育和繁殖的较好人工饲料配方,为其室内饲养提供参考。【方法】选择不同的人工饲料营养成分及配比,经过预试验,从配制的9种人工饲料中选出4种对梨小食心虫生长发育和繁殖较好的配方,通过测定存活率、发育历期、幼虫质量、蛹质量、成虫寿命、生殖力等指标,观察不同配方饲料对梨小食心虫生长发育和繁殖的影响。【结果】取食配方Ⅳ的试虫存活率、幼虫质量、蛹质量、雌虫寿命、成虫生殖力、净增值率、内禀增长率和周限增长率等指标均较取食配方Ⅰ、配方Ⅱ、配方Ⅲ的试虫显著提高(P<0.05),发育历期、平均世代周期和种群加倍时间显著缩短(P<0.05)。【结论】在供试的4种人工饲料中,按照配方Ⅳ配制的人工饲料适宜梨小食心虫的生长发育和繁殖,可用于梨小食心虫的实验室人工饲养。     

梨小食心虫室内饲养技术的改进

探索利用不同器皿及饲养密度在室内饲养梨小食心虫,寻找最适的饲养容器和饲养密度组合,为室内大量饲养梨小食心虫提供参考.选用不同饲养容器(1 cm×10 cm试管,2 cm×15 cm试管和d=10 cm、h=5 cm圆盒)、不同大小的饲料(长方体:0.7 cm×0.7 cm×2 cm,1.4 cm×1.4 cm×3 cm...     

罗布麻查尔酮合成酶基因克隆及序列分析

为了解罗布麻査尔酮合成酶基因具体结构,采用RT-PCR、RACE方法从夹竹桃科植物罗布麻中扩增出CHS基因的开放阅读框,其核苷酸序列长1 170bp,推测的氨基酸序列全长为389个氨基酸残基。核苷酸序列同源性分析结果显示,该cDNA片段与其他植物CHS基因的同源性为78%~81%,表明该基因在进化过程中变异程度较小,整个超基因家族序列高度保守。     

梭梭糖基转移酶基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物糖基转移酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到2个同源的序列,分别命名为HaUGT1和HaUGT2。基因测序结果显示,HaUGT1基因编码区长1 485bp,编码495个氨基酸;HaUGT2基因编码区长1 185bp,编码394个氨基酸。HaUGT1和HaUGT2蛋白具有保守的PSPG基序、UDP-葡萄糖基转移酶结构域,与其他植物中的糖基转移酶蛋白同源性较高。