刀鲚水通道蛋白1的分子克隆及高盐作用下的表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)克隆获得了刀鲚(Coilia nasus)水通道蛋白1(AQP1)全长cDNA序列。其碱基序列全长为1299 bp,5′端、3′端非翻译区(untranslated regions,UTR)长度分别为107 bp和458 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为777 bp,共编码258个氨基酸。理论等电点是6.13,蛋白分子量为27.1 kD。结构分析表明,刀鲚AQP1具有水通道蛋白家族典型结构特征,包括6个跨膜结构域,2个天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)特征序列,同时还具有AQP1抑制剂含汞化合物的半胱氨酸结合位点。序列同源性及系统进化分析表明,其与同属鲱形目的大西洋鲱的同源性最高(93%),并且与其聚为一支。实时荧光定量分析结果表明,刀鲚AQP1基因在多种组织中有表达,包括脑、鳃、肝、前肠、后肠、中肾、肌肉。高盐度作用后,AQP1在渗透调节作用关键组织鳃、中肾、肠中的表达水平有显著差异(P0.05),体现了AQP1在刀鲚渗透调节中的重要作用。本研究结果可为今后进一步探讨刀鲚渗透调节相关基因的调控机制提供理论参考。     

急性操作胁迫对刀鲚应激反应相关神经内分泌因子的影响

为深入了解刀鲚应激反应中相关神经内分泌因子作用的分子机理,采用手工捕捉的方式对刀鲚进行了急性操作胁迫。通过放射免疫法和化学发光法测定刀鲚应激反应后头肾和血浆皮质醇含量的变化,结果显示,刀鲚胁迫刺激后血浆皮质醇含量极显著性升高,血浆皮质醇浓度平均升高56.48%,头肾皮质醇含量显著性升高,头肾皮质醇浓度平均升高49.68%,表明急性操作胁迫确实引起刀鲚的应激反应。通过同源克隆的方法获得刀鲚促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、硬骨鱼紧张肽(UI)、阿黑皮素原(POMC)基因的部分序列,并应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测上述神经内分泌因子mRNA的表达变化,结果显示,CRH基因的表达水平极显著性下降,POMC基因的表达水平显著性下降,UI基因的表达水平有下降趋势但不显著。上述结果显示,皮质醇、CRH、UI和POMC等神经内分泌因子通过鱼类下丘脑—脑垂体—肾间腺轴参与刀鲚应激反应的调节,为进一步了解刀鲚胁迫应答的作用机理,实现对其有效调控打下基础。     

鄱阳湖刀鲚的鉴定与资源动态研究

为研究潘阳湖刀鲚资源状况, 2019—2020 年在鄱阳湖开展鱼类资源调查工作, 采集到大量鲚属(Coilia)鱼类, 对这些样本进行了形态学和分子生物学的鉴定。随机测量 112 尾样本的上颌骨长度显著大于头长, 长颌长/头长的范围为 1.00~1.46, 平均为 1.17±0.07。使用线粒体 Cyt b 基因和 D-loop 控制区序列作为分子标记, 对 22 尾随机样本进行物种鉴定, 结果显示 22 尾样本均为刀鲚(Coilia nasus)。对其中 5 尾样本耳石的微化学特征进行了测定, 结果显示耳石锶钙比(Si/Ca)均有大于 3 的过程出现, 表明样本为溯河洄游型刀鲚。2019—2020 年, 刀鲚在鄱阳湖中的单船产量分别达到 8.1 ind/d 和 142 ind/d, 与历史数据相比, 出现了一定的增长。鄱阳湖刀鲚资源量的恢复表明长江禁渔制度实施和取消刀鲚特许捕捞制度取得了良好的效果, 建议进一步开展鄱阳湖刀鲚产卵场调查并加强栖息地保护, 促进刀鲚资源恢复。     

长江刀鲚寄生的异钩铗虫分子鉴定及形态学研究

为了获知长江刀鲚寄生的异钩铗虫的分类学地位,采用光学、扫描电子显微镜和分子遗传扩增28S rRNA基因5’端部分序列相结合的方法,对长江刀鲚寄生的异钩铗虫进行种属鉴定和形态学研究。结果显示,后吸器与体前区分不明显,含有四对不对称的吸铗,其中一侧的前2个开放几丁质吸铗明显大于其余6个封闭的吸铗,虫体尾部带有二对端钩,卵两端具有较长的极丝。序列分析显示,林氏异钩铗虫与六棘异钩铗虫相似度为100%,邻接法构建分子进化树中处在同一分支。经形态及分子综合分析鉴定,此寄生虫为林氏异钩铗虫。     

长江刀鲚选育群体转录组EST-SSR的分布特征分析

本研究利用MISA软件挖掘长江刀鲚(Coilia ectenes)肌肉和肝脏转录组中的微卫星标记,为刀鲚选育群体的种质资源评估和分子标记辅助育种奠定基础。结果显示,从71869条Unigenes中共获得33896条重复单元长度为1~6碱基的微卫星序列;刀鲚转录组中不同类型微卫星的重复基序具有不同的分布特征,其中,单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复为主要的微卫星重复类型,分别占总微卫星数目的34.94%、49.47%和13.34%;不同微卫星重复类型的优势重复基序亦有所不同,其中,A/T为单核苷酸重复基序的优势重复基序占86.25%,AC/GT为二核苷酸重复基序的为优势重复基序占75.25%,AGG/CCT为三核苷酸重复基序的优势重复基序占28.57%;不同微卫星重复基序核苷酸的数量和重复次数亦有所不同,重复次数伴随着重复单元中核苷酸数量的增加而呈现降低的趋势;从100对四核苷酸重复的SSR引物中筛选获得了16对多态性微卫星标记,并以此为基础,对长江刀鲚选育群体(F3)的遗传学特征进行了初步评估,结果显示,长江刀鲚选育群体F3的平均有效等位基因数(Ne)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)和Shannon多样性指数I分别为1.7580、0.3414、0.3977和0.6278。以上结果表明,基于刀鲚转录组数据批量开发微卫星是切实可行的,所开发的多态性微卫星标记能够应用于长江刀鲚选育群体的遗传背景评估和进一步的遗传育种研究。     

长颌鲚与短颌鲚物种地位研究取得重要进展

正作为"长江三鲜"之首,刀鲚的资源保护一直备受关注。长江流域刀鲚资源组成复杂,除长颌鲚外,还分布有短颌鲚种群。两者皆有溯河洄游和淡水定居的生态表型的相似性,给刀鲚资源的精准保护带来了困难。长颌鲚与短颌鲚物种地位的争论由来已久。早期学者基于生态习性、形态学特征、可量性状和可数性状等将长颌鲚和短颌鲚视为两个独立的物种。21世纪初,一些学者基于线粒体或核基因标记的分析,否定了短颌鲚和长颌鲚的物种地位,而统称其为同一物种——刀鲚,并认为短颌鲚和长颌鲚均为刀鲚的不同生态型。     

刀鲚MSTN基因遗传多态性与生长性状的关联分析

为筛选刀鲚(Coilia ectenes)生长性状遗传改良的分子遗传标记,基于现有刀鲚转录组数据,利用基因克隆技术获得养殖刀鲚肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因的全长序列,采用PCR产物直接测序和SNaPshot技术分别进行基因多态性的筛选和分型,并将不同基因型与刀鲚的生长性状(体长、体高和体质量)进行关联分析。结果显示,养殖刀鲚MSTN基因的DNA序列主要由2个内含子和3个外显子组成,经SNP位点筛选,仅在第1内含子上筛选到2个颠换突变位点(g.564G>T和g.755G>T)和1个转换突变位点(g.786C>T);将3个SNP位点与生长性状进行关联分析发现,SNP位点g.786C>T与刀鲚的体长、体高和体质量呈显著性负相关,具有TT基因型个体的体长、体高和体质量显著低于CC型和CT型(P<0.05),而SNP位点g.564G>T和g.755G>T的不同基因型仅与刀鲚的体高具有一定程度的相关性;3个SNP位点对养殖刀鲚的群体遗传分析显示,刀鲚养殖群体的观测杂合度(H O)、期望杂合度(H E)和多态信息含量(PIC)分别为0.280~0.480、0.332~0.455和0.277~0.351,3个SNP位点均属于中度多态(0.25T有望作为剔除劣质刀鲚繁育亲本的候选分子标记。     

锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白基因的PCR扩增与序列分析

为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白（KHV-MEP）的功能及锦鲤疱疹病毒（KHV）的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤（Cyprinus carpio Koi）肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段。将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件TMpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2。所获得的基因片段大小为771bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因（AB178537）的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点（PI）为8.65。该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇。结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因。     

锦鲤疱疹病春主要囊膜蛋白基因的PCR扩增与序列分析

为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白(KHV-MEP)的功能及锦鲤疱疹病毒(KHV)的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤(Cyprinus carpio Koi)肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段.将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件Tmpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2.所获得的基因片段大小为771 bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因(AB178537)的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点(PI)为8.65.该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇.结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因.     

缘管浒苔rbcL全长cDNA克隆与序列分析

对缘管浒苔光合作用第一关键酶Rubisco大亚基基因(rbcL)全长cDNA序列进行了克隆分离。首先应用RT-PCR方法获得了rbcL大片段cDNA序列,序列长度为1101bp,并进行了测序分析。然后分别应用5′RACE方法和3′RACE方法获得2个克隆序列,其序列长度分别为371bp和579bp,并进行了测序分析。在此基础上,将3个片段序列进行拼接,获得了Rubisco大亚基全长cDNA序列(1472bp),其中包括1425bp的编码区序列及47bp的前导序列(NCBI登录号:DQ813496),并推断出蛋白质序列(474个氨基酸)。对序列进行了相关生物信息分析和同源性比对,结果显示与已克隆出全长rbcL基因的7种绿藻比较具有较高同源性,核苷酸序列和蛋白质序列同源性分别达到了82.07%～85.78%和88.00%～94.11%,其中与蛋白核小球藻蛋白质序列同源性最高,为94.11%。在此基础上,使用生物信息学软件对缘管浒苔rbcL氨基酸序列与其它植物或藻类进行了多序列比对,并且进一步应用在线软件程序进行了蛋白质的二级结构分析和三级结构预测。     

刀鲚基因家族鉴定及扩张与收缩

为增加对刀鲚在进化过程中因核心基因家族改变而产生的特殊机制的了解。实验利用比较基因组学,通过比较刀鲚及其近缘物种斑马鱼、三刺鱼、青鳉、红鳍东方鲀和绿河鲀基因组,鉴定刀鲚基因家族;利用CAFév 4.2软件进行基因家族扩张和收缩分析;最后将鉴定的扩张基因家族基因与GO、KEGG等数据库进行比对、注释和通路分析。结果显示,刀鲚具有11 872个基因家族,包含16 470个基因,有2 963个基因未形成基因家族。同其他5个物种相比,刀鲚有150个特有基因家族,包含419个基因。刀鲚扩张和收缩基因家族分析结果表明,刀鲚有1 200个基因家族扩张了,7 543个基因家族收缩了。刀鲚显著扩张的基因家族有39个,包含508个基因;显著收缩的基因家族有36个,包含21个基因。刀鲚显著扩张基因家族GO富集分析条目中鉴定较多的是,代谢过程、催化活性、细胞、细胞组分等。KEGG富集分析条目中鉴定较多的是紧密连接、心肌细胞的肾上腺素能信号、心肌收缩、细胞黏附分子等。与渗透压调节相关的通路有紧密连接、心肌收缩等;与生殖洄游行为相关的通路有GnRH信号通路、嗅觉转导通路等。对显著扩张基因家族基因进行基因组定位,结...     

基于耳石微化学的刀鲚群体生境履历研究进展

刀鲚(Coilia nasus)是一种经济价值高的洄游型鱼类。受过度捕捞、生态环境污染以及水利工程建设等影响,其资源量已极度匮乏。总结了日本水域、黄河水域和长江水域内刀鲚生境履历的研究进展,解析不同水域刀鲚群体的生境履历模式,以期为刀鲚资源保护提供科学支撑和参考资料。随着长江十年禁渔计划的实施,充分了解长江水域刀鲚的生境履历,有助于为中国刀鲚资源的保护和恢复提供参考。     

长江刀鲚商品鱼池塘主养技术

<正>长江刀鲚,俗称刀鱼,是长江三大名贵江鲜之一。多年来,受生态环境恶化、过度捕捞及涉江渉海工程建设等多种因素的影响,洄游性长江刀鲚资源急剧衰退,其价格一路飙升,近年大规格刀鲚已达每千克越万元的天价。从2007年起,江苏省泰州市积极探索长江刀鲚人工养殖技术,先后突破长江刀鲚苗种捕捞技术、运输技术、驯养技术、繁殖技术、大规格苗种培育技术及商品刀鲚养成技术,为长江     

不同鲚属鱼类Cyt b和D-loop序列的比较及其判别早期生活史个体的潜力分析

使用mtDNA作为分子标记,基于1022 bp和1322 bp左右的部分序列分析刀鲚(Coilia nasus)、湖鲚(C.nasus taihuensis)、七丝鲚(C.grayii)及凤鲚(C.mystus)成鱼之间的遗传关系。结果显示,刀鲚和湖鲚间的遗传距离分别为0.0036±0.0008和0.0038±0.0008,凤鲚与刀鲚、湖鲚的遗传距离分别为0.1215±0.0111、0.1228±0.0111(Cyt b)和0.1075±0.0108、0.1067±0.0107(D-loop),七丝鲚与刀鲚、湖鲚的遗传距离分别为0.0342±0.0056、0.0351±0.0057(Cyt b)和0.0527±0.0069、0.0529±0.0070(D-loop),七丝鲚和凤鲚间的遗传距离分别为0.1158±0.0111和0.1123±0.0111。用Kimura双参数模型构建的2种序列的NJ分子系统树均显示,湖鲚和刀鲚不能形成独立的分支,而是混合聚在一起形成1个分支;七丝鲚和凤鲚则形成另外2个分支。首先根据采样点不同可初步断定未知仔幼鱼为刀鲚,稚鱼为湖鲚,而后对未知种仔幼鱼、稚鱼和刀、凤鲚鱼卵的2种序列的分析发现,不同采集点内部的这些早期生活个体间的遗传距离分别为0.0024~0.0032和0.0025~0.0082。在Kimura双参数模型构建的NJ分子系统树中,未知种仔幼鱼、稚鱼、刀鲚鱼卵与刀鲚、湖鲚聚为一类,凤鲚鱼卵与凤鲚聚为一支。由此可见,Cyt b基因序列和D-loop序列作为分子标记,虽然可以区分刀鲚、凤鲚以及七丝鲚的仔幼、稚鱼及鱼卵,但不能有效区分湖鲚和刀鲚的早期生活个体。     

两种耳石分析法在鲚属种间和种群间识别效果的比较研究

采用耳石传统形态测量法和傅里叶形态分析法,对281尾2龄长江凤鲚(Coilia mystus)和刀鲚(C.nasus)个体的矢耳石形态学作了分析,结果表明,采用传统的耳石形态测量法对凤鲚与刀鲚种间的正判率达90.9%,但2个刀鲚生态型种群之间的判别成功率仅为76.9%。而运用傅里叶耳石形态分析法,凤鲚和刀鲚物种间的识别率高达100%,2个刀鲚生态型间的识别率也提高至86.8%。可见,两种耳石形态分析法对鲚属种间的识别效果均很好,但对种群分析而言,傅里叶形态分析法可以取得更好的识别效果。     

安徽无为长江段刀鲚生殖洄游群体年龄结构的变化分析

为了分析我国名贵鱼类长江刀鲚(Coilia ectenes)数量不断减少的趋势及原因,从而提出资源保护与恢复对策,2006年3～7月在安徽无为长江段,对捕捞刀鲚的渔具、渔法和刀鲚渔获量、种群年龄结构、平均体长、体重进行了野外调查.结果表明,86个网次共捕获刀鲚536尾、34.57 kg,最高网次捕获量仅0.85 kg;经抽样,对100尾刀鲚进行测定,体长为21.7～42.1 cm、体重为20～235 g;体长、体重相关式为W=0.0011L3.3312(R2=0.969);种群年龄组成中以2+龄和3+龄个体为主,也能捕获1+和4+龄个体,5+和6+龄个体较少;与1972年相比,捕获量由41.56 t降至2～3 t.分析认为,刀鲚资源衰退的主要原因是长江水文条件的变化使刀鲚产卵场受到破坏,不断升高的市场价格引起对刀鲚的过度捕捞,而水质污染程度的日趋加重也不利刀鲚的生长繁殖.保护与恢复刀鲚资源的对策应该是建立刀鲚繁殖场保护制度,取缔网目5 cm以下的网具或禁捕2～3年.     

广东佛山地区鸭圆环病毒分子流行株遗传变异分析

目的 研究广东佛山地区鸭圆环病毒(DuCV)流行毒株的遗传变异情况。方法 采用常规PCR方法，对采自广东佛山的3份阳性鸭组织样品中扩增Rep基因部分片段和Cap基因，进行核苷酸序列测序，并将Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列与30株参考序列进行同源性比较和遗传变化分析。结果 3份阳性样品分别扩增出相应的基因片段；Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列进化树和同源性分析显示，3株DuCV流行株与台湾株(AY3947213)在同一进化支，均属于DuCV-2型，与同分支的参考毒株相似性分别为97.2%～100%和96.9%～100%,2个基因型中Rep基因同源性高于Cap基因；氨基酸序列的变异分析表明，与中国台湾株(AY3947213)相比较，Rep部分氨基酸和Cap氨基酸分别发生相同位置的氨基酸置换和单独突变，Cap氨基酸突变位点多于Rep氨基酸。结论 研究测得的3株DuCV流行株均属于DuCV-2型，在广东地区有一定范围的流行，且CAP蛋白的变异程度高于REP蛋白，为鸭圆环病毒感染的监控和诊断提供了依据。     

刀鲚卵巢发育调控机理研究取得进展

正8月22日,中国水产科学研究院淡水渔业研究中心刀鲚种质资源与繁养创新团队发表了刀鲚卵巢发育不同步调控机理的研究成果。刀鲚享有"长江三鲜"之首的美誉,是我国重要的生殖洄游性鱼类。该物种的保护开发具有较大的生态价值、学术价值和经济价值。刀鲚雌鱼群体卵巢发育呈现明显的不同步性,这严重困扰着刀鲚苗种规模化繁育的进一步发展。因此,刀鲚种质资源与繁养创新团队针对刀鲚卵巢发育群体不同步的问题,应     

刀鲚POMC基因的cDNA克隆及其应激应答

为了研究刀鲚(Coilia nasus)阿黑皮素原(proopiomelanocortin,POMC)基因的应激应答及调控,克隆了刀鲚POMC基因的c DNA全长。刀鲚POMC基因的c DNA全长2030 bp,编码区699 bp,编码232个氨基酸。二级结构预测显示,刀鲚POMC包括信号肽(signal peptide)、N末端区(N-terminal region,NPP)、促肾上腺皮质激素结构域(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、β-脂解素(β-LPH)、α-促黑素(α-MSH)、促肾上腺皮质激素样垂体中叶多肽(CLIP)、γ-脂解素(γ-LPH)、β-促黑素(β-MSH)和β-内咖肽(β-EP)结构域。运用荧光定量的方法检测了该基因在刀鲚不同组织中的表达分布。结果显示,POMC在健康刀鲚的脑高表达,鳃、肾、精巢相对高表达,肝、脾、肠、头肾、肌肉和卵巢中微量表达。运输胁迫后,POMC基因的表达量显著下降(P0.05);10‰ NaCl组4 h和6 h POMC基因的表达量显著上调(P0.05),6 h的表达量恢复至应激前。POMC基因在脂肪代谢及应激调控中发挥重要的功能,本研究结果可为该基因在刀鲚后续育种及应激调控工作提供重要基础。     

刀鲚PPARγ基因的cDNA克隆及其应激应答

旨在研究刀鲚(Coilia nasus)过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor, PPARγ)基因的应激调控表达,克隆并获得了刀鲚PPARγ基因的cDNA全长。刀鲚PPARγ基因的cDNA全长1951 bp,开放阅读框1470 bp,预测编码489个氨基酸。刀鲚PPARγ包括4个功能结构域,即A/B区, DNA结合区(DNA binding domain, DBD区),铰链区,配体结合区(ligand binding domain, LBD区)。运用荧光定量PCR (real time quantitative PCR, RT-qPCR)检测刀鲚PPARγ基因在不同组织、运输胁迫和胚胎发育时期的表达。结果显示,刀鲚PPARγ在各组织中均有表达,其中在肝中表达量最高,在脑、肠、心脏、肾、头肾、肌肉中相对高表达,在鳃和脾中微量表达。运输胁迫过程中, PPARγ基因表达显著上调(P0.05),在4 h达到峰值,随后显著降低,但仍高于对照组。PPARγ在胚胎发育时期各时期均表达,其中在受精卵时期高表达,随后表达量急剧降低,并在此后的时期一直处于较低的表达水平。PPARγ基因在应激过程中发挥重要作用,也是胚胎发育过程中重要的基因。本研究为刀鲚的人工繁育和应激调控提供了理论基础。