拟南芥xtc1突变体的图位克隆分析

【目的】分析拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡的组分和含量,并鉴定导致xtc1突变体表型的基因。【方法】通过气相色谱法分析拟南芥xtc1突变体与Ler野生型茎部表皮蜡的成分;利用图位克隆确定突变基因位点,通过在拟南芥xtc1突变体中过量表达FATB基因,验证突变位点与FATB基因的关系。【结果】拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡总量约为Ler野生型的1/3,且各组分含量均明显减少;将突变基因定位在第1染色体顶端物理距离为80kb的2个标记T27G7-3和F22O13-1之间,该区域含有21个基因。T-DNA插入突变体观察及测序分析表明,xtc1突变体在At1g08510(FATB)基因的第1个外显子上产生14个碱基的缺失,导致翻译提前终止;在xtc1突变体中过量表达FATB基因可恢复xtc1突变体的正常表型。【结论】拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡含量减少,且突变基因为FATB基因。     

TmFAD2和BnFAD3双基因载体的构建及转化株脂肪酸分析

必需脂肪酸亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)在植物中的合成过程一直备受研究者的关注。本研究利用旱金莲中合成亚油酸的油酸脱饱和酶基因TmFAD2及甘蓝型油菜中合成亚麻酸的亚油酸脱饱和酶基因BnFAD3,在pRD400骨架载体的基础上,构建同时表达TmFAD2和BnFAD3的串联双价载体pSFF。通过农杆菌介导的花序浸蘸法完成pSFF对拟南芥哥伦比亚野生型的转化,观察发现转基因植株的第1对真叶有不同程度的畸形。按照畸形程度将其划分为4个等级,气相色谱分析4个等级叶片及其后代种子中脂肪酸的组成及含量,发现随着畸形程度的增高,叶片和种子中亚麻酸C18∶3含量都呈现降低的趋势。     

绿色荧光蛋白在IGF2b基因慢病毒载体感染鲤受精卵中的标记效果

以水母绿色荧光蛋白基因为模板进行PCR扩增得到目的基因(Green fluorescence protein, GFP),然后加上酶切位点BamHI和NheI,构建pLenti6.3IRESEGFP载体,转染DH5α感受态细胞进行菌落PCR,取阳性进行酶切鉴定,再取呈阳性的质粒进行测序,使用浓度为1 μg/μL的质粒与慢病毒表达载体进行连接,通过荧光显微镜观察到绿色荧光,表明本实验获得的GFP和慢病毒载体整合成功;用此转染293T细胞,通过荧光显微镜同样检测到了绿色荧光。使用建鲤的组织提取RNA,然后按照Fermentas公司的MMLV操作说明书进行反转录,得到IGF2b基因后加酶切位点进行扩增,将IGF2b整合到用GFP作为标记基因的慢病毒载体上,再以此转染建鲤未分裂的受精卵,48 h后通过荧光显微镜也观察到了绿色荧光蛋白的表达。试验表明绿色荧光蛋白在IGF2b基因慢病毒载体感染鲤受精卵中的标记是成功的。这些结果为基于含有GFP慢病毒转基因鱼育种技术的开发奠定了基础。     

唐菖蒲蛋白磷酸酶GhPP2C1基因功能及其对ABA的响应

为探究唐菖蒲GhPP2C1（Protein phosphatase 2C1）的功能及对脱落酸（Abscisic acid,ABA）的响应,以唐菖蒲‘Rose Supreme’为试材,利用同源克隆的方法获得ABA信号转导过程中的关键蛋白磷酸酶基因GhPP2C1,利用实时荧光定量分析、亚细胞定位和启动子β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色等方法检测其对ABA的响应情况;对其启动子序列进行响应元件分析;在拟南芥中异源过表达GhPP2C1基因,对转基因株系进行ABA敏感性测定、株型分析及下游基因表达情况分析。结果表明：1）GhPP2C1的表达在ABA处理的诱导下显著上调。2）GhPP2C1定位于细胞质中,可被ABA处理诱导入核。3）GhPP2C1基因启动子包含ABA、赤霉素（Gibberellins,GAs）、干旱和低温相关响应元件。在烟草叶片和拟南芥根尖中,GhPP2C1启动子活性可被ABA激活。4）在拟南芥中异源过表达GhPP2C1基因导致ABA信号通路中下游基因的表达量显著下降并出现分枝数、株高和种荚数量明显增加的表型。综上,推测唐菖蒲GhPP2C1可能通过减弱ABA信号传导,促进种子休眠解除,且在植株营养生长过程中也发挥作用。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

拟南芥SUC2-1突变体的快速繁殖

以拟南芥SUC2-1突变体为材料研究了快速繁殖的方法。     

日粮NDF水平对断奶獭兔肠MUC1与MUC2表达的影响

研究日粮中性洗涤纤维(NDF)水平对断奶獭兔肠粘蛋白基因MUC1与MUC2表达的影响,用以粘蛋白反映的肠黏膜免疫状况来确定最佳的日粮NDF添加水平。试验选用56只体质量相近的35日龄断奶幼兔,随机均分4组,分别饲喂含NDF 29%、33%、37%、41%的日粮,饲喂28d后,分别采集十二指肠、空肠、回肠、盲肠样品,-80℃保存,对MUC1及MUC2进行RT-PCR实时荧光定量。结果表明,十二指肠、空肠、盲肠中的MUC1各自表达受NDF水平影响不显著(P0.05),回肠中NDF 37%组MUC1表达量较NDF 29%组表达量上调4.95倍(P0.05),其余组无差异(P0.05);空肠、回肠、盲肠中的MUC2各自表达受NDF水平影响不显著(P0.05),十二指肠中NDF 33%组、NDF 37%组MUC2表达量较NDF 29%组依次上调2.65倍(P0.05)、3.13倍(P0.05),其余组无差异(P0.05);十二指肠与回肠有较高的MUC1及MUC2异常表达概率,空肠MUC1及MUC2异常表达概率较低,盲肠MUC1及MUC2异常表达概率均为0.00;NDF 37%组MUC1及MUC2异常表达概率在4组中最高,分别为0.30、0.23;NDF 33%组MUC1及MUC2异常表达概率在4组中最低分别为0.10、0.08。该研究显示,MUC1与MUC2肠表达量可反映肠道健康状态,獭兔十二指肠与回肠是病变感染易发区;日粮纤维可以影响十二指肠及回肠MUC1与MUC2表达,日粮添加33%的NDF有助于塑造较好的肠道内环境。     

拟南芥CYCD3;1基因植物表达载体的构建 及在烟草中的遗传转化分析

为了分析植物D型细胞周期蛋白在细胞周期中的作用,采用PCR方法从拟南芥花序中克隆出At CYCD3;1基因的全长c DNA序列。该基因的开放读码框为1131 bp,预测编码376个氨基酸,蛋白质的分子量为42701.6 Da,蛋白质的等电点为4.89。构建植物表达载体p ROKII-At CYCD3;1,并利用农杆菌介导的叶盘法将外源基因导入野生型烟草中。通过PCR及q RT-PCR检测显示,At CYCD3;1成功插入烟草基因组并在转录水平表达。表型观察显示转基因株系与野生型株系相比主要表现为花冠宽度变大,花瓣和萼片长度变长,果实变大,茎干弯曲,叶片卷曲,根尖细胞变小。综上,拟南芥At CYCD3;1基因的过量表达影响了植物的生长发育。     

拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位分析

为明确拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位情况,本研究构建了AtPLC2基因融合GFP标签的表达载体35S:PLC2-GFP,并通过农杆菌介导的遗传转化方法,将重组质粒转化本氏烟草叶片,转基因烟草叶片细胞利用激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光信号与细胞质膜重合,表明拟南芥AtPLC2基因定位于细胞质膜上,研究结果为明确拟南芥AtPLC2基因的功能奠定了良好的基础。     

草莓FaSKP1-1基因的克隆与表达分析

为研究草莓中SCF复合体的功能,以栽培草莓品种‘74’为试材,采用同源克隆的方法分离出2个SKP1基因。这2个基因核苷酸序列全长均为519bp,核苷酸序列相似性为98.46%,氨基酸序列相似性为98.84%,并具有特殊的‘GVDED’尾巴结构,分别命名为FaSKP1-1a和FaSKP1-1b(基因登录号分别为KU975057和KU975058)。RT-PCR和dCAPS分析发现FaSKP1-1a和FaSKP1-1b在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达,在花瓣中表达量低。上述结果表明FaSKP1-1可能在草莓SCF复合体的形成过程中发挥重要作用。     

矮牵牛PhPYL4基因的克隆与表达分析

PYR1-LIKE (PYL)作为脱落酸受体,参与植物的多种逆境胁迫。从矮牵牛W115系(Petunia×hybrida‘Mitchell’)中克隆 PYL4的同源基因 PhPYL4。该基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)大小为645 bp,编码214个氨基酸。PhPYL4蛋白分子式为C_(1022)H_(1662)N_(306)O_(316)S_(10)。该蛋白含有一个保守的疏水性配体结合结构域,属于SRPBCC超家族成员。表达分析显示: PhPYL4基因在叶片中表达量最高,根中表达量最低;盐胁迫12 h时, PhPYL4的表达量上调至对照的6倍,24 h后表达量明显下降;体积分数10%PEG处理12 h时, PhPYL4的表达量上调至对照的13倍,24 h后表达量开始下降;ABA处理12 h时, PhPYL4的表达水平上调至对照的29倍,24 h后表达水平显著下降。研究结果揭示: PhPYL4在矮牵牛对盐、干旱及ABA等非生物胁迫的响应中具有重要作用。该研究可为进一步揭示 PhPYL4在矮牵牛抗逆中的调控机制奠定理论基础。     

蜻蜓凤梨 AfERF113基因的克隆与表达特性

观赏凤梨是一类重要的热带花卉,但有关其生长发育调控分子机理的研究相对匮乏,这在一定程度上限制了新品种的开发和利用。以热带观赏花卉蜻蜓凤梨(Aechemia fasciata)为材料,在分析蜻蜓凤梨转录组数据的基础上,结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein(AP2/EREBP)家族的1个转录因子编码序列,并将其命名为AfERF113。生物信息学分析表明,AfERF113 cDNA全长1 093bp,有1个864bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码287个氨基酸。蛋白质理化性质分析表明,该蛋白分子质量为29.768 5ku,理论等电点为6.06,为一类不稳定的酸性亲水蛋白。亚细胞定位软件预测表明该蛋白定位于细胞核。结构域分析表明,该蛋白有1个保守的AP2结构域,分属ERF亚族的B-4类,与拟南芥中所有ERF蛋白的ERF113亲源关系最近。实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)结果表明,AfERF113转录本在成熟株的根中表达量最高,且外源乙烯诱导后,AfERF113的表达量无论是在幼株还是在成株的各组织中均显著上调。研究结果证实,AfERF113响应了外源乙烯调控,为进一步研究AfERF113基因的功能及通过基因工程手段调控凤梨科植物生长发育提供了理论依据。     

红花CtMYB-TF1基因的克隆与表达分析

为了探索R2R3-MYB转录因子与植物类黄酮的次生代谢调控之关系,及对植物花青素合成代谢的作用,以红花花瓣为试验材料,采用RT-PCR结合RACE技术,从红花(Carthamus tinctorius)中克隆获得1个全长1 260 bp的调控花青素代谢的 CtMYB-TF1基因。结果表明,该基因序列可编码249个氨基酸,其蛋白质分子质量为28.08 ku;红花CtMYB-TF1蛋白分子式为C_(1220)H_(1930)N_(358)O_(378)S_(13),是一种不稳定的碱性亲水蛋白;由系统进化树分析可知,红花 CtMYB-TF1与葡萄 VvMYBPA1亲缘关系较近;通过RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,红花 CtMYB-TF1基因在花期的各个时期相对表达量均高于红花CtANS基因,并且随着花期的延长红花 CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相对表达量也有增高,其中在花期的第5天红花 CtMYB-TF1基因的相对表达量出现峰值,说明 CtMYB-TF1基因对CtANS基因具明显的上调作用,可为构建高产、稳定的红花基因工程改良细胞株提供参考。     

紫花苜蓿MsUGT73B2基因的克隆及表达

糖基化是植物体蛋白、激素等物质的常见修饰方式,对维持植物正常生长发育具有重要作用,在植物中糖基化反应由糖基转移酶催化。利用蒺藜苜蓿参考序列通过RACE法克隆得到紫花苜蓿基因MsUGT73B2的全长序列,利用生物信息学方法分析其氨基酸序列、二级结构、理化性质等,RT-qPCR分析基因表达情况,构建基因表达载体,研究亚细胞定位。结果表明,MsUGT73B2基因全长1 512bp,编码503个氨基酸,属于稳定的亲水性蛋白,序列比对结果显示其属于UGT家族基因,亚细胞定位于细胞质中。MSOGT73B2主要在紫花苜蓿叶片中表达,且干旱、10μmol/L ABA处理下在2h之前升高,之后下降;在150mmol/L NaCl胁迫处理下表现为4h之前表达水平升高,之后下降的趋势。     

拟南芥多聚ADP-核糖聚合酶Ⅱ(PARP2)活性的测定

多聚ADP-核糖聚合酶PARP[poly(ADP-ribose)polymerase]催化的多聚ADP-核糖化反应是一种重要的蛋白质翻译后修饰手段,在DNA修复、染色质结构重塑、基因转录、细胞周期和细胞凋亡等过程中发挥重要作用。目前,动物中的PARP研究较为深入,但植物中进展缓慢。本实验利用PCR技术从拟南芥中得到PARP2基因,利用原核系统表达并纯化出PARP2蛋白,体外测定了PARP2的酶活。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,PARP2能够催化自身多聚ADP-核糖化修饰,这一发现为继续研究植物多聚ADP-核糖化聚合酶及多聚ADP-核糖化修饰开拓了新方向。     

马铃薯 StBI-1 基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Bax inhibitor 1(BI-1）是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为 StBI-1 ;蛋白结构预测分析表明, StBI-1 包含7个跨膜域和Bax inhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析 StBI-1 基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能。结果显示, StBI-1 响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达 StBI-1 可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯 BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。     

茶树己糖激酶基因CsHXK1的克隆与表达分析

己糖激酶(HXK)是植物呼吸和代谢过程中的关键酶之一,不仅催化己糖磷酸化,而且参与植物糖感应和糖信号转导过程,在植物生长发育和逆境响应中发挥重要作用。试验以茶树‘龙井长叶’为材料,克隆获得了茶树己糖激酶基因 CsHXK1的cDNA序列,其包含一个1 488 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸,预测蛋白分子质量为53.63 ku,理论等电点为5.96。蛋白序列分析结果显示,CsHXK1含有2个保守的磷酸化激酶域、1个底物结合域和1个ATP结合域,与拟南芥、苹果等HXK1亲缘关系较近。另外, CsHXK1基因启动子区域包含多种与逆境响应和糖信号转导相关的顺式作用元件,如ABA响应元件(ABRE)、脱水响应元件(MYBCORE)及糖信号转导相关元件(SREATMSD)等。qRT-PCR分析结果显示, CsHXK1基因表达受高温、干旱、低温及盐胁迫的诱导,其可能在茶树响应多种非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

宁夏小麦Glu-A3与Glu-B3位点等位变异组成分析

低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)与小麦品质密切相关。为给宁夏小麦的品质改良提供参考,应用STS分子标记,对宁夏98份小麦品种Glu-A3和Glu-B3位点的等位基因变异类型组成进行检测和分析。结果表明,宁夏98份小麦品种Glu-A3位点存在Glu-A3a(4.0%)、Glu-A3b(2.0%)、Glu-A3c(55.1%)、GluA3d(10.1%)和Glu-A3e(28.5%)5种等位变异;Glu-B3位点存在Glu-B3a(2.0%)、Glu-B3b(8.1%)、Glu-B3c(5.0%)、Glu-B3d(7.1%)、Glu-B3f(21.4%)、Glu-B3g(2.0%)、Glu-B3h(15.3%)和Glu-B3i(13.3%)8种等位变异。宁夏参试品种共存在23种等位变异组合形式,其中引黄灌区存在18种组合类型,Glu-A3c/Glu-B3j(17.7%)和Glu-A3e/Glu-B3f(16.2%)组合类型较为普遍;宁南山区存在13种组合类型,以Glu-A3c/Glu-B3i(20.0%)组合类型为主。在参试的宁夏小麦品种中,对同一地区不同来源品种而言,改良品种的LMW-GS遗传多样性明显较引进品种和地方品种更丰富。