猪嗜血支原体ORF9的全基因合成及原核表达

为原核表达猪嗜血支原体(M.haemosuis) ORF9蛋白,本研究根据GenBank登录的AJ504999的ORF9基因序列,采用重叠延伸PCR技术(SOE-PCR),选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成4对寡核苷酸片段,人工合成ORF9基因.将其克隆于表达载体pET-32a中构建重组表达质粒pET-ORF9,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE和western blot鉴定表明,重组蛋白的分子量约为34 ku.     

鹅副粘病毒NP基因的原核表达及表达产物抗原性检测

根据GenBank中发表的GPMVSF02株的NP基因的核苷酸序列设计合成一对引物，通过RT-PCR扩增JS／1／97／Go株的NP基因，将其克隆人pMDl8-T载体，序列测定和分析表明：所扩增的NP基因的核苷酸长为1470bp，共编码490个氨基酸。再将NP基因定向亚克隆至原核表达载体pGEX-6P的多克隆位点，经酶切鉴定后将含有NP基因的阳性亚克隆重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，用诱导荆IPTG分别以不同的浓度进行诱导，并在不同的诱导时间进行采样，样品经处理后通过SDS-PAGE、Westernblot和Dot-ELISA进行分析。结果显示：以终浓度为1mmol／LIPTG进行诱导4h表达可达到高峰。表达的融合蛋白大小约为80kD，并具有良好的抗原性。     

水貂阿留申病病毒VP2截短基因的原核表达

为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进行诱导表达,确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和Western blot分析,表明终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h目的蛋白的表达量最高,分子质量约为53ku。SDS-PAGE分析表明,葡萄糖和乙醇抑制了目的蛋白的表达,而蔗糖、甘油和二甲基亚砜提高了目的蛋白的表达量,获得的目的蛋白具有良好的反应原性。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

藏猪obese基因编码序列合成及obese基因的原核表达

基于对人类肥胖病的研究,推测肥胖基因可能是影响家畜脂肪沉积的一个重要候选基因。研究以藏猪为实验材料,利用重叠延伸PCR方法合成藏猪肥胖基因的CDS序列,并通过构建原核表达系统实现其高效表达。结果表明:用重叠延伸PCR方法获得504 bp肥胖基因CDS全长序列;SDS-PAGE检测显示,在0.075 mmol/LIPTG诱导5 h时,瘦素蛋白Leptin表达最为高效。藏猪肥胖基因的高效表达研究,对提高我国地方猪种瘦肉率具有重要的实践意义。     

鹅FSH基因原核表达

促卵泡激素（follicle stimulating hormone,FSH）作为调节家禽卵泡发育重要的候选基因,但FSH在生物体内的半衰期非常短,本试验将具有延长基因半衰期作用的CTP序列添加到鹅FSH基因各亚基的C末端进行基因融合,以期获得pET32a-FSHα-CTP、pET32a-FSHβ-CTP和pET32a-FSHβ-CTP-α重组蛋白。设计去除目的基因信号肽和含有酶切位点的特异性引物,经融合PCR扩增获得了目的基因FSHα-CTP、FSHβ-CTP和FSHβ-CTP-α,通过构建原核表达载体pET32a-FSHα-CTP、pET32a-FSHβ-CTP和pET32a-FSHβ-CTP-α,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,蛋白纯化。结果显示,3个融合蛋白FSHα-CTP、FSHβ-CTP和FSHβ-CTP-α的IPTG最佳诱导时间分别为4、5和5h,最佳诱导浓度分别为0.2、0.8和1.5mmol/L,且都是以包涵体形式存在,相对分子质量分别为32 000、35 000和46 000,与预期大小一致。结果表明,本试验成功构建了鹅pET-32a-FSHα-CTP、pET-32a-FSHβ-CTP和pET-32a-FSHβ-CTP-α的原核表达载体,并对它们的重组蛋白进行了纯化,为开展鹅FSH的基因免疫研究和鹅rFSH生物制剂研发奠定基础。     

传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP3基因的克隆与原核表达

利用PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP3基因，将其克隆到表达载体pPRO^EX-HTa中，获得重组质粒命名为VP3／PA，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，插入的位置、大小和读码框均正确。SDS—PAGE检测表明，经重组质粒VP3／PA转化、诱导的受体菌E．coli DH5 α能表达结构蛋白VP3基因，约33 Ku，表达量达到了茵体总蛋白的33．9％，经Western blot等检测表明，诱导表达的抗原蛋白能与vvIBDV阳性血清发生特异性反应。这为IBDV血清学诊断方法的建立打下了基础。     

流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增，得到了1条完整的基因，大小为642bp；测序分析证明，它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析，表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中，用IPTG进行诱导。结果证实，该基因可以在大肠杆菌中表达，表达产物为分子质量约50ku的融合蛋白，与理论推测的蛋白分子质量一致；Western—blotting试验证明，表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。     

猪肌生成抑制素C末端80氨基酸编码基因的合成及其原核表达

将猪肌生成抑制素编码序列下游883-l126bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，将优化后序列双链分成l2个单链片段(F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F7、R3、R2、R1)，采用化学合成方法合成，每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。F1长38bp，Rl长36bp，其他片段均40bp长，Fl和R1片段两端分别加上限制性内切酶NcoI和XhoI的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段，该片段与pMDl8—T载体连接，转化JMl09感受态细胞，所得阳性克隆进行测序分析，得到的克隆序列与设计的序列完全一致，表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。从阳性细菌中提取质粒，经NcoI和XhoI酶切，回收254bp目的片段，定向克隆到pET28a中，转化DH5α受体菌，提取质粒，再转化到BL2l(DE3)中，成功筛选出阳性克隆。阳性菌经IPTG诱导，通过SDS—PAGE，检测出猪肌生成抑制素的表达。     

汉坦病毒L基因的分段克隆及原核表达

为原核表达汉坦病毒(HV)L蛋白,本研究根据HV 76-118株全长L基因序列分段设计合成了6对引物.通过RT-PCR方法分段扩增L基因的6个片段,分别克隆于原核表达载体pET-30a中,并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达.SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子量一致的特异的目的蛋白.Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应.     

绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ,并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3,以ＢａｍＨⅠ鉴定方向,以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ,经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆,荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ,并成功转染ＭＤＣＫ,在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。     

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamH I和Xho I位点粘性末端的双链DNA.真核表达载体pcDNA3.1(+)经Bam H I和Xho I限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序.测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础.     

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamH I和Xho I位点粘性末端的双链DNA。真核表达载体pcDNA3.1（+）经BamH I 和Xho I限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序。测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础。     

血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

为构建血红素氧合酶-2（HO-2）真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。试验利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将此序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,重组载体经EcoRI和BamHI双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染小鼠脑血管内皮细胞,48h后,实时定量PCR、Western blot检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果表明,pEF1α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达量较空载体转染极显著增高（P〈0.01）,在蛋白水平表达量较空载体转染显著增高（P〈0.05）。表明HO-2基因的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP构建成功,为进一步研究其机制和功能奠定了基础。     

鸡降钙素基因克隆及其真核表达质粒的构建

采集200日龄新扬州产蛋鸡腮后腺组织,直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物进行克隆、测序,获得新扬州鸡降钙素(CT)基因序列。测序表明,CT基因核苷酸长度为417bp,编码139个氨基酸。与GenBank上发表序列相比较,核苷酸同源性为99.8%,在第135位处存在G→C的有义突变。与从GenBank下载读取的红点鲑、大马哈鱼、河豚、斑马鱼、人、家鼠、绵羊、犬8个物种序列进行比较分析,核苷酸同源性分别为74.0%、63.3%、59.5%、55.6%、52.8%、50.6%、48%及42.2%。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-CT,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段且连接、构建正确,为利用pCEP4-CT调控机体骨钙代谢、防治蛋鸡骨质疏松症的研究和应用奠定了基础。     

巴什拜羊SPLUNC1基因的克隆与真核表达

为了克隆巴什拜羊SPLUNC1基因并表达该蛋白,本试验从巴什拜羊肺脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增出SPLUNC1基因开放阅读框序列,将该基因片段插入到真核表达质粒pPIC9K中构建pPIC9K-SPLUNC1重组质粒,然后将pPIC9K-SPLUNC1重组质粒线性化并电击转化入毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导蛋白表达后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定目的蛋白。结果表明,经RT-PCR扩增成功获得大小为748 bp的SPLUNC1基因;构建的pPIC9K-SPLUNC1重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE及Western blotting检测鉴定结果表明获得大小为25.53 ku的SPLUNC1蛋白。本试验结果为进一步研究巴什拜羊SPLUNC1蛋白的生物学活性奠定基础。     

人溶菌酶基因的克隆及其真核表达载体的构建

通过设计人溶菌酶(hLYZ)特异性引物,Trizol试剂盒从人体胎盘组织中提取总RNA,RT-PCR法从总RNA中扩增出目的基因hLYZ,将其与PGEM-T-easy载体连接,转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,经酶切法连接到真核表达载体,构建重组的质粒表达载体pEGFP-N3-hLYZ,获得了hLYZ全长cDNA并构建出hLYZ真核表达载体.测序表明克隆的hLYZ全长cDNA与GenBank中hLYZ序列完全一致.研究结果为进一步研究制作hLYZ的抗菌作用机制奠定了基础.     

猪Mx1基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达

为获得转Mx1基因的阳性陆川猪成纤维细胞,本研究以干扰素诱导猪成纤维细胞Mx1基因表达,提取细胞总RNA,RT-PCR获得编码猪Mx1蛋白的cDNA;以pMSCV-IRES-GFP为骨架构建猪Mx1基因表达载体pMSCV-IRES-GFP-Mx1,并利用脂质体2000介导重组质粒转染陆川猪胎儿成纤维细胞,通过荧光观察和PCR检测分析结果表明Mx1蛋白基因整合进入陆川猪胎儿成纤维细胞。     

水牛PTHLH基因克隆分析及其真核表达载体构建

为揭示甲状旁腺激素样激素（parathyroid hormone-like hormone,PTHLH）基因对水牛繁殖性能的影响,本研究对水牛PTHLH基因进行克隆,并对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析。以牛PTHLH基因为种子序列（GenBank登录号：NM_001290949）,应用CE Design软件设计引物序列,运用PCR扩增和测序技术获得水牛完整编码区序列,使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA、PSORTⅡ Prediction等在线软件分析PTHLH蛋白的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性比对分析及系统进化树构建。结果显示,试验克隆了水牛PTHLH基因完整编码区序列,该序列长为534 bp,可编码177个氨基酸。水牛PTHLH基因编码区核苷酸序列与黄牛、猪、马、山羊、绵羊和骆驼的同源性分别为98.3%、90.4%、90.1%、98.1%、97.5%和89.2%,物种之间同源性较高,系统进化树分析结果与其亲缘关系远近一致,表明水牛PTHLH基因编码区在进化过程中比较保守。蛋白理化性质分析显示,水牛PTHLH蛋白分子式为C₈₉₅H₁₄₅₁N₂₇₁O₂₆₆S₂,分子质量为2 885 u,半衰期为30 h,理论等电点（pI）为10.00,水溶液在280 nm处的消光系数为23 950,肽链N端为蛋氨酸（Met）,不稳定系数为60.04,属于碱性不稳定蛋白;脂肪系数为72.15,总平均亲水性为－0.928,该蛋白属于不可溶性蛋白,亚细胞定位于细胞核、细胞质和线粒体。结构域预测结果显示,水牛PTHLH蛋白包含有1个PTH区域,同时还包含有1个低复杂度区域。二级结构分析显示,水牛PTHLH蛋白包含83个α-螺旋（46.89%）、17个延伸链（9.60%）、10个β-转角（5.66%）和67个无规则卷曲（37.85%）,与三级结构预测结果相一致。试验构建了PTHLH基因真核表达载体pcDNA3.1-PTHLH,并通过电泳和测序验证了载体的准确性。PTHLH基因的成功克隆及其真核表达载体的成功构建为今后研究水牛PTHLH基因的功能和遗传特性提供了材料。     

猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17 ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。