检测非洲猪瘟McAb—ELISA竞争试剂盒的建立及初步应用

用基因重组技术制备的非洲猪瘟蛋白P54免疫BALB/C小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用有限稀释法进行克隆,获得能稳定分泌抗ASFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用该单克隆抗体,建立了检测血清中非洲猪瘟抗体的竞争法ELISA。实验结果表明:ELISA竞争法特异性高,无交叉反应,灵敏度高于间接免疫荧光法,可用于猪血清的非洲猪瘟抗体检测。该法的建立对非洲猪瘟实验诊断的标准以及流行病学调查具有重要的现实意义。     

基于非洲猪瘟病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法

为了建立一种能够检测非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性抗体的单抗阻断ELISA方法，本试验首先构建了非洲猪瘟病毒p30蛋白的原核表达载体，进而制备并筛选出1株能特异性识别p30蛋白的高亲和力单克隆抗体，采用昆虫杆状病毒表达系统Bac-to-Bac进行该单克隆抗体的表达。以p30重组蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体作为阻断抗体建立了一种非洲猪瘟病毒特异性抗体的检测方法，并验证其敏感性、特异性以及与商品化试剂盒的符合率。结果显示，该方法敏感性为100%,特异性为100%,与商品化试剂盒比较，符合率为98.7%。结果表明，本试验基于非洲猪瘟病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法敏感性好、特异性强，结果准确可靠，可用于非洲猪瘟病毒抗体检测。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。     

猪瘟病毒单克隆抗体的研制和应用——Ⅱ.应用抗猪瘟兔化弱毒单克隆抗体 ELISA 竞争法检测猪瘟病毒抗体

利用过氧化酶标记的抗 SFV-CMcAb 建立的 ELISA竞争法对5份未吃初乳仔猪血清和79份注射疫苗前后不同时期的猪血清进行检测.结果表明,该法具有特异、敏感、快速、简便等特点.哺乳仔猪注射疫苗前血清中母源抗体在 McAb ELISA 竞争法测定中的抑制率为55.8%.而注射疫苗15天后血清抑制率均为65.0%以上,这与HRP-SPA-ELISA 检测结果呈显著正相关(r=0.9890P<0.01).以此方法检测猪瘟病毒抗体可正确反映疫苗注射后产生的抗体应答和猪群的免疫水平.     

非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的真核表达及单克隆抗体制备

为制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CP312R蛋白的单克隆抗体,以真核表达ASFV的CP312R蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并通过间接免疫荧光法(IFA)对获得的单克隆抗体进行反应性鉴定。结果利用杆状病毒表达系统(baculovirus expression system, BES)构建获得重组转移载体pOET3-CP312R,与杆状病毒基因组flashBAC^TM ULTRA共转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒AcMNPV-CP312R,且该病毒以胞内可溶形式表达出重组ASFV CP312R蛋白质。通过蛋白质印迹法鉴定显示重组CP312R蛋白可以与ASFV阳性血清发生特异性反应。此外,筛选获得2株针对重组CP312R蛋白的单克隆抗体(McAb),间接ELISA方法鉴定抗体滴度不低于1∶1 024 000。IFA试验检测表明,单克隆抗体与非洲猪瘟抗原发生特异性反应。本研究为非洲猪瘟亚单位疫苗研发及血清学检测方法的建立提供物质储备。     

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体的筛选及免疫学特性鉴定

为制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体,并探究其免疫学特性,以真核表达的CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次免疫后采集小鼠血清,以间接ELISA检测小鼠多抗血清效价。对血清效价最高的小鼠进行加强免疫后,取脾脏进行细胞融合。通过有限稀释法筛选能够稳定分泌CD2v单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法和辛酸-硫酸铵法获得纯化的CD2v单克隆抗体,对其进行免疫学特性检测。间接ELISA试验显示,4号小鼠血清效价最高(1:72 900),选取该小鼠脾脏进行细胞融合,经过筛选得到4株杂交瘤细胞,分别命名为21D10、21G8、36A3和38G8,亚型鉴定均为IgG₁/κ,经检测36A3 ELISA效价最高,可达1:2.187×10⁵。免疫荧光试验显示,36A3抗体能与细胞内表达的CD2v蛋白发生特异性反应,而与携带His标签的p30蛋白无交叉反应;特异性鉴定结果显示,36A3抗体特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒p72蛋白均无反应;亲和力检测显示,36A3抗体亲和力较高,亲和...     

猪瘟野毒感染抗体阻断ELISA检测方法的建立与初步评价

以猪瘟野毒E2蛋白为包被抗原、辣根过氧化物酶标记的猪瘟野毒单抗作为酶标抗体,建立检测猪瘟野毒抗体的阻断ELISA方法。猪瘟野毒E2最适包被浓度为0.03μg/mL,待检血清最适稀释度为1∶4,酶标猪瘟野毒单抗稀释度为1∶1 000。用建立的阻断ELISA方法检测369份临床阴性血清,计算阻断率,确定临界值,阻断率>40%为猪瘟野毒抗体阳性,阻断率≤40%为猪瘟野毒抗体阴性。用建立的ELISA方法检测84份血清,其中78份为免疫猪瘟疫苗的血清,6份为猪瘟病毒感染血清。结果显示,78份免疫血清均检测为猪瘟野毒抗体阴性,6份猪瘟感染血清均检测为猪瘟野毒抗体阳性。因此可初步判定该方法可用于鉴别诊断猪瘟病毒自然感染动物和C株疫苗免疫动物的血清抗体,并为临床检测猪瘟野毒抗体提供便捷、快速,精准的检测工具,对猪瘟的临床诊断、预防以及猪瘟净化工作具有非常重要的参考意义。     

应用ELISA方法检测非洲猪瘟抗体

为了验证ELISA方法检测非洲猪瘟抗体的可行性,在东莞市3个屠宰场采集92份猪血清,应用ELISA方法进行检测,结果为阴性和阳性质控均成立,非洲猪瘟抗体均为阴性。结果表明,ELISA方法操作简便,适合大规模样品非洲猪瘟抗体的监测。     

非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立

以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。     

猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为了建立一种经济可靠的猪瘟病毒(CSFV)抗体检测方法,本研究利用杆状病毒表达系统表达可溶性CSFV E2蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备了45株可稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。经CSFV阳性血清阻断试验筛选出4株具有阻断活性的McAb,并经抗原表位鉴定确定单抗15A9识别的是可用于鉴别CSFV和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的线性表位TAVSPTTLR。利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的15A9建立了CSFV阻断ELISA抗体检测方法,用此方法检测猪瘟疫苗免疫的猪血清,免疫后2周即可检测到抗体,且该方法检测BVDV阳性血清为阴性。本研究建立的CSFV阻断ELISA抗体检测方法为CSFV的疫苗免疫效果评估及其与BVDV的抗体鉴别提供了一种有效、便捷的方法。     

非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具...     

A sensitive dot immunobinding assay for serodiagnosis of African swine fever virus with application in field conditions.

The present work describes a simple dot immunobinding assay (DIA) for African swine fever virus (ASFV) antibody detection that can be used under field conditions. The assay uses nitrocellulose strips dotted with a cytoplasmic soluble antigen (CS-P) of ASFV. The nitrocellulose strips are adhered to a plastic handle. The test serum samples react with the CS-P, and antibodies are detected using a protein A-peroxidase conjugate. Both incubations are carried out at 20 C. The efficacy of the DIA as a screening test for ASFV was compared to an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and an immunoblotting (IB) test using 343 sera collected from natural African swine fever epizootics and from inapparent ASFV carriers. The DIA had comparable sensitivity to both reference techniques, and all samples positive in the ELISA and IB test were also positive in the DIA. False-positive reactions were not detected when whole blood or poorly preserved serum samples were tested by DIA. Some poorly preserved sera that were positive initially by the ELISA were no longer ELISA positive in a later run, although they were positive in IB and DIA. These positive DIA and IB test results could be caused by the differences in antibody epitope binding.     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法.采用原核表达的ASFVp54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价.结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0 μg·mL-1,抗原包被温...     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

非洲猪瘟血清学诊断靶点的研究进展

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的猪高致死性传染病。ASFV编码蛋白p30、p54和p72等具有较高的免疫原性,且部分氨基酸序列较为保守,常被作为血清学诊断靶点,用于评价ASF不同阶段或发病程度的抗体水平变化,ASF血清学诊断靶点相关深入研究有助于其感染检测、致病机制和机体免疫系统反应等探究。本文系统阐述用于ASF血清学诊断的主要候选蛋白及其靶点的检测应用进展,并分析候选靶点的抗原表位（区域）及其抗体结合的特点,探讨其作为ASF血清学诊断新靶点的应用潜力。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准：当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。     

基于非洲猪瘟病毒p30与p54蛋白表位串联多肽的间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明¹⁴⁶PAEPYTT¹⁵²为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2 μg·mL^-1),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05% PBST溶液稀释5 000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1 600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。     

非洲猪瘟病毒360-12L蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

[目的] 获得抗原性好的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。[方法] 根据GenBank ASFV参考序列（登录号：NC_044959.2）合成360-12L基因,并插入pET-28a（+）载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将经测序鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导培养,筛选最佳诱导温度,同时分析其可溶性。随后通过亲和层析纯化蛋白,并对所获得的12L重组蛋白进行SDS-PAGE分析。将获得的12L重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以获得鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定所制备的多克隆抗体效价,并用间接免疫荧光试验进行验证。[结果] 成功构建了ASFV 12L蛋白原核表达质粒,重组菌pET-28a-12L-BL21在37 ℃ 6 h时表达量较高,主要以包涵体形式表达,可在54.7 ku处出现明显条带。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体效价>1：512 000,间接免疫荧光试验结果表明,所制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体具有良好的特异性,可特异性识别12L重组蛋白。[结论] 原核表达的12L重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,为进一步研究12L蛋白的生物学功能、ASFV血清学诊断技术和疫苗研究提供生物材料。