金刚砂辅助农杆菌进行玉米基因转化研究

对超声波处理方式进行改进,在超声波处理时,加入金刚砂以辅助EPSPS基因转导到玉米幼胚中。结果表明,800粒处理种子播种出苗93株,玉米苗经大田glyphosate筛选有27株具有抗性,进行PCR电泳检测,显示23株阳性,初步证明EPSPS基因已经转化到玉米植株中,转化率为29%。金刚砂辅助处理玉米基因转化具有可行性,利于生产实际操作。     

转精氨酸酶基因ZmARG玉米后代株系的遗传稳定性分析和功能验证

以T4、T5代转ZmARG基因玉米株系AKF65和受体自交系KF513为试材,对目标基因的整合表达、酶活性及产量相关农艺性状进行检测。结果表明,PCR、Southern和RT-PCR检测证明,ZmARG基因以单拷贝的形式插入基因组,在转录水平上能够稳定表达,且两个世代中稳定遗传。转基因株系灌浆期叶片中的精氨酸酶活力显著高于对照,萌发种子和苗期根中极显著高于对照,种子萌发时酶活力最高。转基因株系百粒重、穗重和小区产量显著高于对照,穗长极显著高于对照,其他各产量相关农艺性状差异不显著。     

抑制ZmCol3基因表达调控玉米开花期

采用ZmCol3基因RNAi载体构建、农杆菌介导玉米遗传转化、转基因材料开花期表型鉴定等研究方法,评估抑制ZmCol3基因表达对玉米开花期的影响。转基因玉米基因组PCR结果证实,人工合成RNAi片段已成功整合到玉米基因组中。qRT-PCR结果表明,在不同转基因玉米株系中ZmCol3基因表达受到不同程度的抑制。温室转基因玉米开花期相关性状调查结果表明,抑制ZmCol3表达,可以将玉米抽雄、散粉和吐丝时间提前2~3 d。研究结果证实,ZmCol3具有调控开花期的生物学功能,抑制该基因表达进而缩短玉米开花期可以作为行之有效的方法应用到玉米熟期改良研究中。     

耐盐碱基因eIF1A对玉米遗传转化研究

以来自柽柳的耐盐碱基因eIF1A为研究对象,构建其单子叶植物表达载体,并利用农杆菌介导法转化极早熟玉米自交系加2和M1的胚性愈伤组织,创制转eIF1A基因玉米新材料,为耐盐碱转基因玉米育种提供技术和材料支持。结果表明,成功构建eIF1A基因的单子叶植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-eIF1A,共获得33株除草剂抗性植株,其中,12株目的基因和筛选标记基因PCR呈阳性反应,RT-PCR检测表明,目的基因正常转录表达。     

高粱EPSPS基因的克隆、修饰及在玉米中的功能验证

针对草甘膦结合位点,对高粱5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因进行4种定点修饰,将修饰后的基因分别导入到玉米中。通过对转化体的抗性鉴定,确定将高粱EPSPS基因106位的脯氨酸变为丝氨酸（P106S）能够赋予转基因玉米草甘膦抗性。在喷施4倍的草甘膦时抗性事件CL38-1不产生药害。Southern杂交结果表明,目标基因在该转化事件中稳定遗传,转化其余3种EPSPS基因的植株对草甘膦没有足够的抗性。     

转小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥植株的主要抗旱性研究

核氧还蛋白（nucleoredoxin,NRX）可通过还原目标蛋白的二硫键来调控其生物活性,在植物的生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）、h型硫氧还蛋白（h-type thioredoxin,TRXh）和蛋白磷酸酶2A催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac）是小麦核氧还蛋白TaNRX1的互作蛋白。为了明确TaNRX1互作蛋白的抗旱性功能,本研究在拟南芥中过表达了小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因,对野生型和转基因拟南芥的表型和抗旱相关生理指标进行了鉴定。结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的根长、存活率、脯氨酸含量均大于野生型,离体叶片失水率、丙二醛（MAD）含量均小于野生型。二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）对H₂O₂组织定位染色结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的H₂O₂含量均低于野生型。上述结果说明,TaNRX1的互作蛋白基因 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D增强了拟南芥对于干旱胁迫的抵抗能力。本研究可为小麦抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

抗虫耐除草剂转基因玉米花粉生活力研究

使用离体培养法检测不同玉米材料花粉萌发率并于显微镜下观察花粉粒直径,研究转Cry1Ab、EPSPS基因玉米对花粉生活力的影响。结果表明,刚离体花粉萌发活力最强,培养180 min后花粉萌发率可达89.4%,高温(36℃)条件下放置2 h花粉基本丧失萌发能力。与非转基因对照相比,转Cry1Ab、EPSPS基因玉米对花粉离体后的生存能力无显著影响,对花粉粒直径大小无影响。     

玉米COBRA基因家族分析及重要成员ZmCOBL03基因编辑

利用生物信息学的方法分析玉米COBRA家族10个成员的序列特征、与其他物种的进化关系和组织特异性表达模式。结果表明,10个COBRA家族基因都含有CCVS保守结构域,并且均定位于细胞膜上。系统进化分析结果显示,该家族可以分为2个亚族,每个亚族内的基因具有相似的基因结构和理化性质。以ZmCOBL03为候选基因开展基因编辑,采用双靶标位点的设计思路,利用农杆菌介导的玉米遗传转化技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功获得ZmCOBL03基因靶向突变的玉米株系。表型分析证实,ZmCOBL03基因突变后严重影响了玉米的正常发育,表现为植株极端矮化且生殖生长受到抑制,证实ZmCOBL03基因在植物细胞壁纤维素合成中发挥重要作用。     

玉米Opaque-2基因在毕赤酵母中的表达

从玉米自交系辽2345授粉后18 d的胚乳中提取总RNA,经反转录后得到第一链cDNA,利用Opaque-2基因的特异引物克隆出该基因的全编码区,将该编码区的全序列以正确的阅读框架利用Infusion同源重组的方法亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9的α因子下游,并置于AOXⅠ启动子控制下,利用pPIC9表达载体上的特异引物进行PCR鉴定,鉴定后的重组质粒用Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化导入甲醇型毕赤酵母菌株GS₁15中,利用MM、MD和菌落PCR的方法筛选出Mut⁺表型,得到的重组子以甲醇诱导表达蛋白。经SDS-PAGE结果显示,Opaque-2蛋白得到表达,其相对分子质量（Mr）约为47 KD。     

转精氨酸酶基因ZmARG玉米株系AKF65的杂交组合鉴定及遗传稳定性分析

以转玉米精氨酸酶基因ZmARG的T_4代株系AKF65为试材,配置杂交组合,对组合进行农艺性状调查和产量性状鉴定,并将F_1进行回交,采用PCR分子检测手段分析ZmARG基因的遗传特性。结果表明,杂交组合合344×AKF65和WY-1-2×AKF65在株高、穗位高等性状上,与非转基因对照组合相比差异均不显著,在产量、单穗重、穗长等性状上显著高于对照组合,百粒重、粒宽和粒厚等性状上显著高于常规对照品种克玉15。BC1F1回交世代中ZmARG基因分离比例均接近1∶1,表明外源ZmARG基因为显性并稳定插入到基因组中。     

农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系的研究

以携带pCAMBIA1301(含GUS基因)质粒的EHA105菌株侵染玉米优良自交系齐319的幼胚,培养3 d后,借助GUS基因的瞬时表达率,对影响农杆菌介导玉米幼胚转化的部分因素进行优化。结果表明,农杆菌侵染液最佳浓度OD600为0.4～0.6,最适合用于转化的幼胚大小为直径1.5 mm,最佳侵染时间为20 min,GUS瞬时表达率为23.46%。     

玉米TCP家族基因的表达分析

植物所特有的TCP(Teosinte branched1/Cincinnata/Proliferating cell factor)转录因子在器官三维形态发育过程中发挥重要作用。对玉米、水稻、高粱、拟南芥和杨树中的131个TCP基因进行系统进化树构建,可分为5个分支,Class I包含两个分支A和B,Class II包含3个分支C、D和E,每个分支中都含有来自单子叶和双子叶植物中的TCP基因,说明TCP家族基因的扩增事件要早于植物单双子叶的分化。利用Genevestigator网站中的转录组数据库信息对玉米TCP家族基因在不同组织器官和不同发育时期的表达模式进行分析,结果表明,大部分TCP基因在不同组织器官和不同发育时期均有表达,尤其是在叶片发育和生殖器官发育过程。此外,TCP基因启动子区顺式作用元件的分析结果显示,植物激素响应类顺式作用元件最多,还有部分TCP基因含有生长发育和逆境胁迫相关的顺式作用元件。     

白桦花发育基因BpMADS3对玉米的遗传转化及功能验证

MADS-box基因编码多种具有重要生物学功能的转录调节因子,能够激活或抑制其他基因的转录,在调节植物根、叶、花和果实的发育尤其在开花植物花的发育过程中起到重要的调控作用。将东北白桦树中克隆得到的BpMADS3基因导入玉米中,验证其在玉米中的功能。结果表明,利用In-Fushion技术成功构建了BpMADS3基因的单子叶植物表达载体pTF101.1-T-nos-Ubi-BpMADS3,采用花粉管通道法将该基因导入玉米自交系合344中,获得5个T2代PCR和RT-PCR阳性株系,转基因株系H1-25和H1-76的散粉期和抽丝期均比对照提前,穗重、穗长、穗粗和百粒重等产量相关性状显著或极显著高于对照。研究结果初步证明,BpMADS3基因的导入对玉米花期提前和产量增加有一定的功效。     

玉米YUCCA家族基因的表达分析

YUCCA基因编码生长素合成相关酶,在植物的生长发育过程中发挥重要作用。利用Genevestigator软件分析获得玉米YUCCA(ZmYUC)基因的转录表达谱,结果显示,ZmYUC1、ZmYUC2、ZmYUC4、Zm YUC5、ZmYUC10和ZmYUC12等多个ZmYUC基因在特定组织中高水平表达,ZmYUC7和ZmSPI1等基因在所检测的组织中几乎均有表达,暗示ZmYUC基因在玉米不同生长发育过程均发挥重要作用。通过PlantCare软件分析ZmYUC基因启动子区的顺式作用元件,获得其在逆境胁迫方面的顺式作用元件,利用实时定量PCR方法对ZmYUC基因在冷(4℃)、热(40℃)、盐(250 mmol/L的NaCl)和干旱(15%的PEG6000)处理下的表达量变化进行检测,结果显示,ZmYUC5和ZmYUC8在冷胁迫处理下表达量显著增加,可能参与了植物的冷驯化;热胁迫处理后,大多数ZmYUC基因的表达模式发生了明显变化,其中,ZmYUC8对热信号反应迅速,可能在抵抗热胁迫中发挥关键作用,ZmYUC11热胁迫处理后其表达下调。多数ZmYUC基因在干旱胁迫处理后表达模式未见明显变化;...     

玉米穗粒腐病差异表达基因的生物信息学分析

结合基因功能分类体系(Gene Ontology,GO)对筛选得到的玉米穗粒腐病差异表达基因片段进行全面生物学功能注释。以抗玉米穗粒腐病的自交系Bt-1为材料,接种串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme),对接菌后96 h的玉米苞叶样品以玉米全基因组基因芯片进行大规模筛选,利用分子注释系统(Molecular Annotation System,MAS)对筛选得到的基因片段进行GO分子功能注释,分析特征基因的功能。结果表明,利用基因芯片从抗性材料Bt-1中获得的482条差异代表序列,GO注释获得大量重要信息,对应的基因注释包括分子功能、生物过程和细胞组分3个层次。GO能够准确预测与玉米穗粒腐病相关抗病基因的功能,对于了解表达基因之间的相互关系和深入挖掘、理解高通量数据等方面的具有重大帮助,是研究抗病基因不可或缺的生物学信息手段。     

Fusarium proliferatum侵染玉米花丝的解剖学研究

层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)分生孢子喷洒在玉米花丝上,可侵入玉米柱头的茸毛细胞、表皮细胞以及花丝的表皮细胞,菌丝沿花丝的薄壁组织细胞、维管束细胞向子房方向生长。F.proliferatum侵染花丝后,导致花丝薄壁细胞、表皮细胞皱缩,花丝萎缩变形。结果显示,F.proliferatum可直接侵染玉米花丝,借助花丝通道侵入玉米雌穗,花丝通道是F.proliferatum侵染玉米雌穗的途径之一。     

利用农杆菌介导合子胚转化法将Bar基因转入玉米自交系的研究

基于农杆菌介导的合子胚转化方法是一种具有自主知识产权的转基因新方法。利用该方法转化玉米合子胚,可直接获得转化种子。以东北春玉米区玉米自交系8902、Pa91、丹340作为转化受体,通过合子转化法进行抗草丁膦除草剂基因Bar的转基因研究。在获得的3 560份材料中,通过对T_1代种子苗叶面喷施草丁膦除草剂Basta,共获得153株抗性植株,抗性频率为4.3%。PCR鉴定阳性植株为102株,转化频率为2.87%。对PCR检测出的阳性植株进行自交获得T_2代,对材料继续进行抗性筛选,对抗除草剂表型的分离比率进行抗性遗传分析。     

玉米胚乳突变体Wrk1基因定位及候选基因预测

Wrkl是在EMS诱导群体中分离得到的玉米胚乳显性突变基因.Wrk1突变体玉米胚乳严重皱缩,导致玉米子粒的千粒重降低30％～50％.研究利用B73为回交亲本构建BC1分离群体,通过9 800个单株把Wrk1基因定位在开发的SSR标记Mssr1824和Mssr2042之间,二者之间的物理距离约1.2 Mb.在此基础上,另外构建一个以M017为回交亲本的BC1群体,通过11280个单株把Wrk1基因定位在开发的SSR标记Mssr1916.2和Mssr1838之间,二者之间的物理距离约185 kb.通过基因预测和注释,发现在该区域内有7个候选基因,为Wrk1基因的最终克隆奠定了基础.