林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子的原核表达

为研究林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子kp05372的功能,采用PCR方法扩增林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子kp05372基因,连接T载体进行克隆,双酶切后连接表达载体pET-32(a),构建重组表达质粒,并转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞,然后对其最佳表达时间、温度、IPTG浓度进行筛选,利用SDS-PAGE与Western Blot鉴定重组蛋白,得到约53.2 ku的融合蛋白,与预期大小一致。本研究成功构建kp05372基因表达载体,并筛选出最佳表达条件,为进一步研究该蛋白结构功能奠定了基础。     

白鲢肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

从患病白鲢鳃、肝胰脏分离到2株细菌,形态特征及生理生化反应完全一致.该菌为革兰氏阴性菌,具荚膜,粗短杆状,大小约（0.3～0.4）×（0.5～0.8）μm,单个存在或2个相连;发酵葡萄糖产酸产气,乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、枸橼酸盐、尿素显阳性;对鸟氨酸、蛋白胨水、卫茅醇、苯丙氨酸、H2S均为阴性;V-P试验强阳性,细菌学鉴定该菌为肺炎克雷伯氏菌.分离菌经胸鳍基注射回归感染试验均出现与自然发病相似的症状.     

蟒蛇肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

亚洲岩蟒主要栖息在热带与亚热带森林,具有较高的药物、营养和经济价值,人工养殖中常因肺炎而死亡.为调查该病病因,对海南省养殖场发病蟒蛇进行心脏穿刺采集血样、细菌培养、革兰氏染色镜检、16S rRNA基因序列测定和BLAST分析等方法寻找病原,结果表明,分离菌株为肺炎克雷伯氏菌.     

白鲢肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

从患病白鲢鳃、肝胰脏分离到2株细菌,形态特征及生理生化反应完全一致.该菌为革兰氏阴性菌,具荚膜,粗短杆状,大小约(0.3～0.4)×(0.5～0.8) μm,单个存在或2个相连;发酵葡萄糖产酸产气,乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、枸橼酸盐、尿素显阳性;对鸟氨酸、蛋白胨水、卫茅醇、苯丙氨酸、H2S均为阴性;V-P试验强阳性,细菌学鉴定该菌为肺炎克雷伯氏菌.分离菌经胸鳍基注射回归感染试验均出现与自然发病相似的症状.     

水貂肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

本研究从临床上水貂肺出血死亡的病例中分离到1株优势菌,通过细菌常规鉴定方法对该菌进行了形态特征、生化特性和16SrRNA测序等试验,并对该菌株进行了耐药分析和人工感染试验。结果显示,该菌是1株肺炎克雷伯氏菌,具有高度的耐药性,并且能致小鼠死亡。由此推断,该菌是致水貂死亡的主要致病菌。     

绵羊肺炎支原体贵州株P113基因的克隆与生物信息学分析

为获得绵羊肺炎支原体贵州株P113基因生物信息学特征,应用DNAStar、Mega 5.0、Protparam、Protscale、IEBD等工具对其(GZ-QX1株)P113蛋白特性、结构和功能进行预测分析。结果显示,绵羊肺炎支原体GZ-QX1株P113基因序列大小为3 240bp,编码1 079个氨基酸,与绵羊肺炎支原体Y98标准株、四川SC01株、猪肺炎支原体P97、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊亚种的核苷酸序列同源性分别为99.9%、81.9%、60.4%、3.9%和5.2%。P113蛋白是分子质量约119ku的碱性蛋白,具有较多优势抗原表位;蛋白结构分析显示,P113蛋白无跨膜结构,有9个N糖基化位点,59个丝氨酸、16个苏氨酸的磷酸化位点,14种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点;蛋白功能分析认为,P113可能是某信号传导通路的信号分子,也是一种具有良好抗原性的结构蛋白。     

鳗肺炎克雷伯菌的分离与鉴定

从6尾患肠道胀气的病鳗腹水和肝脏病灶中分离、筛选出一株致病菌EP4,通过细菌形态学、生理生化测定及ATB Expression半自动细菌鉴定仪鉴定均符合肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)特性.以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到EP4的部分16S rRNA基因序列,长约1 502 bp.将所测序列与GenBank中序列进行BLAST比对并构建系统进化树,结果表明其与肺炎克雷伯氏菌[DQ444287]的同源性最高(98.9%).人工感染证明该菌株具有较强的致病力(致死率达70%),30种药物筛选结果显示,EP4对菌必治(头孢三嗪)、先锋V、头孢克洛、氧氟沙星、氟罗沙星、依诺沙星、萘啶酸等高度敏感,而对苯唑青霉素、氨苄青霉素、青霉素G、阿莫西林等不敏感.     

鸡场饮水中肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及耐药性研究

【目的】研究养殖场鸡饮水中肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）的耐药表型和耐药基因的携带情况,并分析其相关性,为有效预防该病提供参考。【方法】从养殖场鸡饮水系统中分离、鉴定肺炎克雷伯氏菌,采用药敏纸片扩散法检测分离菌株对25种常用抗菌药的耐药性,通过PCR检测菌株携带的常见耐药基因。对其中4株肺炎克雷伯氏菌进行全基因组测序,利用CARD抗性基因数据库预测耐药基因的携带情况。【结果】从养殖场鸡饮水系统中共分离到9株肺炎克雷伯氏菌,药敏试验表明这些菌株呈现出多重耐药,仅对多粘菌素敏感。PCR检测发现,9株肺炎克雷伯氏菌共携带13种常见的耐药基因,其中,β-内酰胺酶类耐药基因CMY-1、BlaSHV和BlaCTX-M,碳青霉烯类耐药基因KPC,喹诺酮类耐药基因QnrB、QnrS和QnrA,氨基糖苷类耐药基因Aph(3’)-Ia,磺胺类耐药基因Sul2等12种耐药基因与其耐药表型表现一致,而Mcr-1基因与其表型相反。全基因组扫描分析结果显示,4株肺炎克雷伯氏菌共携带了59种耐药基因,涉及31类抗生素药物,其中四环素类抗生素的耐药基因最多,其次是大环内酯类抗生素和氟喹诺...     

玉米FAD2基因的生物信息学分析

脂肪酸脱氢酶（Fatty acid desaturase, FAD2）是产生不饱和脂肪酸的关键酶,在植物对多种逆境胁迫的响应中发挥重要作用。研究通过生物信息学方法对C-4作物玉米的FAD2基因及其蛋白的结构和功能作以预测和分析。分析结果表明,ZmFAD2基因含有FA-desaturase结构域,表明ZmFAD2蛋白具有脂肪酸去饱和酶的功能。ZmFAD2是定位于内质网的亲水性蛋白,系统进化树表明其与同为C-4植物的高粱和谷子亲缘关系最近。启动子顺式作用元件以及表达特性分析均表明ZmFAD2参与多种逆境胁迫的响应。研究结果为FAD2基因功能的进一步研究奠定了基础,同时为通过分子育种提高作物在逆境胁迫下的抗性提供了理论依据。     

盘基网柄菌DJ-1基因的克隆及生物信息学分析

目的:盘基网柄菌是研究药物作用机理、细胞信号转导和神经退行性病变的模式生物。对盘基网柄菌DJ-1基因进行克隆和序列分析,可以为研究DJ-1基因在肿瘤抑制和神经退行性病变中的作用机理奠定基础。方法:以盘基网柄菌总基因组为模板,利用Primer5.0设计特异性引物扩增盘基网柄菌DJ-1基因,并将扩增的DJ-1基因插入大肠杆菌原核表达质粒pUC18,进行酶切、连接、E.coliDH5α菌株转化和筛选、DJ-1序列测定以及DJ-1的核苷酸和蛋白质序列分析。结果:盘基网柄菌DJ-1基因全长618 bp,无内含子,共编码205个氨基酸。在系统发育上与梭菌属形成两个分支,本属内D. discoideum和D. purpureum亲缘关系相近。盘基网柄菌DJ-1蛋白质的分子量约为22.87 kD,其等电点为5.31,含86个非极性氨基酸和119个极性氨基酸,无信号肽识别序列和跨膜结构。DJ-1蛋白质二级结构以α-螺旋、无规卷曲和延伸链为主。Pretotar软件预测DJ-1位于盘基网柄菌细胞内质网上。结论:盘基网柄菌DJ-1基因与人类DJ-1基因具有高度相似性,对其进行克隆和生物信息学分析可以为今后利用盘基网柄菌模型研究DJ-1基因的功能和机制提供理论支持。     

林麝肺源ST1249型铜绿假单胞菌的分离鉴定及其全基因组序列分析

【目的】对分离自林麝化脓肺脏的1株疑似铜绿假单胞菌(PA)进行鉴定,并分析其致病和耐药机制,为林麝PA感染化脓性疾病的防控奠定基础。【方法】将病原菌分离纯化后,依次进行生化试验、16S rRNA序列分析、药敏试验和小鼠致病性试验,并通过全基因组测序,对分离菌株进行群体进化和物种分型分析以及基因功能注释。【结果】分离自林麝化脓肺脏的1株疑似铜绿假单胞菌经鉴定与PA相符,命名为FMDP001。药敏试验显示其对阿莫西林、头孢曲松、氨曲南、多粘菌素B和林可霉素耐药;对小鼠半数致死量为9.4×10~5 CFU/mL。全基因组序列分析显示该菌基因组大小为6 955 100 bp,序列类型为ST1249,与B136-33株同源性最高,且两菌株基因组平均核苷酸一致性(ANI)值达98.93%;全基因组中共有357个序列编码FMDP001与致病性相关的基因,根据功能分为黏附、铁摄取、胞外毒性蛋白和调控系统;84个序列编码耐药基因,其中多药耐药外排泵为主要成分。【结论】从林麝化脓肺脏中分离到1株致病性较强的PA,并获得ST1249型林麝源PA的全基因组序列,序列显示该菌携带大量药物外排泵及生物膜形成相关基因,决定其具有多重耐药特性,哌拉西林等可作为该类型PA感染的临床用药。     

肺炎克雷伯氏菌毒力因子及其基因组学研究进展

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）属于肠杆菌科、克雷伯菌属,在人和动物肠道、呼吸道以及水、土壤、林产品和农产品中广泛存在,肺炎克雷伯氏菌作为一种机会致病菌,是目前公认的导致人和动物发病的重要革兰阴性菌。该菌可引起宿主感染肺炎、肝脓肿、脑膜炎、肠炎、子宫炎、乳腺炎及败血症。此外,随着测序技术的发展,全基因组序列分析已经广泛应用于探究肺炎克雷伯氏菌入侵以及抵抗宿主免疫系统引起致病的研究。对肺炎克雷伯氏菌毒力因子荚膜（Capsule）、脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）、菌毛（Fimbriae）、外膜蛋白（Outer membrane proteins）、铁载体（Siderophores）、尿囊素（Allantoin）代谢相关因子及其基因组学研究进展进行综述,并对肺炎克雷伯氏菌研究中的一些问题进行探讨。     

肺炎克雷伯菌噬菌体分离鉴定及抑菌效果研究

为探究噬菌体作为新型生物抗菌剂防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎和乳制品及其加工过程污染,以及对生物被膜清除的能力,以ATCC 700603为宿主菌从某牛场水样中分离得到1株肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnM-YP11,并通过透射电镜观察噬菌体形态特征;通过双层平板法测定噬菌体宿主谱;通过最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH稳定性测定噬菌体生物学特性;通过全基因组测序分析基因组的结构特征、比较其进化关系;通过结晶紫染色法和平板计数法测定噬菌体对生物被膜的抑制和清除效果;通过牛奶试验分析该噬菌体对牛奶中肺炎克雷伯菌的抑菌效果。结果表明：1）从牛场水样中分离获得肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnM-YP11,能形成清晰透亮噬菌斑,透射电镜观察vB_KpnM-YP11具有肌尾噬菌体的典型结构。2）测定噬菌体宿主谱,表明vB_KpnM-YP11能够裂解 18/34 株牛源肺炎克雷伯菌。3）生物学特性结果表明vB_KpnM-YP11最佳感染复数为0.1,vB_KpnM-YP11感染宿主菌潜伏期为30 min,爆发期为50~90 min,110 min后进入平台期,平均裂解量为69 PFU/cell,在pH（3~11）和温度（4~60 ℃）范围内活性稳定。4）vB_KpnM-YP11基因组全长166 607 bp,GC含量为39.52%,注释结果显示共有276个ORF和15个tRNA,不含耐药基因及毒力基因。5）vB_KpnM-YP11最佳感染复数为0.1时,具有显著抑制肺炎克雷伯菌生物被膜的形成能力。vB_KpnM-YP11效价为10⁸ PFU/mL,10⁹ PFU/mL能有效清除肺炎克雷伯菌生物被膜。在室温条件下,12 h内vB_KpnM-YP11使牛奶中细菌浓度下降98%。综上,本研究分离获得噬菌体vB_KpnM-YP11潜伏期短、裂解效率高,不仅能抑制和清除生物被膜,同时对牛奶中肺炎克雷伯菌也有显著的抑菌效果,具有作为肺炎克雷伯菌生物抗菌剂的应用潜力。     

水貂源肺炎克雷伯杆菌分离、鉴定及疫苗潜能分析

水貂在夏季养殖时常出现出血性肺炎症状,病原大部分为铜绿假单胞菌。然而近10 a来采自河北、山东、辽宁等地水貂部分出血性肺炎病例中没有分离到铜绿假单胞菌,为探清病原,针对以上病料进行其他病原的分离鉴定。通过病料的细菌分离、常规鉴定,16S rRNA基因测序,动物回归试验、毒力试验、免疫原性试验及攻毒保护试验等,确定6株分离菌株有致病性,并被鉴定为肺炎克雷伯杆菌,分别命名为FY1、FY2、FY3、FY4、FY5、FY6,其中FY3为毒性最强的肺炎克雷伯氏菌(ZC1108株)。以该毒株对10月龄健康水貂进行肌肉注射,结果显示其致死率为100%(5/5);以该菌株制备的灭活疫苗免疫水貂后攻毒保护率达100%(5/5),试验水貂全部健活。表明肺炎克雷伯氏菌(ZC1108株)灭活疫苗免疫原性良好。     

林麝同期发情技术的研究

将30头林麝随机分为4个试验组进行同期发情处理。在4个试验群中,根据处理药物不同又分为孕酮片(MAP)处理和氯前列烯醇(PG)处理组。MAP处理组采用MAP高(20mg/头)和低(10mg/头)2个剂量处理;连续用MAP8d后,一次肌肉注射孕马血清促性腺激素(PMSG)600IU/头。PG处理组采用PG高(0.2mg/头)和低(0.1mg/头)2个剂量处理;首先一次肌肉注射PMSG600IU/头,48h后,肌注PG0.1mg/头(或0.2mg/头),6d后,再次肌注PG0.1mg/头(或0.2mg/头)。结果表明,MAP高(20mg/头)与低(10mg/头)2个剂量处理的同期发情率分别为62.5%(5/8)和75%(6/8),差异不显著(P>0.05);而PG组高(0.2mg/头)和低(0.1mg/头)2个剂量的同期发情率分别为28.5%(2/7)和71.4%(5/7),差异显著(P<0.05);MAP组与PG组间同期发情率尽管差异不显著(P>0.05),但MAP处理组同期发情率(68.7%,11/16)明显高于PG组(50%,7/14)。     

林麝粪便基因组DNA的提取及PCR扩增

【目的】探索从林麝粪便中提取基因组DNA并进行物种鉴定的可行性,为林麝野外调查工作以及分子粪便学在林麝保护中的应用提供科学依据。【方法】采集林麝粪便,采用改良的CTAB抽提基因组DNA;按常规PCR法对mtDNA D-loop区和Cyt b基因进行扩增测序后,用DNAMAN 6.0软件进行系统发育分析;在不同温度存放不同时间,研究林麝粪便基因组DNA的提取与mtDNA D-loop区和Cyt b基因PCR扩增的时效性。【结果】以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增均能特异性地扩增出mtDNA D-loop区和Cyt b基因。系统发育分析结果表明:所扩增产物为林麝的mtDNA D-loop区和Cyt b基因。时效性分析结果显示:常温和4℃条件下保存96h以内的林麝粪便所提取的基因组DNA能有效扩增出mtDNA D-loop区和Cyt b基因。【结论】自然条件下林麝粪便中林麝自身体细胞DNA保存时间较长,通过在野外采集林麝粪便提取基因组DNA并进行物种鉴定是可行的。     

圈养林麝养殖场内铜绿假单胞菌的分布及其耐药性分析

从陕西镇坪、四川宝兴两个林麝养殖中心共采集124份样品进行铜绿假单胞菌的分离鉴定,并采用微量肉汤稀释法检测其耐药情况。结果显示,共分离出60株铜绿假单胞菌,其中镇坪34株,宝兴26株。两个养殖场铜绿假单胞菌检出率由高到低依次为伤口脓汁>死亡林麝组织器官>伤皮>鼻拭子>土壤>粪便>尿液>空气,且镇坪比宝兴的总检出率高。所分离的60株铜绿假单胞菌耐药表型趋于一致,都对阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星敏感,对亚胺培南中等敏感,对多西环素、四环素、磺胺异恶唑严重耐药。     

核盘菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因的 预测与生物信息学分析

为了解磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTases)在核盘菌生理代谢与致病过程中的作用,在核盘菌全基因组中寻找PPTases同源物。利用同源比对的方法,预测出核盘菌中PPTases基因,进而分析其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、二级、三级结构和保守结构域,并对PPTases编码氨基酸进行遗传进化分析。结果表明,在核盘菌全基因组中预测存在3个PPTases基因同源物,分别命名为:Ss-Ppt1、Ss-Ppt2和Ss-Ppt3。3个蛋白均为亲水性的非分泌型蛋白,在其二级和三级结构中α螺旋结构和无规则卷曲占主要部分,且三者都含有PPTases的保守结构域SCOP和(或)ACPS。     

一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因分型及rpoE基因生物信息学分析

为分析本实验室分离保存的一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因型和rpoE基因编码蛋白的生物特性,通过16S rDNA、特异性基因、荚膜分型、脂多糖分型、rpoE基因扩增等分子生物学和生物信息学方法对此株牦牛源多杀性巴氏杆菌进行分析.结果 表明:此株牦牛源多杀性巴氏杆菌为B∶ L2∶ST44基因型,rpoE基因和印度牛源多杀...     

非孕期圈养林麝粪样皮质醇激素变化及其指示作用

于2010年4月底至9月中旬采集了陕西凤县圈养林麝的新鲜粪样,运用酶联免疫法（ELISA）测定了林麝非孕期的粪样皮质醇含量,探查林麝的应激生理状态。结果表明:圈养雌性林麝非孕期应激生理状态可以分为4个阶段（幼仔卧巢哺乳期、幼仔出巢哺乳期、幼仔单独饲养期、雌麝进入发情期）,其中,雌麝于产后的幼仔卧巢哺乳期处于较高的应激生理状态（产后第2~4周）,而雌麝与幼麝分离期处于较低的应激生理状态（产后第13~15周）;与此对应,单独饲养且与育幼无关的雄麝仅于饲料更换阶段（5月份）表现出一定的应激生理水平增高。分析得出,非孕期圈养林麝粪样皮质醇水平变化与重要的时间相联系,是导致应激生理状态变化的主导因素。认为圈养林麝非孕期应以雌麝的管护为主,尤其处于较高水平的第1阶段,是育幼雌麝饲喂和管护的敏感时期。