JS/1/97/Go株GPMV M基因的克隆、序列分析

鹅副黏病毒(GPMV)属于副黏病毒科副黏病毒亚科腮腺炎病毒属APMV-1中的成员,为单股负链RNA病毒,基因组所编码的6种蛋白NP、P、M、HN、F、L是其生物功能的主要体现者.     

鹅副粘病毒YG97分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株YG97经10日龄鸡胚增殖后纯化，提取病毒的基因组RNA，采用RT－PCR一次性扩增出与预期设计的1.9kb大小相符合的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pGEM^R-T载体，经转化、筛选及酶切鉴定后，初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆，进一步进行了序列测定。序列分析表明所扩增的病毒的HN基因片段的长度为198bp，共编码571个氨基酸。同源性分析表明，YG97与LaSota毒株核苷酸同源性为79％，氨基酸的同源性为87％。与台湾1995年分离株Taiwan/95核苷酸和氨基酸的同源性分别为93％、96％，说明YG97与Taiwan/95亲缘关系较近，具有较高的相似性。与国内外部分发表的其它NDV毒株的核苷酸同源性在80％－84％之间，氨基酸的同源性在87％－91％之间。同源性分析表明YG97相对于经典的NDV在HN基因上发生了较大的变异。     

鹅副粘病毒NA-1分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株NA-1经11日龄鸡胚增殖后纯化.提取病毒的基因组RNA,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1.7kb大小相符合的特异条带.将扩增产物提纯后克隆入pMD 18-T载体,经纯化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1 740bp,该基因的ORF总长为1 716 bp,编码571个氨基酸.与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列,发现所测NA-1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为97.3%,与F48E9同源性为84.5%,与La Sota为82.2%.同源性分析表明NA-1相对于NDV在HN基因上发生了较大的变异.     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＣＥＭ＾Ｒ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５３３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｐ－Ｆ＾１１７,与ＮＤＶ强毒株特征相符,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符,同源性分析表明,与国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的核苷酸同源性为８６％,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在８２％～８９％之间,表明该毒株相对于经典的ＮＤＶ在Ｆ片段上发生了较大的变异。     

鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析

以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。     

鹅副粘病毒HZ株F蛋白基因的克隆及序列分析

以鹅副粘病毒HZ株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出F基因片段,然后将其克隆到pUCm-T载体中。经转化、筛选、酶切和PCR鉴定后,初步获得含鹅副粘病毒F基因的阳性克隆,并进行序列测定验证。结果表明,该基因由1 662个核苷酸组成,共编码553个氨基酸。与GenBank下载的9株参考毒株的F基因作同源性比较,发现HZ株与ZJ1、F48E9、Lasota等毒株的核苷酸同源性分别为98.3%、85.4%、82.7%;氨基酸同源性分别为97.8%、90.6%、88.1%。说明HZ株与经典的鸡新城疫病毒(NDV)在F基因上存在很大的差异,而与近年来的分离株亲缘关系较近。     

鹅副粘病毒HN基因的克隆与序列分析

以鹅副粘病毒GPV-SF02毒株的基因组RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增出HN基因片段，然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后，对阳性克隆进行测序；测序后拼接得出HN基因的全序列。经分析HN基因编码区核苷酸序列，所测GPV-SF02毒株与参考毒株NL-96核苷酸序列的同源性为86%。     

鸽Ⅰ型副粘病毒ZQ98-1株F基因全序列的克隆和序列分析

本研究报道了PMV－1／鸽／肇庆／1／1998株（ZQ98－1）F基因的全序列。该基因核苷酸序列长度为1712bp,编码由553个氨基酸组成的F0多肽。F0蛋白裂解位点处的氨基酸序列为^112K-R-Q-K-R-F^117,F0蛋白中有3个与病毒副合相关的重要抗原位点和6个糖基化位点。经比较,鸽Ⅰ型副粘病毒ZQ98－1株和PMV－1／Pigeon/England/1168/84(1168/84)株、Warwick株及Ulster株核苷酸序列的同源性分别为95％、90％和89％,氨基酸的为异率分别为5．4％、6．2％及9．1％。     

鹅细小病毒H1株VP2基因的克隆和序列分析

参考GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法对国内鹅细小病毒分离株H1(GPV-H1)株的结构蛋白VP2基因进行扩增，将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。结果表明：H1株VP2的核苷酸序列全长1764bp，编码587个氨基酸，与GenBarrk发表的GPV-B株、GPV-SHM株、GPV-YG株、番鸭细小病毒(MDPV)FRANCE株、FM株的VP2相比，核苷酸同源率分别为98．6％、96．2％、93．2％、80．3％、80．0％，推导氨基酸序列同源率分别为98．3％、97．5％、96．1％、88．2％、87．4％。     

鹅副粘病毒F基因的克隆及遗传变异分析

以鹅副粘病毒LN-7-02株基因组RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出F基因片段,并克隆至T载体.经质粒PCR及酶切鉴定后,对阳性克隆进行测序.测序后拼接得到F基因上游539bp核苷酸序列,并推导出ATG后1～374bp氨基酸序列.序列分析表明,LN-7-02株F蛋白裂解位点区的氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,与禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)强毒株特征相符.将LN-7-02与AMPV-1株CH2000、F48E9和LaSota进行同源性比较,结果LN-7-02与CH2000、F48E9和LaSota的同源性分别为91.8%、86%和84%,表明该毒株相对于经典的AP-MV-1在F基因上已发生了较大变异.根据国内外70株APMV-1的F基因核苷酸序列绘制系统发育进化树,结果疫苗株Lasota属于基因Ⅱ型,经典株F48E9属于我国特有的基因Ⅸ型,而LN-7-02株与鹅副粘病毒JS-9-01、ZJ-100和GD-QY97同属于APMV-1基因Ⅶ型.     

鹅源禽副粘病毒GPMV/QY97-1株的生物学特性

对新近分离到的鹅源禽副粘病毒ＧＰＭＶ／ＱＹ９７－１株的生物学特性进行了研究。结果表明,该病毒粒子在电镜下呈球形,直径１２１～２５０ｎｍ,表面有纤突,能凝集鸡的红细胞,血凝反应能被Ｉ型禽副粘病毒阳性血清所抑制,由此初步判定该病毒属于Ｉ型禽副粘病毒,该病毒人工感染１、１４、２８、４８日龄的鹅,发病率均为１００％。致死率分别为１００％、８７．５％、６２．５％、１２．５％;人工感染２５日龄的鸡,发病率和致     

鸭Ⅰ型禽副粘病毒YH99V株HN基因的克隆和序列分析

在浙江地区进行鸭病病因的调查过程中，从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒，经鉴定该病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型，命名为YH99V株。以YH99V株的基因组RNA为模板，通过RT—PCR一步法扩增出其HN基因的cDNA片段，然后将其克隆至pMD18-T载体中，对其进行序列测定。测序后拼接出HN基因的序列长度为1785bp，该基因的ORF总长为1734bp，编码577个氨基酸。将YH99V株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现，它们的核苷酸序列同源性分别在82．1％～99．7％，氨基酸序列同源性为87．2％～99．5％。在同源性比较的基础上，进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病调查有着重要的意义。     

鹅副粘病毒NP基因的原核表达及表达产物抗原性检测

根据GenBank中发表的GPMVSF02株的NP基因的核苷酸序列设计合成一对引物，通过RT-PCR扩增JS／1／97／Go株的NP基因，将其克隆人pMDl8-T载体，序列测定和分析表明：所扩增的NP基因的核苷酸长为1470bp，共编码490个氨基酸。再将NP基因定向亚克隆至原核表达载体pGEX-6P的多克隆位点，经酶切鉴定后将含有NP基因的阳性亚克隆重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，用诱导荆IPTG分别以不同的浓度进行诱导，并在不同的诱导时间进行采样，样品经处理后通过SDS-PAGE、Westernblot和Dot-ELISA进行分析。结果显示：以终浓度为1mmol／LIPTG进行诱导4h表达可达到高峰。表达的融合蛋白大小约为80kD，并具有良好的抗原性。     

猪流感病毒H1N1亚型济南株HA、NA、NP基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H1N1亚型HA、NA、NP基因序列,分别设计扩增HA、NA、NP基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒(SIV)H1N1济南株(SW/SD/JT/07)HA、NA、NP基因,分别将RT-PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果显示,SW/SD/JT/07(H1N1)HA基因长为1 701bp,编码566个氨基酸;HA蛋白切割位点为IPSIQSR↓G,属于非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,其中有6个在HA1蛋白上,有2个在HA2蛋白上,与个别参考毒株糖基化位点个数不同;HA蛋白上的受体结合位点与多数参考毒株一致。SW/SD/JT/07(H1N1)NA基因长为1 410bp,编码469个氨基酸;NA基因颈部未发现氨基酸缺失现象;NA蛋白的头部有5个可能的抗原位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别由5个区段组成,在340、346、366位分别为P、I、N,其余参考毒株在相应位置的氨基酸分别为S、V、S;NA蛋白共有8个糖基化位点,与个别参考毒株的糖基化个数不同。SW/SD/JT/07(H1N1)NP基因长为1 565bp,编码498个氨基酸,根据HA、NA、NP基...     

11株新城疫病毒广西分离株NP基因的克隆和序列分析

根据基因库中新城疫病毒(NDV)的NP基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对广西在2000～2003年暴发新城疫的鸡群中分离的11株NDV毒株NP基因进行RT-PCR扩增和序列测定,拼接出11个NDV广西分离株的NP基因的全序列,10个NDV广西分离株的NP基因阅读框的核苷酸序列全长均为1470 bp,编码489个氨基酸,它们的NP基因核苷酸全序列及推导的氨基酸全序列与10个已发表的NDV参考株的NP基因全序列比较分析结果表明:核苷酸序列同源性为84.8%～98.2%,氨基酸同源性为89.8%～99.4%.     

禽流感病毒A/chicken/Mudanjiang/0823/2000(H9N2)株NP及M1基因的克隆及序列分析

参照已发表的A型禽流感核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)基因序列及其基因组特性,设计合成了一条通用反转录引物和两对特异性引物,采用RT-PCR法,成功克隆了禽流感病毒国内分离株A/chicken/Mudanjiang/0823/2000(H9N2)株的NP、M1基因.序列测定结果为NP基因cDNA全长1497bp,编码498个氨基酸.M1基因cDNA全长759bp,编码252个氨基酸.将其序列与数株A型流感病毒(H9N2)NP及M1基因序列进行比较,NP基因同源性为90.51%～98.46%,氨基酸序列同源性为95.38%～98.59%.M1基因同源性为90.78%～97.36%,氨基酸序列同源性为95.63%～99.60%.     

鹅细小病毒QY分离株NS2基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列设计并合成了扩增广东清远分离株(QY株)NS2基因的一对引物,利用PCR技术扩增出来长约1.5kb的目的片断,将其克隆到PMD18-T载体上,筛选重组质粒并进行了序列测定及分析,测序结果表明,GPV分离株NS2基因由1356个核苷酸组成,编码451个氨基酸。经与B株、DN株、FS株进行同源性比较,核苷酸的同源性分别为99.1%、99%和99%;推导的氨基酸同源性分别为98.7%、98.7%和987%。