猪IFN-γ mRNA竞争性RT-PCR定量检测方法的建立

无菌分离的猪外周血单个核细胞（PBMC）,经ConA体外刺激培养15 h后提取细胞总RNA.以此总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到了435 bp的IFN-γ基因.把扩增到的IFN-γ基因与pMD18-T载体连接,构建了pMD-IFN435重组质粒.用另一对引物对重组质粒pMD-IFN435内部进行PCR扩增,得到了257 bp（含PstⅠ酶切位点）的基因片段,将此基因片段连接到pMD18-T载体上构建了pMD-IFN257重组质粒.将pMD-IFN257双酶切（PstⅠ＋SalⅠ）后回收的目的片段与pMD-IFN435双酶切（PstⅠ＋SalⅠ）后回收的目的片段连接,得到了含有367bp目的片段的重组质粒pMD-IFN367,即内标准DNA模板.以定量后的pMD-IFN367与2倍梯度稀释的pMD-IFN435进行竞争PCR扩增,建立了能够准确、方便定量检测猪IFN-γmRNA的标准竞争曲线的线性回归方程（y=0.414x-1.864）.     

广灵驴ADSL基因克隆、序列分析及组织表达研究

本研究旨在对广灵驴腺苷琥珀酸裂解酶（adenylosuccinatelyase,ADSL）基因进行克隆及生物信息学分析,并检测其在不同组织中的表达情况,为探究ADSL基因在广灵驴肌苷酸合成及风味形成中的作用机制提供理论参考。根据GenBank中公布的马（登录号：XM_001917207.5）、牛（登录号：NM_001102377.2）、猪（登录号：GU249574.1）等物种的ADSL基因mRNA序列,通过Primer Premier 3.0在线工具设计同源引物,RT-PCR法扩增并克隆ADSL基因序列,对编码序列进行结构与功能分析,最后用实时荧光定量PCR检测ADSL基因在广灵驴心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌组织中的表达水平。结果显示,广灵驴ADSL基因CDS长1 473 bp,编码490个氨基酸,提交至NCBI,登录号：MW037837,其核苷酸序列与马、牛、双峰驼、猪、绵羊、人、小鼠的相似性分别为99.5%、90.8%、92.3%、90.4%、90.7%、90.5%和86.0%。进化树分析结果表明,广灵驴与马的种属关系最近,与小鼠的亲缘关系最远。ADSL蛋白分子质量为55.44 ku,等电点为6.52,平均疏水指数为-0.243,是一种不稳定的酸性亲水蛋白。ADSL蛋白有41个磷酸化修饰位点,6个糖基化修饰位点,没有信号肽和跨膜结构,有1个卷曲螺旋。ADSL蛋白主要定位在细胞质,α-螺旋（68.98%）是主要的二级结构。ADSL基因在广灵驴6个组织中都有表达,其中肺脏中的表达量最高,显著高于其他组织（P<0.05）,其次是心脏和肝脏,脾脏、肾脏和背最长肌中的表达量最低。本研究结果为今后探究ADSL基因在广灵驴肌苷酸合成及风味形成的分子机制奠定基础。     

猪BST-2全基因克隆、真核表达载体构建及组织表达谱分析

为研究猪BST-2基因的生物学功能,用特异性的引物扩增猪BST-2基因,并利用生物信息学软件对猪BST-2基因及氨基酸进行分子特性分析,同时进行了猪BST-2蛋白的真核表达及组织表达谱分析。结果表明:猪BST-2基因全长851bp,其中5′-UTR为23bp,3′-UTR为294bp,CDS区为534bp,编码177个氨基酸,猪源BST-2蛋白氨基酸序列与大猩猩、仓鼠、家鼠、驴、猫、牛、猕猴、绵羊、人BST-2蛋白氨基酸序列同源性分别为46.1%,41.7%,39.5%,35.4%,42.0%,40.5%,44.4%,38.7%,46.8%。含有2个跨膜结构(27~49aa和154~176aa),2个潜在的糖基化位点,14个潜在的磷酸化位点,包含磷酸激酶ATM、CKⅡ、PKA、PKC的结合位点。构建真核质粒并转染发现猪BST-2蛋白能够在Vero细胞内正确表达。半定量PCR检测发现BST-2基因在所有组织中均有表达,尤其是在免疫组织及器官(淋巴结、胸腺、扁桃体、脾)、大肠、小肠中的表达量较高。本试验为今后进一步分析验证猪BST-2蛋白的抗病毒机制奠定了基础。     

骨形态发生蛋白15基因mRNA在牛不同组织中的表达分析

由于BMP15基因对卵泡发育、优势卵泡的选择及排卵等雌性生殖过程的许多环节都起着关键作用,因此该研究应用RT-PCR技术检测了BMP15基因mRNA在蒙古牛卵巢、子宫、输卵管和肾脏组织中的表达情况.结果表明,BMP15基因在这4种组织中均有表达,只是在不同组织中的表达丰度不同,蒙古牛BMP15基因在卵巢组织中的mRNA水平极显著高于子宫组织(P＜0.01),显著高于肾脏组织(P＜0.05);说明BMP15基因在卵巢和输卵管中高度表达,在子宫和肾脏组织中表达丰度较低.     

猪ERK6基因编码区的克隆及组织表达谱分析

利用RT-PCR方法扩增了猪ERK6基因编码区的序列，将扩增产物与pMD18-T载体连接，构建了重组质粒；重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序；采用Northern杂交和半定量RT-PCR方法在猪不同部位骨骼肌中分析了ERK6基因转录本的个数、大小及组织表达谱。结果显示，所克隆的猪ERK6基因片段长1113bp，含有1个1104bp的开放阅读框（ORF），该ORF编码367个氨基酸；该基因与已报道的人ERK6基因核苷酸序列相似性为90％；猪ERK6基因在肌肉组织中只有一个转录本，大小约1．5kb。此基因在骨骼肌中的表达量最高，心、子宫次之，卵巢最低；而在脂肪、胃、肝、脾、肺、肾、十二指肠和胰腺中未见表达。结果表明，猪ERK6基因与已报道的小鼠和人ERK6基因一样，主要在骨骼中特异表达。     

猪FoxO1基因cDNA部分序列的克隆及其组织表达

根据人、黑猩猩及大鼠等物种FoxO1基因同源序列设计引物,利用RT-PCR方法从猪肝脏中克隆FoxO1基因cDNA的部分序列,组织特异性表达分析表明,FoxO1基因在1日龄和9月龄猪的肝、肺、肾、脾、心、胃、皮下脂肪、内脏脂肪、背最长肌和股四头肌等组织中均表达,只是表达丰度随发育阶段和组织的不同有所差异。1日龄猪的内脏脂肪中FoxO1的表达丰度最高,心脏和骨骼肌中相对较低;而9月龄猪的脾脏中FoxO1相对表达丰度最高,明显高于免疫机能尚未完全建立的初生猪,显示出FoxO1可能在机体的免疫调节中起一定作用,另外,9月龄猪的FoxO1表达丰度不仅在平滑肌和骨骼肌中有显著差异,而且在不同类型的骨骼肌中也存在显著差异,显示出FoxO1的表达可能与骨骼肌类型和运动强度有关。     

MYNN基因在猪不同组织及肌肉中的表达规律

试验旨在研究myoneurin（MYNN）基因在猪不同组织中的表达特征及其在肌肉（背最长肌、股二头肌和腰大肌）、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的发育性表达规律。采用实时荧光定量PCR技术研究猪MYNN mRNA在90日龄大白猪和马身猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小脑、小肠、胰脏、胃、股二头肌及脂肪共11个组织中的表达谱,以及在大白猪和马身猪1、90、180日龄3个发育阶段的肌肉、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的发育性表达规律。结果表明,MYNN在猪的各种组织中广泛表达,且各组织间表达差异显著或极显著（P < 0.05;P < 0.01）;MYNN在大白猪和马身猪的肌肉、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的不同发育阶段表达差异显著或极显著（P < 0.05;P < 0.01）,并具有特定规律,由此推测其可能在猪的这几种组织中发挥重要作用。MYNN基因的表达与组织、日龄及品种的遗传背景有关。本试验为研究猪MYNN基因的生物学功能提供了依据,但还需要深入的研究来探索其作用的具体机制,尤其是在骨骼肌发育中的调节机制。     

BPI基因在梅山猪初生断奶以及成年阶段的组织表达谱分析

为探讨杀菌/通透性增强蛋白(BPI)基因在梅山猪从初生到成年各个时期不同组织中的表达规律,利用qPCR检测初生、断奶、性成熟、体成熟4个重要发育时期(即1、35、134、158日龄)梅山猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠、空肠和回肠12个组织中BPI基因的表达水平。结果表明:4个不同发育阶段BPI基因的组织表达谱在心脏、肝脏、脾脏、肌肉和胸腺中均表现出相对一致的规律,即BPI基因的表达量一直处于极低水平,而在肠道组织中从初生到成年各时期均高度表达;BPI基因在胃中的表达程度随着日龄增长而显著提高;在小肠组织中,35日龄断奶仔猪BPI基因的表达水平极显著高于其他3个日龄。综上,推断肠道中BPI基因的高度表达是仔猪从初生就具有的抵抗大肠杆菌等病原感染属固有免疫的一部分,而在胃中的表达很可能是其后天为了抵御不断侵染的大肠杆菌等病原的结果。     

巴马猪BECN2基因的克隆及其mRNA组织表达分析

为了探究巴马猪BECN2基因编码蛋白的生物学特性及其mRNA在巴马猪不同组织中表达水平,试验采用PCR方法扩增并克隆巴马猪BECN2基因CDS全长序列;通过生物信息学方法对其编码蛋白进行分析并构建系统进化树;应用实时荧光定量PCR方法检测巴马猪BECN2基因mRNA在不同组织中表达情况.结果 表明:经PCR扩增巴马猪B...     

巴马香猪CIDEa基因克隆及组织表达分析

本试验旨在对巴马香猪CIDEa基因序列进行克隆,预测其蛋白结构和功能,并进行组织表达分析。根据NCBI已经公布猪的CIDEa基因序列(登录号:NM_001112696.2),利用Oligo 7.0软件设计引物,采用RT-PCR法扩增并克隆巴马香猪CIDEa基因序列,利用生物信息学软件分析其核苷酸序列及编码蛋白的疏水性、理化性质、跨膜结构域、二级结构、三级结构及互作蛋白,并采用实时荧光定量PCR方法检测CIDEa基因在巴马香猪皮下脂肪、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、背最长肌及心脏的表达规律。结果显示,试验成功获得巴马香猪CIDEa基因CDS区序列,全长660 bp,编码219个氨基酸,与GenBank中猪、牛、马、犬、人、猕猴和家鼠的核苷酸相似性分别为99.4%、84.7%、81.5%、80.9%、79.7%、78.9%和76.1%。与GenBank中野猪CIDEa基因核苷酸序列比对发现,发生4处碱基突变,其中A609G和T627C位点为同义突变,C173T(Pro→Leu)和C631T(Arg→Cys)位点为错义突变。巴马香猪CIDEa蛋白分子质量为24 483.57 u,等电点为9.48,不稳定指数为52.86,属于不稳定蛋白;该蛋白中亮氨酸(Leu)含量最高(13.2%),色氨酸(Trp)含量最低(0.5%)。巴马香猪CIDEa蛋白为膜外亲水性蛋白,包含1个超家族结构域(CIDE-N)。二级结构预测发现,巴马香猪CIDEa蛋白包含α-螺旋(45.66%)、β-转角(5.94%)、延伸链(14.61%)和无规则卷曲(33.79%),三级结构预测结果与二级结构一致。蛋白互作分析结果表明,巴马香猪CIDEa蛋白与PPARG、PPARGC-1、COX8H、PRDM16、DIO2、TMEM26、ELOVL3、COX7A1、CIDEC、DFFB蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,CIDEa基因在巴马香猪皮下脂肪中表达量最高,且显著高于其他组织(P<0.05),心脏中表达量最低。研究结果为进一步探讨CIDEa基因对巴马香猪脂肪沉积的调控机制提供理论依据。     

鸭髓样分化因子MyD88部分cDNA克隆及组织表达图谱分析

本试验采用RT-PCR技术克隆出鸭MyD88部分cDNA序列,克隆到的序列长为195 bp;同源性分析结果显示,鸭MyD88与鸡、火鸡、珍珠鸟的同源性最高,为97％～100％;与人、鼠、牛、猪、狗、马、兔、鲤鱼的同源性为83％～84％;与绵羊的同源性为79％;系统进化树分析表明,鸭MyD88与鸡的亲缘关系最近,与火鸡、珍珠鸟的较为接近,与狗、鼠、兔、人、猪、马、绵羊、牛的亲缘关系依次渐远,与鲤鱼的亲缘关系最远.检测MyD88在鸭7种组织中的分布情况,结果表明,在鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、腔上囊中均检测出MyD88 mRNA的转录产物,而在肾脏、脑中未见.提示MyD88在不同种属及不同组织中具有生物多样性.     

朊蛋白基因在奶牛生殖系统不同组织中的表达量测定

为了研究疯牛病能够垂直传播的理论基础,我们采用PrP基因做目的基因,GAPDH基因做内参照的相对荧光定量RT-PCR方法,对目的基因和内参基因分别构建标准重组质粒,制备标准曲线,利用标准曲线对采集雌雄奶牛生殖系统的12个不同组织PrP基因表达进行定量。试验结果表明雌雄奶牛的生殖系统各部分组织都有PrP基因表达,其中雄性奶牛的睾丸、附睾和输精管呈现高的表达量,分别为1.16±0.0010、1.81±0.0056、0.68±0.0038;前列腺、精囊腺和尿道球腺呈现中等表达量,分别为0.47±0.0018、0.25±0.0007、0.28±0.0007;阴茎呈现低的表达量为0.18±0.0017;雌性奶牛的子宫、子宫阜呈现高的表达量,分别为2.53±0.0008、1.75±0.0098;卵巢和输卵管呈现中等表达量,分别为1.55±0.0038、1.45±0.0064;阴道呈现低表达量为0.57±0.0036。本研究为阐释PrP基因在奶牛生殖系统的正常表达和正常的生理功能,以及为确定生殖系统在疯牛病垂直传播中的地位和其分子机理奠定了基础。     

利用实时定量RT-PCR测定肉鸡组织中CaBP基因的相对表达

试验旨在利用实时定量RT-PCR技术建立肉鸡组织钙结合蛋白(CaBP)基因相对表达量的测定方法,为进一步研究肉鸡钙吸收和利用的分子生物学机理以及骨骼的发育奠定技术基础。根据GenBank中鸡的CaBP基因序列,设计合成引物,进行SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR。以管家基因β-Actin为内参基因,对组织Total RNA进行均一化处理,利用循环阈值(Ct值)的变化计算CaBP基因的相对表达量。结果表明,肉鸡十二指肠及胫骨组织CaBP基因相对表达量分别在27.78~2-4.60和2-2.46~2-17.20范围。表明利用实时定量RT-PCR技术对肉鸡组织CaBP基因相对表达水平进行检测是可行的。     

胡麻异质型ACCase亚基基因的克隆与表达分析

为研究胡麻异质型乙酰辅酶A羧化酶BCCP、BC、α-CT和β-CT四个亚基基因的生物学功能,采用基因克隆、生物信息学和RT-PCR技术分别对胡麻accA、accB、accC和accD 4个基因进行分析。结果发现陇亚10号accA基因编码α-CT亚基,CDS序列全长为2364 bp,编码787个氨基酸;accB基因编码BCCP亚基,CDS序列全长为1173 bp,编码275个氨基酸;accC基因编码BC亚基,CDS序列全长为1574 bp,编码527个氨基酸;accD基因编码β-CT亚基,CDS序列全长为1137 bp,编码378个氨基酸,且4个基因编码的蛋白都是脂肪酸系数较高的亲水性蛋白。RT-PCR结果表明,胡麻accA、accB、accC和accD 4个基因在3个胡麻品种(高含油量的张亚2号、中含油量的陇亚10号和低含油量的R2-17)的不同时期不同组织的表达模式不同,accA、accB、accC和accD四个基因在R2-17、陇亚10号和张亚2号3个胡麻品种所有时期的不同组织中均有表达,但在种子中的表达量均明显高于其他组织,尤其在种子发育10~25 d油脂快速积累时期,4个基因的表达量都迅速增加并达到最高峰。研究表明异质型乙酰辅酶A羧化酶基因可能调控胡麻种子发育前期油脂的合成积累。     

Evaluation of endogenous control genes for gene expression studies across multiple tissues and in the specific sets of fat- and muscle-type samples of the pig

To normalize a set of quantitative real-time PCR (q-PCR) data, it is essential to determine an optimal number/set of housekeeping genes, as the abundance of housekeeping genes can vary across tissues or cells during different developmental stages, or even under certain environmental conditions. In this study, of the 20 commonly used endogenous control genes, 13, 18 and 17 genes exhibited credible stability in 56 different tissues, 10 types of adipose tissue and five types of muscle tissue, respectively. Our analysis clearly showed that three optimal housekeeping genes are adequate for an accurate normalization, which correlated well with the theoretical optimal number (r ≥ 0.94). In terms of economical and experimental feasibility, we recommend the use of the three most stable housekeeping genes for calculating the normalization factor. Based on our results, the three most stable housekeeping genes in all analysed samples (TOP2B, HSPCB and YWHAZ) are recommended for accurate normalization of q-PCR data. We also suggest that two different sets of housekeeping genes are appropriate for 10 types of adipose tissue (the HSPCB, ALDOA and GAPDH genes) and five types of muscle tissue (the TOP2B, HSPCB and YWHAZ genes), respectively. Our report will serve as a valuable reference for other studies aimed at measuring tissue-specific mRNA abundance in porcine samples.     

猪GDF11基因部分序列的克隆及组织表达分析

为了探讨生长分化因子11(Growth differentiation factor11,GDF11,又名BMP11)在胸腰椎数变异中的作用,本试验克隆了该基因包含外显子2在内的部分编码区,并进一步采用RT-PCR技术对其在猪胚胎和初生仔猪中的表达进行了分析。结果表明,在35d的猪胚胎中,后肢、牙龈、脑、肝脏、肾脏、胸椎、腰椎各组织均有明显的表达,而在前肢、眼、心脏、肺脏中的表达较弱,在颈椎和荐尾椎中没有观察到GDF11的表达。在45d猪胚胎的后肢、脑、眼、胸椎组织中GDF11的表达较强,而在前肢、牙龈、肺脏、肾脏、腰椎和荐尾椎的表达相对较弱,在肝脏中的表达极其微弱。在心脏和颈椎中没有检测到GDF11的表达。在55d的猪胚胎中,前肢、后肢、脑、眼、肝脏、颈椎、胸椎、腰椎组织中有明显的表达,肺脏和肾脏组织中的表达较强,牙龈和荐尾椎中的表达较弱,而在心脏中没有检测到GDF11的表达。3d仔猪的后肢、牙龈、脑、肾脏和腰椎组织中GDF11有明显的表达,脾脏组织的表达量较高,前肢、肝脏、心脏、背腰最长肌和肺脏中的表达相对较弱,在眼、颈椎和荐尾椎中的表达极弱,在胸椎中没有检测到表达。在所检测的不同时期的所有组织中,脑和肾脏组织表达明显地高于其他组织。     

贵州山羊品种RERG基因的克隆及不同组织表达

选择与羊同源性较高的牛ras相关的雌激素调节的生长抑制因子(ras-related estrogen-regulated growth inhibitor,RERG)基因组序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术对RERG基因进行克隆测序及生物信息学分析.结果显示,克隆了羊RERG基因cDNA序列629 bp,完整的开放阅读框(ORF)为20～620 bp,其编码199个氨基酸.GenBank登录号分别为JN672576、JQ917222和JN580309.通过实时荧光定量RT-PCR技术分析RERG基因在贵州三大地方品种同一年龄段不同组织中的表达情况.结果表明,成年羊肺脏和脾脏表达量是最高,胸腺表达量最低,肌肉表达量为相对中度表达.为进一步研究地方品种羊生长性状的改善提供科学依据.