生防内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1在西瓜植株内的定殖能力检测

分别对枯草芽孢杆菌Jaas ed1进行利福平(Rif)抗性标记和绿色荧光蛋白(GFP)标记,获得Rif抗性标记的菌株Jaas ed1R及GFP标记的菌株Jaas ed1-GFP,并初步研究Jaas ed1在西瓜植株中的定殖能力。定殖结果表明,在灌根接种Jaas ed1R后的35 d内能在西瓜苗根部检测到Jaas ed1R,20 d内能在茎部检测到Jaas ed1R;并且在根部定殖的数量显著大于茎部,接种后3 d根部Jaas ed1R的数量为1.62×104cfu·g-1鲜重,茎部为2.95×102cfu·g-1鲜重。灌根接种Jaas ed1-GFP后的第3天,在荧光显微镜下观察到西瓜苗根部存在大量的Jaas ed1-GFP,在激光共聚焦显微镜观察到西瓜苗茎内的Jaas ed1-GFP分布集中在维管束中。说明内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1能够在西瓜植株体内定殖,能够从土壤中进入西瓜根部组织,并且能够侵入到茎部微管束组织中,从而在整个植株体内转移。     

枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防治棉花黄萎病示范

枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病具有一定的抑制作用,为验证枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防治棉花黄萎病的效果,特设置大田示范。试验结果表明:每667米2随水滴施枯草芽孢杆菌1千克,棉田枯萎病发病较轻,相对防治效果在50%以上。     

枯草芽孢杆菌对棉花枯、黄萎病的抑制作用研究

[目的]研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生物学特性,测定枯草芽孢杆菌对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的抑菌效果,对枯草芽孢杆菌的抑菌机理进行初步研究.[方法]菌丝生长速率法,平极对峙培养法,定期观察和显微镜法.[结果]枯草芽孢杆菌对温度和酸碱度的适应范围广,营养条件与枯黄萎病菌菌丝生长需要一致;棉花枯萎病菌培养至第7 d时,抑菌效果为88.8;,棉花黄萎病菌菌丝培养至20 d时,抑菌效果为86.5;;该菌对枯黄萎病菌具有明显的营养竞争和空间竞争作用,可以溶解致菌菌丝和导致菌丝畸形.[结论]该菌是一种适应性较强的微生物,枯草芽孢杆菌对棉花枯萎病菌和黄萎病菌具有明显抑制作用,枯草芽孢杆菌可用于新疆地区棉花枯萎病菌和黄萎病的防治.     

棉花黄萎病生防内生细菌Jaas cd的鉴定及田间防效

对棉花黄萎病生防内生细菌Jaas cd(原名73a)进行了菌种鉴定和田间应用方式的改进。抑菌谱测定结果表明,该菌株对12种病原真菌均有较强的抑制作用。通过形态观察、生理生化鉴定、Biolog鉴定以及16S rD-NA序列比对,证明该菌株为多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。菌株Jaas cd的16S rDNA序列与多黏类芽孢杆菌(AM062684)的相似性为99.7%,GenBank登录号为AY942618。田间大区示范试验结果表明,用菌株Jaascd的发酵液在棉苗移栽前喷施棉苗和移栽时灌根2种方式处理,都能有效防治棉花黄萎病和提高棉花产量,但移栽前喷施棉苗操作更加简便易行。     

一株芽孢杆菌16S rRNA的基因序列测定和系统进化分析

从河南黄河稻区土壤中分离出一株具有较强稻瘟病菌拮抗活性的芽孢杆菌菌株BS501,经过形态观察、生理生化特性检测和电镜技术,确定其为芽孢杆菌属细菌,为进一步确定其分类学地位,扩增了 BS501基因组的16S rDNA.并将测序结果提交GenBank数据库(登录号:FJ755787).利用BLAST软件将该序列与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢菌属细曲及大肠杆菌16S rDNA序列进行同源性比对.系统进化树表明,BS501与芽孢菌属细菌存进化关系上组成一个大的分支,与枯草芽孢杆菌最为接近,与大肠杆菌较远.同源性分析表明该序列与枯草芽孢杆菌PRE23同源性达99%,证实该菌株的分类学地位为枯草芽孢杆菌.     

枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。     

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)是纳豆发酵产氨的关键酶.本文以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板,根据枯草芽孢杆菌的GDH编码基因(RocG)序列设计引物,进行PCR扩增,再经pMD19-T质粒TA克隆,获得了全长为1275 bp、与RocG基因同源性为98%的纳豆芽孢杆菌GDH的编码基因.构建原核表达载体pET28a-GDH,转化至E.coli BL21(DE3)进行体外诱导表达.表达的包涵体在超声破菌、变性、纯化和复性后,经SDS-PAGE分析得到了47 kDa的特异条带.纳豆芽孢杆菌GDH同时具有NAD+和NADP+依赖活性,酶活分别为6.7723 U·mg-1蛋白和9.4205 U·mg-1蛋白.     

枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达

 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD,表达水平29.77 mg?L-1,水解酪素酶活力27 800 U?g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。     

枯草芽孢杆菌菌肥对棉花黄萎病的防治效果

本文选择枯草芽孢杆菌菌肥,验证其对棉花黄萎病的控制效果。结果表明:使用枯草芽孢杆菌菌肥,对棉花黄萎病具有控制作用,对棉株生长发育无不良影响,其中,667米~2使用80毫升防治效果最好。     

顺反子序列bioⅠ-orf 2-orf 3在枯草芽孢杆菌染色体中的整合

将来源于枯草芽孢杆菌的顺反子序列bioⅠ-orf 2-orf 3克隆到含氯霉素基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pE 3中,并在顺反子序列上游插入一个强麦芽糖启动子Pglv,构建成枯草芽孢杆菌整合载体pLHX8,电转化枯草芽孢杆菌受体菌1A747.从5μg/ml的氯霉素抗性平板上挑取两株转化子,通过基因组PCR鉴定,确定顺反子序列已经整合到枯草芽孢杆菌染色体上.