志贺样毒素Ⅱ型变异体对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌IL-8 IL-6和PGI2的影响

志贺样毒素Ⅱ型变异体[1](SLT-Ⅱe)是猪水肿病大肠杆菌导致仔猪形成水肿病的主要致病因子.研究证明,SLT-Ⅱe能损伤小肠上皮细胞和血管内皮细胞[2],引起细胞分泌功能障碍,进而导致微血管舒缩和通透性发生变化,最终形成猪水肿病.本试验通过研究SLT-Ⅱe作用大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(MVECs)后,其培养上清液中IL-8、IL-6和PGI2的浓度变化,以期从SLT-Ⅱe影响微血管内皮细胞分泌功能方面,探讨SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜MVECs的损伤机制.     

SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO的影响

志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)是猪水肿病(ED)的主要致病因子[1],已有研究表明,SLT-Ⅱe致病机制是通过对其靶细胞-肠黏膜微血管内皮细胞(IMMVECs)的刺激,引发细胞分泌细胞因子机能的改变,从而影响细胞的正常形态和功能而致病的.     

BALB/c鼠口服免疫猪水肿病大肠杆菌基因突变菌株的免疫效果

为了研究猪水肿病(ED)大肠杆菌SLT-Ⅱe基因突变菌株作为口服疫苗的免疫效果,本实验用已构建的猪ED大肠杆菌SLT-Ⅱe基因突变菌株口服免疫BALB/c小鼠,检测其血清中的IgG抗体及粪便和肠黏液中的slgA抗体水平,并进行淋巴细胞增殖检测及攻毒保护实验.结果表明该基因突变菌株具有良好的免疫性,能诱导小鼠体内产生IgG和sIgA抗体,并且能引起T淋巴细胞增殖反应.攻毒保护实验结果显示,口服免疫突变菌株能对小鼠提供良好的保护,保护率为75%(15/20).本研究结果证明,该大肠杆菌基因突变菌株在小鼠体内能激发体液免疫和细胞免疫反应,可作为猪ED口服疫苗的候选菌株.     

猪水肿病大肠杆菌基因突变株的构建

应用定点突变技术将野生型猪水肿病大肠杆菌(O_(139))主要毒力基因SLT-Ⅱe A亚基中第167位谷氨酸和第170位精氨酸,分别突变为谷氨酰胺(E1670)和亮氨酸(R170L)后,获得突变基因SLT-Ⅱe~*。通过同源重组,将野生菌中的毒力基因SLT-Ⅱe替换为SLT-Ⅱe~*,构建了一株毒力基因突变株(SLT-Ⅱe~*)。实验结果显示,该突变菌株对Vero细胞的毒性是野生菌毒性的1/500。     

SLT-2e对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌PGI2、TXA2和PAF的影响

志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-2e)又叫猪水肿病毒素,能引起仔猪水肿病,是仔猪水肿病的主要毒力因子[1~3]。SLT-2e作用于微血管能引起微血管内皮细胞损害而导致水肿,因此在猪水肿病的发生中起着决定性作用。M eth iyapun等[4]研究表明水肿病大肠杆菌对猪肠黏膜没有重要的病理变化,而靶细胞是微血管内皮细胞,表现为内皮细胞空泡化、血管周围水肿、微血栓形成等。为了研究微血管内皮细胞在仔猪水肿病发病机制中的作用,本试验应用原代培养的肠黏膜微血管内皮细胞研究了SLT-2e对其培养上清液中PG I2、TXA 2及PDF浓度的影响,旨在了解SLT-2e…     

氧化苦参碱对SLT-2e作用下肠黏膜微血管内皮细胞分泌IL-8的影响

猪水肿病又称肠毒血症,是由某些O抗原型大肠杆菌引起的猪的致死性、细菌性传染病[1].1950年,Timoney F[2]等研究证实,猪水肿病的主要致病因子是志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-2e).     

茯苓酸对SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的影响

通过检测茯苓酸对SLT-Ⅱe诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的浓度变化,探索茯苓主要成分茯苓酸对仔猪水肿病的疗效机制.将培养的肠黏膜微血管内皮细胞分为对照组、SLT-Ⅱ e组、不同质量浓度茯苓酸处理组5个组,采用ELISA法测定了培养3,6,9,12 h细胞上清液中P-选凝素、sICAM-1及TNF-α浓度的变化.结果表明,不同质量浓度茯苓酸处理组对SLT-Ⅱ e诱导肠黏膜微血管内皮细胞过量分泌P-选凝素、TNF-α无明显的抑制作用;0 mg/L茯苓酸处理组对SLT-Ⅱ e诱导肠黏膜微血管内皮细胞sICAM-1的分泌具有明显的下调作用,使其分泌sICAM-1的浓度逐渐下降至正常水平.由此可见,茯苓酸通过抑制SLT-Ⅱ e诱导肠黏膜微血管内皮细胞sICAM-1的过量分泌,阻止白细胞与内皮细胞之间的牢固黏附,防止过度炎症反应对机体的损害,以达到治疗疾病的目的.茯苓酸保护大鼠肠黏膜微血管内皮细胞损伤的模型剂量为10 mg/L.     

SLT-Ⅱe对PIMVECs分泌炎症反应相关细胞因子的影响

本试验旨在探究大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）处理后,猪小肠微血管内皮细胞（PIMVECs）分泌的肿瘤坏死因子α（TNF-ɑ）、P选择素（P-selectin）、一氧化氮（NO）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）和内皮素（ET）水平的变化。采用超速离心法提取SLT-Ⅱe,采用BCA试剂盒测定其质量浓度,使用SDS-PAGE及Western blotting验证蛋白纯度;用WST-1法从0.1、0.5、1、5、10 μg/mL SLT-Ⅱe和0、2、4、8、12、24 h中筛选出SLT-Ⅱe对PIMVECs最佳作用浓度与时间;ELISA法检测对照组（0 μg/mL SLT-Ⅱe）和试验组（1 μg/mL SLT-Ⅱe）细胞上清中TNF-ɑ、P-selectin、NO、ICAM-1和ET含量的变化。结果表明：所提蛋白为SLT-Ⅱe,蛋白含量为721.75 μg/mL;1 μg/mL的SLT-Ⅱe作用8 h后可极显著降低PIMVECs的活性（P<0.01）;1 μg/mL的SLT-Ⅱe作用9和12 h时PIMVECs的TNF-ɑ分泌量显著升高（P<0.05）,NO/ET的值显著高于对照组（P<0.05）,作用6、9、12 h时P-selectin的含量显著升高（P<0.05）,作用12 h时的ICAM-1分泌量显著升高（P<0.05）。综上所述,SLT-Ⅱe浓度为1 μg/mL时可以诱导PIMVECs分泌的TNF-ɑ、P-selectin、ICAM-1以及NO/ET上升,为研究仔猪水肿病发病机制提供参考。     

断奶仔猪对毒力基因缺失大肠杆菌的免疫应答

为研究猪水肿病大肠杆菌SLT-Ⅱe编码基因突变菌株作为口服疫苗的免疫效果,本实验用构建的突变菌株(O139/SLT-Ⅱ e/07)口服免疫断奶仔猪后,检测突变菌株在仔猪肠道的定植情况,仔猪血清及粪便中的特异性抗体和细胞因子水平,并进行了免疫保护效力评价.结果显示,免疫后21 d仍能在实验1组(微胶囊口服免疫)和2组(直接口服免疫)的仔猪粪便中检出突变菌株;从免疫后第7 d、14 d和21 d开始,在实验1组血清样品中可分别检测到抗SLT-Ⅱ eA蛋白、F18ab菌毛蛋白和O139抗原的IgG抗体(P/N＞2);从免疫后第7 d、14 d开始,在粪便中可分别检测到抗SLT-Ⅱ eA蛋白、SLT-Ⅱ eB蛋白、O139抗原、F18ab菌毛蛋白的slgA抗体(P/N＞2);免疫仔猪血清中的INF-γ的含量升高;实验2组的血清特异性IgG水平和粪便中sIgA抗体水平比实验1组低;该突变菌株对仔猪具有免疫保护作用.研究结果表明该大肠杆菌基因突变株可作为仔猪水肿病口服疫苗的候选菌株.     

槲皮素对SLT-Ⅱe诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌细胞因子的影响

通过检测槲皮素对SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO、ET-1、P-选凝素、sICAM-1及TNF-α的浓度变化,探索中药复方主要成分槲皮素对仔猪水肿痛的疗效机制.将培养的肠黏膜微血管内皮细胞分为对照组、SLT-Ⅱ e组、不同浓度槲皮素处理组等5个组,采用ELISA法测定了培养3、6、9和12 h时细胞培养上清液中NO、ET-1、P-选凝素、sICAM-1及TNF-α浓度的变化.结果,10 mg/L槲皮素可下调SLT-Ⅱ e诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞NO、ET-1及sICAM-1的分泌,12 h内使NO、ET-1及sICAM-1的分泌浓度接近正常水平;1、5、10 mg/L槲皮素不能下调SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞P-选凝素和TNF-α的分泌.结果表明,槲皮素通过抑制SLT-Ⅱ e诱导肠黏膜微血管内皮细胞NO、ET-1、sICAM-1的过量分泌,缓解肠道微循环障碍,减轻炎症反应,达到治疗水肿病的目的.