甘蔗遗传转化的研究进展

综述了１０ａ来ＰＥＧ、电击，基因枪和农杆菌介导的方法应用于甘蔗遗传转化研究所取得的进展，并对影响甘蔗遗传转化效率的因素和今后的研究方向进行评述和探讨。     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化

综述开展甘蔗基因工程育种工作20多年来,从最初的利用农杆菌介导法研究抗除草剂和抗虫转基因成功,到目前高转化效率的转基因方法应用过程中取得的成果,分析影响农杆菌转化甘蔗的关键因素,并对农杆菌介导的甘蔗遗传转化研究前景作了展望.     

甘蔗遗传改良研究进展

甘蔗属于多年生热带亚热带的大型草本植物,是公认的将光能转化为化学能效率最高的植物之一。甘蔗作为重要的糖料和能源作物,品种改良一直以来都受到人们极大的重视,甘蔗传统育种和品种配套栽培技术大大提高了蔗茎产量和蔗糖分含量。近年来,生物技术的发展与应用为甘蔗遗传改良提供了很大的帮助。为了便于育种人员充分了解甘蔗遗传改良的研究进展,针对甘蔗常规育种、基因组学、转基因技术及分子标记辅助育种等研究方向进行了阐述。     

农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。     

抗生素G418在甘蔗组织培养中的最佳筛选浓度

本试验在农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室建立的甘蔗再生体系的基础上,在甘蔗愈伤组织培养的不同阶段,分别加入不同质量浓度的G418选择性试剂,以确定用于甘蔗遗传转化筛选的最适浓度.结果表明,G418对各供试甘蔗愈伤组织的抑制作用相似,愈伤组织生长、分化、生根3个阶段的抗性筛选质量浓度分别为20-35、15-35和25 mg.L-1.     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

甘蔗抗虫转基因研究进展

甘蔗是世界最重要的糖料作物,但日益严重的虫害给甘蔗产量及品质造成了重大损失.目前甘蔗抗虫转基因育种已成为甘蔗抗虫育种最有效的途径之一.近年来,美国、澳大利亚、巴西、南非、古巴、泰国、印度、新加坡、中国及一些国际大型公司等都相继开展了甘蔗抗虫转基因研究,主要集中于转Bt基因、GNA基因、PI基因等甘蔗材料的筛选,并获得一批抗蔗茎螟的CryIA(b)转化植株、抗Chilo infuscatellus的转Cry1Ab基因甘蔗植株、抗绵蚜的转CNA基因甘蔗植株、抗甘蔗白螟的转PI基因甘蔗植株、抑制蛴螬幼虫生长的转PiⅡ和GNA基因甘蔗无性系G87、UP87及600多份转cry1C*基因甘蔗无性系,部分学者还对转Bt基因甘蔗植株的生理、抗虫性和农艺性状进行了研究.由于抗虫转基因甘蔗研究起步晚,受抗虫基因来源及知识产权保护等方面的限制,其研究进展缓慢,目前尚未培育出优良的甘蔗抗虫品种并推广种植.今后需对外源基因在转基因甘蔗无性后代中的整合、遗传表达特性及甲基化修饰等影响表达的各种因素进行综合研究,提高外源基因在甘蔗无性繁殖中遗传和表达的稳定性;此外,还需对抗虫转基因甘蔗的抗虫机理进行系统、深入的研究,为筛选出优良的、稳定遗传的抗虫甘蔗品种并在生产中推广应用提供理论依据和育种材料.     

甘露糖对甘蔗外植体再生的影响

在甘蔗外植体再生体系的基础上,在甘蔗愈伤组织继代、胚性愈伤组织芽分化以及幼芽生根阶段的培养基中附加甘露糖,研究甘露糖对甘蔗外植体再生的影响,以确定用于甘蔗遗传转化筛选的最适浓度.结果表明,甘露糖对甘蔗茎尖愈伤组织诱导、愈伤分化和幼芽根形成均产生抑制作用.愈伤组织生长、分化、生根3个阶段的抗性筛选浓度分别为3-5、4-5和3 g.L-1.     

甘蔗叶绿体基因组研究进展

随着现代分子生物学技术的发展,目前已经完成了多种植物叶绿体基因组的全序列测定,并研究了这些基因的结构、功能与表达.大部分高等植物的叶绿体基因组结构稳定,基因数量、排列顺序及组成上具有保守性.随着甘蔗叶绿体基因组测序工作的完成,为甘蔗叶绿体相关研究奠定了良好基础.文章从甘蔗叶绿体基因组图谱、结构和功能基因、叶绿体RNA编辑以及甘蔗属叶绿体系统进化等方面综合概述了甘蔗叶绿体基因组研究取得的成果,并从甘蔗叶绿体遗传转化、甘蔗及近缘属叶绿体基因组测序和叶绿体基因组cpSSRs开发利用等方面指出甘蔗叶绿体基因组今后的研究方向.     

蚜虫种下体色变化机理研究

在阅读大量有关文献的基础上,就目前研究最多的烟蚜MyzuspersicaeSulzer和棉蚜AphisgossypiiGlover体色变化的机理做了探讨,并且认为,烟蚜体色分化主要是基因控制的结果,同时寄主植物及环境因素也存在一定影响;而棉蚜体色变化仅与温度密切相关,属同一基因型在不同环境条件下的反应,与营养、寄主种类、光照、栽培条件等无关。     

美洲黑杨遗传转化系统优化的研究

 研究了影响根癌农杆菌（Agrobaterium tumefaciens Conn）介导的美洲黑杨遗传转化的若干因素,建立了美洲黑杨简单、高效的遗传转化系统,获得了大量转基因植株。结果表明：外植体预培养3d,菌液浓度OD600值为0.4~0.6的农杆菌中侵染20min,共培养3d为最佳遗传转化系统,转化率最高时可达10.0%。同时发现选择带叶柄的叶片作为转化受体,转化频率也有明显提高且不同分化培养基的配方对美洲黑杨的转化效果也有一定影响。     

农杆菌介导的水稻草矮病毒NS6基因的转化

水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)RNA6片段毒义链编码的非结构蛋白NS6,与病害症状密切相关,被称为病害特异蛋白.因此,应用农杆菌介导法,选取对RGSV表现不同抗性的台农67、中花6号、中花12号、中花15号、台中1号、合系28和063817个水稻品种,以其未成熟胚或成熟胚预培养4d后,诱导生长旺盛的愈伤组织为外植体,将NS6基因导入其中,对影响水稻再生及农杆菌转化的主要因素进行了比较研究,并获得了转NS6基因工程植株.结果表明,以未成熟胚为受体,获得的抗性愈伤组织转化率明显高于成熟胚;水稻不同品种对农杆菌转化反应不同;添加一定浓度乙酰丁香酮和葡萄糖,可提高抗性愈伤组织形成率;选用G418进行抗性筛选能获得转NS6基因再生植株,用卡那霉素筛选产生的愈伤组织则未能获得再生植株.     

农杆菌介导的紫穗槐茎段愈伤组织遗传转化研究

采用农杆菌介导法对紫穗槐茎段诱导的愈伤组织进行遗传转化研究。确定了卡那霉素临界耐受浓度为40mg/L。菌液浓度与侵染时间的正交试验结果表明:侵染菌液OD600为0.8、侵染时间为30min时转化效率最高,达17.95%。GUS染色检测分析表明:含pBI121-GUS质粒DNA农杆菌侵染转化的愈伤组织其抗性不定芽和再生植株根和叶均呈蓝色。转化植株叶PCR检测结果表明外源GUS基因已整合到紫穗槐基因组中。以上结果表明建立了以茎段诱导愈伤组织为转化受体、农杆菌介导的紫穗槐高效遗传转化体系。为了验证其可重复性,又进行了pBI121-GFP基因的转化,T0代再生植株PCR检测整合率达85%,在488nm蓝光源激发下转化株的顶芽产生绿色荧光,说明转入的基因在35S启动子下过量表达。此遗传转化体系可应用于转基因育种。     

农杆菌介导转录因子DREB1C基因转化速生型刺槐的研究

引自匈牙利的刺槐是可用于观赏、水土保持、饲料和蜂源的速生型树种，向这个树种转入耐逆基因，可满足干旱、盐碱地植被恢复的需求.该文对速生型刺槐进行了3个方面的研究:在含有不同组合6-BA和NAA的MS培养基上的芽再生情况、根癌农杆菌介导GUS（载体为pCAMBIA 1301）基因转化的优化以及耐逆转录因子基因AtDREB1C（相同载体）的转化.结果表明:①以无菌苗复叶叶轴为外植体，在附加6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L的MS培养基上芽再生率最高，为77.5%；②同样的外植体在MS培养基上预培养0～2 d后, 用附加乙酰丁香酮的根癌农杆菌菌液侵染15～20 min，再接种于附加20 mg/L乙酰丁香酮和Hyg 7mg/L的上述MS培养基上，共培养2 d，可获得最佳转化效果；③用上述优化的方法将AtDREB1C导入刺槐，获得转基因植株，并得到PCR、PCRSouthern blotting和Southern blotting的验证.      

PBI121/GPAT质粒的构建及对非洲菊转化*

 为提高植物抗寒性,本文构建一个植物表达载体,并对非洲菊进行转化。用已克隆的强抗冷植物兵豆的甘油-3-磷酸转酰酶（GPAT）基因构建表达载体,将GPAT插入表达载体pBI121质粒取代该质粒上原有的GUS基因,并用PCR和酶切进行鉴定。用农杆菌介导的方法将该质粒转化到非洲菊中。结果表明该植物表达载体构建成功,同时对非洲菊高效转化体系进行探索,获得卡那霉素抗性苗7苗。     

山新杨叶片高频率植株再生体系建立及其遗传稳定性

建立杨树高效的植株再生体系是采用生物技术手段对其进行遗传改良的基础和前提。该研究以山新杨无菌苗叶片为外植体材料,通过对附加不同浓度BA和NAA的MS培养基的筛选,建立了不定芽的高频再生体系,其再生率、生根率及移栽成活率均达到100%。在此基础上,确定了不定芽再生和生根的卡那霉素选择压。对再生苗的RAPD分析结果表明,该再生体系基本能够保持原有供体植株的遗传基础,可以应用于试管苗快速无性繁殖及遗传转化。      

银杏光合生理生态特性研究

该文于2006年5—10月,利用Li-6400便携式光合作用测定系统对北京市植物园银杏的生理生态特性进行研究,探讨银杏叶片光合作用和蒸腾作用的动态规律,并揭示其主要影响机理。结果表明:银杏叶片净光合速率在5—9月份呈典型的双峰曲线,有明显的“光合午休”现象,并在6月份出现年光合速率最大值;10月份光合速率呈单峰曲线。从整个生长季来看,光合有效辐射（PAR）、气孔导度（Gs）分别是影响叶片净光合速率（Pn）最重要的环境因子和生理因子。在5—9月份银杏蒸腾速率（Tr）日变化呈现双峰曲线,10月份呈单峰曲线;整个生长季（5—10月份）Tr与PAR、叶片大气水汽压亏缺（VpdL）、气孔限制值（Ls）的相关性均比较显著,说明叶片VpdL、Ls和PAR是影响银杏叶片蒸腾速率的主要因子。      

辣椒遗传多样性的RAPD分析

利用RAPD标记对从国内外收集的灯笼椒、长椒、圆锥椒和簇生椒等1年生辣椒(CapsicumannuumL.)自交系和杂交组合的遗传多样性进行了研究.采用14个随机引物、22个参试材料共扩增出1258条带,其中多态条带比率(PPB)接近50%,表明供试辣椒之间的遗传基础较窄.D=0.69时,聚类分析将供试材料分为3类:灯笼椒,圆锥椒,第三类包括簇生椒(朝天椒)和长辣椒(牛角椒);D=0.75时,供试材料分成4类,将簇生椒和长辣椒区分开来;D=0.77时,进一步区分长椒的杂种一代和自交系.聚类分析结果表明,4个辣椒变种中,簇生椒与长椒亲缘关系较近,与圆锥椒次之,与灯笼椒最远.     

短穗竹上一种异香柱菌的形态学及分子鉴定

竹丛枝病可由多种病原引起,竹生香柱菌即是其中的一类,包括竹香柱菌（Epichlo bambusae）和箬竹香柱菌（Epichlo sasae）两种。日本学者Tanaka 根据形态结合分子的研究结果,将其更名为箣竹异香柱菌（Heteroepichlo bambusae）和箬竹异香柱菌（Heteroepichlo sasae）。该文作者于2007年5月底从安徽省广德县的短穗竹上采集到1种异香柱型丛枝病标本,对其病原菌的形态学和培养特征进行观察描述,并利用ITS rDNA序列对其系统发育学进行分析,最终确定该菌为箬竹异香柱菌,而不是先前认为的箣竹异香柱菌。鉴于国内有关其他寄主上的竹生异香柱菌的描述模糊,并且绘图非常简单,因此建议对我国竹生的异香柱菌形态学和寄主范围进行研究,特别是利用分子生物学手段确定它们的分类学地位。