H7N9禽流感病毒纳米荧光颗粒试纸条的研制

为建立一种快速、敏感的H7N9禽流感病毒检测方法,以荧光纳米颗粒为标记物,采用免疫层析法制备H7N9荧光纳米颗粒试纸条,通过紫外灯下观察试纸条上的荧光信号来进行结果判定。结果表明:用制备的荧光纳米颗粒试纸条检测多个亚型禽流感病毒,只有H7N9禽流感病毒结果呈阳性,证实该试纸条具有较好的特异性;用该荧光试纸条与国家标准禽流感RT-PCR方法同时对200份样品进行检测,符合率达到935%。本试验研制的纳米颗粒荧光试纸条可用于H7N9禽流感病毒现场快速检测,具有广阔的应用前景。     

胶体金免疫层析法快速测定动物源食品中的呋喃唑酮代谢物残留

本研究从优化呋喃唑酮代谢物免疫抗原、包被抗原的结构及优化偶联技术角度出发,提高呋喃唑酮抗体的特异性、亲和力,并通过优化样品前处理步骤,最终得到呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条的检测低限为1.0μg/kg,特异性好,稳定性高。     

莱克多巴胺胶体金免疫层析法快速检测试纸条的研制

为研制一种快速、简便的基于胶体金免疫层析法的试纸条,快速检测猪尿中莱克多巴胺（ractopamine,RAC药物残留）,采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记莱克多巴胺单克隆抗体并喷于玻璃纤维上制备胶金垫,RAC-BSA偶联抗原和羊抗鼠IgG分别结合于硝酸纤维膜上,依次将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装并切割成莱克多巴胺胶体金免疫层析快速检测试纸条。试验结果表明该快速检测试纸条的检测限为5 ng/mL,可在8~10 min内完成测试,肉眼即可判断,无需其他检测设备。该试纸条灵敏度、特异性、稳定性和重复性均达到临床使用要求,适用于现场快速检测和筛选工作。     

免疫层析法快速检测金黄色葡萄球菌的研究

为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌的新方法,本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,用胶体金标记鼠抗金黄色葡萄球菌凝集因子A(C1fA)重组蛋白特异性抗体,从抗金黄色葡萄球茵IgG包被于硝酸纤维素膜,制成免疫层析快速检测试纸条.该方法可以在10min内完成对含金黄色葡萄球菌奶样的检测;敏感度为1×104 cfu/mL以上,与PCR方法进行对比检测,相差一个数量级;与大肠杆菌、链球菌、李氏杆菌、巴氏杆茵及蜡样芽孢杆菌均无交叉;稳定性和重复性较好.该试纸条检测金黄色葡萄球菌临床样品表明其具有特异性好,灵敏度较高的特点.     

基于重组致密颗粒蛋白11的弓形虫胶体金免疫层析检测方法的建立

将弓形虫致密颗粒蛋白11(GRA11)部分基因片段插入pET32a(+)载体,构建原核表达载体pET-32a(+)-GRA11,并转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot对诱导表达的重组蛋白GRA11(rGRA11)进行反应原性鉴定.以rGRA11为检测线,兔抗犬...     

禽流感病毒荧光免疫层析检测试纸条的研制

禽流感是重要的人兽共患病,建立现场快速灵敏的检测方法是防控其发生和流行的前提和基础。本研究采用不同亚型流感毒株交叉免疫小鼠法来免疫小鼠,通过多个亚型的NP表达蛋白来筛选杂交瘤阳性细胞株,获得分泌针对NP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞4株。通过抗体的两两配对,基于荧光量子点作为免疫层析抗体的标记探针,借助免疫层析试纸条双抗夹心法原理,筛选出了适用于免疫层析的两株单克隆抗体,研制了禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV )荧光免疫层析检测试纸条[A lateral-flow immunoassay strip with quantum dots(QDs)against AIV , AIV -QD-LFIA],并对该试纸条进行了特异性、敏感性、可重复性及可靠性分析。试验结果显示:本研究所建立的 AIV -QD-LFIA试纸条检测禽流感标准抗原H5N1-HK的敏感性达到104 EID50 ,检测标准抗原H9N2-HK的灵敏度为102 EID50 ,比商品化的禽流感病毒抗原检测卡灵敏度高100倍,比国家标准实时荧光RT-PCR(rRT-PCR)灵敏度低约100倍;可特异性地检测出H5亚型、H7亚型、H9亚型、H1亚型、H3亚型等A型流感病毒,与 IBV 、 NDV 等常见禽呼吸道传染病病原无交叉反应,且经过了国家流感中心标准样本盘的样品测试,特异性强;同时该法具有良好重复性,连续4周检测20个样品重复结果均为阳性;小规模田间试验显示该法用于禽流感病毒的普查监测结果可靠。可见本研究所建立的 AIV -QD-LFIA试纸条可满足禽流感病毒快速、高灵敏的检测需求,具有广阔的应用空间。     

快速检测牛奶中泰乐菌素残留的荧光微球免疫层析方法的建立

本研究旨在研制一种快速检测牛奶中泰乐菌素残留的荧光微球免疫层析试纸条。将包被抗原(0.80 mg/mL)和羊抗鼠IgG(1.01 mg/mL)喷涂在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质检线。对制备荧光微球抗体免疫复合物(免疫探针)的工艺参数做了一系列的优化,同时比较了不同标记方法对标记效率及稳定性的影响。结果表明,在pH值为6.0的最佳缓冲体系条件下,催化剂碳化二亚胺(EDC)用量为5μg,抗体100倍稀释添加20μL,检测时间低于25 min,检测限为25μg/L。本试验研制的荧光微球免疫层析试纸条具有简便快速、特异性良好、样本无需前处理等特点,可用于基层奶站和现场快速筛选。     

免疫胶体金法检测磺胺甲噁唑残留的研究

应用胶体金免疫层析技术（GICA）进行磺胺甲嗯唑（SMZ）的残留检测研究。制备抗磺胺甲嗯唑多克隆抗体，并采用柠檬酸三钠法制备20nm胶体金颗粒。胶体金标记多抗后喷涂到玻璃纤维膜上，特异性抗原（SMZ-OVA）以线状包被在硝酸纤维素膜上，制成快速检测试纸条。滴加检测溶液后，若呈现一条红色条带则为阴性，无红色条带则为阳性。该方法对SMZ标准溶液的灵敏度达到50ng／mL，试纸条显色结果清晰，反应灵敏，整个检测反应在5～10min内完成，稳定性及重复性良好。     

猪流行性腹泻病毒时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立

为建立一种快速、定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)时间分辨荧光免疫层析检测方法(TRFIA),本研究采用杂交瘤技术制备了抗PEDV N蛋白特异性单克隆抗体(MAb)5E6和1B7,将MAb 5E6与荧光微球偶联包被结合垫,将MAb 1B7和兔抗鼠IgG抗体分别包被硝酸纤维素膜作为检测线和质控线制备PEDV荧光微球免疫...     

应用胶体金免疫层析法检测动物组织中呋喃西林代谢物的残留

本文应用胶体金免疫层析法检测动物组织中残留的呋喃西林代谢物。结果表明,试纸条检测限为1.0μg/kg,假阳性率小于5%,假阴性率为0;对其他药物无交叉反应,特异性较好;对实际样品检测结果与LC-MS/MS法检测结果一致。可见胶体金试纸条法具有操作简便、快速、直观的特点,可作为筛选法对样品进行现场快速筛查。     

荧光微球免疫层析法快速检测鸡饲料中喹乙醇的含量

为更灵敏地进行全价鸡饲料中喹乙醇(OLA)含量的快速检测,本研究将新型标记物荧光微球与喹乙醇单克隆抗体偶联,以该复合物为检测试剂制备荧光微球免疫层析试纸条,在肉眼检测的同时,将该装置与荧光微球定量侧向层析读数仪联合使用,可进行全价鸡饲料中喹乙醇含量的定量快速检测。研究结果证明,饲料中喹乙醇的定性和定量检测限分别为100μg/kg和0.51μg/kg,IC_(50)值为1.89 ng/m L,定量检测回收率为78.71%~90.83%。该试纸条特异性强、准确性高,保存期长。定量检测只需18 min左右,肉眼检测需38 min左右,与相同抗原和抗体制备的胶体金试纸条相比,该方法可大大提高灵敏度。     

Preparation and Properties Analysis of Clenbuterol Fluorescent Immunochromatographic Strip

This study was aimed to prepare excellent fluorescence immunochromatographic strip for clenbuterol (CLB) which could achieve the purpose of rapid and quantitative detection and laid a foundation for its industrialization.The strip was prepared through single factor experiments using latex particles as a fluorescent label.The preparation process was optimized with CLB concentration,drying time,mixing reaction time,reaction temperature and chromatography time.And the properties of this strip including detection limit,specificity,clinical accuracy and added recovery,degree of precision and stability were investigated.Optimum modification conditions were shown as following:CLB concentration was 2.0 mg/mL,drying time was 5 d,mixing reaction time was 1 min,reaction temperature was 25 ℃,chromatography time was 15 min.The detection limit was up to 0.35 μg/L and the cross rate between CLB and other eight similar drugs were less than 0.8% which demonstrated the good specificity.The added recoveries of each batch were between 80% and 120% which met the requirements.The coefficient of variation (CV) under different concentrations of CLB was less than 5% which met the precision standard.Besides,the stability of the experiment also showed that the test strip had good stability.     

克伦特罗荧光免疫层析试纸条的制备及特性研究

本研究旨在制备性能优异的克伦特罗(clenbuterol,CLB)荧光免疫层析快速定量检测试纸条,为实现其产业化应用奠定基础。采用荧光胶乳微粒为标记物,以抗原包被浓度、膜干燥时间、混匀反应时间、反应温度及层析时间为单因素优化制备了CLB荧光免疫层析试纸条,并对该试纸条的检测限、特异性、临床准确度及添加回收率、精密度和稳定性进行了评价。最佳制备条件:抗原包被浓度2.0 mg/mL,膜干燥时间5 d,混匀反应时间1 min,反应温度25 ℃,层析时间15 min。评价结果显示,试纸条检测限可达0.35 μg/L;CLB与其他8种同类药物交叉反应率均小于0.8%,特异性良好;各批添加回收率在80%~120%之间,准确度达到要求;不同CLB浓度下变异系数(CV)均小于5%,符合精密度标准;此外,稳定性试验验证了该试纸条稳定性良好。     

猪支原体肺炎LAMP-LFD快速检测方法的建立及初步应用

旨在采用环介导等温扩增（LAMP）和横向流动试纸条（LFD）相结合的方法,建立一种快速、特异,过程可视化的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）检测方法。针对猪肺炎支原体（Mhp）P36基因设计5套特异性引物和1条异硫氰酸荧光素（FITC）标记的探针,进行LAMP扩增反应。将生物素标记的LAMP产物与FITC标记的探针进行特异性杂交,并使用横向流动试纸条完成扩增产物的检测。经优化,LAMP最佳反应条件为65℃,反应15 min,从基因组DNA提取到LFD结果判断只需40 min左右,比常规PCR技术缩短近2 h。LAMP-LFD可特异性地检出猪肺炎支原体（Mhp）,对猪鼻支原体（Mhr）及猪圆环病毒（PCV）等常见猪病病原的检测结果为阴性。灵敏性试验表明,LAMP-LFD对Mhp的检测灵敏度为1×10⁰个拷贝DNA,是普通PCR的1 000倍。利用本方法可从采集的88份临床疑似病料样品中检测到64份阳性,国标PCR方法可检测到56份阳性,符合率可达90.9%。综上,本研究建立的LAMP-LFD方法可特异、准确地应用于Mhp的检测,而且灵敏度高、操作简单、仪器设备依赖性低、检测成本低、耗时短,适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用,具有较高的推广价值,有望发展成为Mhp快速检测的有效手段。     

犬狂犬病毒抗体胶体金检测试纸卡的研制

为快速检测犬狂犬病毒IgG抗体,应用狂犬病毒G蛋白作为捕获抗原,鼠抗狂犬病毒G蛋白单克隆抗体和羊抗犬IgG分别作为胶体金标记物和诊断抗体,羊抗鼠IgG作为质控线,制备胶体金免疫层析抗体检测试纸。该试纸卡具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,与快速荧光灶抑制实验检测值对比总符合率为82.1%。研究显示,本试纸卡能够快速、准确检测犬狂犬病毒IgG抗体,可为临床诊断和宠物犬狂犬疫苗免疫效果的评价提供参考。     

半定量检测新城疫抗体胶体金试纸条的研制

为建立半定量快速检测新城疫抗体方法，本研究利用柠檬酸钠还原氯金酸，形成胶体金颗粒，应用直径20nm的胶体金颗粒标记新城疫抗原，制作了半定量快速测定新城疫抗体的免疫胶体金试纸条。用试纸条检测60份样品，检测结果与血凝抑制试验（HI）法测得结果的符合率为93．8％，最小检测HI滴度为410g2，与其他病毒的阳性血清没有交叉反应，且室温下有效保存期为3个月。试纸条应用方便、快速，适合临床推广以及流行病学调查。     

猪δ冠状病毒胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种方便、快捷、实用的检测猪δ 冠状病毒(PDCoV)方法,本研究利用原核表达猪δ 冠状病毒N 蛋白,以纯化的N 蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞技术研制2株分泌PDCoV N 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为E8、A10。2株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体敏感性及特异性良好,E8亚类为IgG2a,A10亚类为IgG1。以E8作为金标抗体,A10作为检测抗体,兔抗鼠作为质控线抗体,制备猪δ 冠状病毒胶体金检测试纸条,检测猪δ 冠状病毒敏感性为100TCID50,检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪δ 冠状病毒阴性对照均为阴性。本研究建立的胶体金试纸条检测方法敏感性及特异性良好。该检测方法的建立,为猪δ 冠状病毒(PDCoV)流行病学调查提供一种方法,同时为规模化养殖集团及基层兽医组织提供一种检测猪δ 冠状病毒产品。     

3种β2-受体激动剂荧光免疫层析试纸条的制备及特性研究

本研究旨在制备性能优异的克伦特罗（clenbuterol,CLB）、莱克多巴胺（ractopamine,RAC）和沙丁胺醇（salbutamol,SAL）荧光免疫层析快速定量检测试纸条,并对该试纸条的检测范围、检测限、准确度、精确度、假阳性、假阴性及其与仪器方法的符合率进行评价。结果显示,克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇试纸条标准曲线范围分别为0~3.2、0~6.4、0~8.0 μg/L;克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇试纸条检测下限分别可达0.2、0.4和0.5 μg/L;克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇与其他8种同类药物交叉反应均成阴性,特异性良好;各批添加回收率在60%~120%之间,准确度达到要求;不同克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇浓度下变异系数（CV）均小于15%,符合精密度标准;猪尿中假阳性率和假阴性率均为0;此外与仪器方法的符合率为100%。试纸条适用于猪尿中克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺残留快速检测,具有灵敏度高、稳定性好和特异性强的特点。     

J亚群禽白血病病毒的免疫荧光检测效果

应用特异性抗J亚群禽白血病病毒（ALV－J）的单克隆抗体JE9建立了免疫荧光检测ALV－J抗原和抗体的方法。结果表明，在ALV－JADOL－Hcl感染鸡胚成纤维细胞（CFF）24小时后，可以用1FA检测出阳性细胞，感染72小时后，可以检测出最小病毒感染量≥1．25TCID50／孔。对人工感染ALV－J鸡肾脏冰冻切片检测结果证明，免疫荧光法可以检测出组织中的ALV－J抗原，表现强阳性反应。用重组病毒rBac4817－env感染的Sf9细胞作抗原，可以检测出鸡血清中抗ALV－J的特异性抗体。该方法在ALV－J的控制中必将产生重要作用。