参薯金属硫蛋白基因DaMT2a的克隆与表达分析

金属硫蛋白属于一类富含半胱氨酸,能够与重金属离子结合的低分子量蛋白质,在植物抗逆过程中起着重要作用。本研究从参薯中克隆了一个金属硫蛋白基因,命名为DaMT2a (与金属硫蛋白MT2a同源),序列分析显示克隆获得的金属硫蛋白基因的c DNA长度为540 bp,包含了3个外显子和2个内含子,编码79个氨基酸,具有金属硫蛋白基因家族的保守结构域。进化树分析表明DaMT2a属于金属硫蛋白Type2类成员。利用实时荧光定量PCR技术研究了其在正常组织及胁迫条件下的表达特性。结果表明DaMT2a主要在参薯的茎和雄花中大量表达,机械伤害可显著上调DaMT2a基因表达,高温处理则明显下调DaMT2a基因表达,乙烯利和脱落酸处理上调DaMT2a基因的表达。本研究为参薯抗逆相关金属硫蛋白基因的筛选和功能鉴定提供了参考依据。     

木薯金属硫蛋白基因的克隆和表达分析

金属硫蛋白(metallothionein,MT)分子量小,半胱氨酸含量高,具有消除离子自由基,减弱重金属毒性和减少体内活性氧积累等功能。为探究木薯金属硫蛋白基因(MeMT)的原核表达能力和对活性氧的耐受性,本研究通过木薯cDNA克隆获取MeMT并将其连接至pET-28a,在BL21(DE3)菌株中成功诱导其表达。H2O2耐受性分析发现,与空载菌株相比,表达MeMT蛋白的DE3菌株对H2O2的耐受水平较高。RT-qPCR技术检测显示,在H2O2胁迫下,3 h时木薯叶片中MeMT的表达水平明显升高,但6 h时恢复甚至略低于对照组,证明MeMT在木薯中参与ROS应答过程。该结果对研究木薯抗逆性和产量的提高具有重要意义。     

金属硫蛋白的研究进展

金属硫蛋白是一种低分子量,富含半胱氨酸可结合重金属的蛋白质,它广泛存在于人体、动物、植物以及微生物体内,且理化性质基本一致。它可被不良刺激、金属、激素等诱导合成。近年来随着越来越多的金属硫蛋白基因被克隆及金属硫蛋白分离纯化技术的改进,对金属硫蛋白的研究日益深入,很多实验表明,金属硫蛋白参与体内微量元素的储存、转运和代谢,拮抗电离辐射,清除自由基以及对重金属的解毒作用,还与机体生长发育、延缓衰老及某些疾病有关。目前,动物金属硫蛋白由于发现较早,研究深入,而植物金属硫蛋白发现相对较晚,进展缓慢。本文对植物和动物金属硫蛋白的分类、特性、基因结构及调控、功能做了阐述,并对金属硫蛋白在医学、环境、食品、化妆品领域的应用前景做了介绍。     

铜、锌离子影响丹参金属硫蛋白MT2基因表达

植物金属硫蛋白在金属离子的储存、运输和代谢及降低重金属离子的毒性等方面起着重要作用本文研究了Cu2 、Zn2 对丹参毛状根中金属硫蛋白基因表达的影响.以6,7-V为液体培养基,分别以缺乏正常及原培养基100、500、1 000倍的cu2 、Zn2 处理,采用半定量PCR法检测不同时间点时金属硫蛋基因的表达情况.结果发现Cu2 、Zn2 诱导金属硫蛋基因的表达量分别在100倍处理量时的9 h和6 d达到峰值Cu2 、Zn2 能显著诱导丹参金属硫蛋白基因的表达,该基因可能在丹参对铜、锌元素的吸收方面发挥着重要的作用.     

甘蔗热带种金属硫蛋白家族基因的克隆及响应重金属胁迫的表达分析

金属硫蛋白是一类富含巯基的低分子量蛋白,在植物的重金属解毒及细胞氧化还原调控等方面起重要的作用。本研究以甘蔗热带种Badila组培苗为材料,分别测定了其在CdCl2、ZnSO4和CuCl2水溶液培养条件下地上部和地下部的重金属含量,结果显示其对上述3种重金属有较强的耐受与富集能力。继而克隆了ScMT1(登录号为KJ504373)、ScMT2-1-5 (登录号为MH191346)和ScMT3 (登录号为KJ5043704) 3个金属硫蛋白家族基因,它们分别属于植物MT亚家族中的MT1、MT2和MT3型基因。ScMT1含有1个内含子和2个外显子,开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)长228 bp,编码75个氨基酸; ScMT2-1-5含有2个内含子和3个外显子, ORF长246 bp,编码81个氨基酸; ScMT3含有1个内含子和2个外显子, ORF长198 bp,编码65个氨基酸。RT-qPCR显示, Cd2+胁迫下,在甘蔗地上部和地下部, ScMT2-1-5均连续显著上调表达,而ScMT1的上调应答出现延迟。ScMT3在地上部的上调应答出现延迟,在地下部呈"扬–...     

疣粒野生稻金属硫蛋白(OMMT-2)基因的获得及序列分析

从疣粒野生稻叶片cDNA文库中分离出1个金属硫蛋白基因的cDNA序列,命名为OMMT-2。该基因全长532bp,其中5’非翻译区为111bp,3’非翻译区171bp,开放阅读框长249bp,编码82个氨基酸,该蛋白的分子量为7775.9,理论等电点为6.49;基因编码的氨基酸含有14个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的17.07%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC和CXXC排列方式。疏水性分析表明,该蛋白在43~56个氨基酸之间有较强的疏水区。通过氨基酸序列分析表明,金属硫蛋白中半胱氨酸的位置和数目有较强的保守性,揭示了半胱氨酸对金属硫蛋白的功能十分重要。     

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础。试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(EDTA-Fe2＋,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2＋,40 μmol/L)的根的总RNA,经过LD-PCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库。用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300~800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果。     

新型功能性食品添加剂——金属硫蛋白

根据结构和来源的不同。金属硫蛋白可以被分为3类：①包括所有来源于脊椎动物的金属硫蛋白。以及具有明显相似一级结构的来自其他门类动物的金属硫蛋白；②包括与哺乳动物无关或关系较远的金属硫蛋白，如海胆、玉米、酵母和一些藻类中的金属硫蛋白；③具有典型的v-谷胧甘肽单位的多肽，是一种较短的非转录合成的金属硫肽。     

小金海棠超氧化物歧化酶基因MxSod2克隆与序列分析

本实验以苹果属植物小金海棠（Malus xiaojinensis Cheng et Jiang）为试材,利用差异筛选消减cDNA文库和RACE相结合的方法,分离到了小金海棠超氧化物歧化酶基因MxSod2（Genbank登录号为 DQ431473）,该基因全长805个碱基,开放阅读框为471bp,编码157个氨基酸,推测分子量15kDa。该基因具有CuZn-SOD基因的典型结构域特征。通过系统进化树分析,小金海棠MxSod2与龙眼、荔枝等非禾本科植物保持了较近的亲缘关系,与花生、水稻、玉米等禾本科植物亲缘关系较远。     

Ipomoea trifida(2X)抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆、序列分析和表达分析

为了从甘薯野生资源中获取抗逆基因,提取Ipomoea trifida组培苗总RNA,经反转录获得第一链c DNA,使用特异引物进行PCR扩增,获得了I.trifida抗坏血酸过氧化物酶编码区序列,并进行生物信息学分析以及组织特异性表达研究。经测序表明,所获得的序列长约769 bp,包含753 bp完整的开放阅读框;生物信息学分析结果表明,此序列编码250个氨基酸,蛋白大小约为27.6 k Da,等电点为5.42,有大范围亲水区,推测在细胞质中起到抗氧化作用;进化发育系统分析表明,It APX和Ib APX最为接近;组织特异性表达分析表明,It APX在各组织中均有表达。I.trifida抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆为甘薯抗逆育种提供了新的基因资源。     

小金海棠缺铁胁迫相关miR394a的克隆与表达分析

为了研究铁高效植物小金海棠的miRNAs信息及在缺铁处理下miRNA的表达变化,以进一步了解小金海棠缺铁分子调控机制。以改良CTAB法提取的总RNA为模板,从小金海棠中分离得到miR394a。通过Real-time PCR检测miR394a的表达,并利用生物信息学方法预测了miR394a的靶基因及其功能。miR394a具有高度保守性,从小金海棠中分离的miR394a与其他物种的miR394a序列高度相似。缺铁胁迫后,小金海棠的miR394a在根及叶中都有表达,但表达模式有所不同,miR394a在根部响应较为迅速,缺铁处理1天时,即有上调表达;而在叶片的响应较晚,缺铁3天时有上调表达。miR394a的靶基因预测表明,miR394a主要调控转录因子及参与代谢途径的基因。结果表明,miR394a受缺铁胁迫所诱导,参与了小金海棠缺铁调控途径,在缺铁调控中起重要作用。     

一个玉米氯离子通道基因(clc)的电子克隆及生物信息学分析

氯离子通道植物生理代谢中起着重要的角色.通过电子克隆的方法获得玉米氯离子通道的cDNA全长序列.发现该基因包括5个外显子和4个内含子,并对其表达产物进行生物信息学分析,其表达产物与拟南芥ATCLC-A,ATCLC-B具有较高的相似性.     

扁桃CBF1基因的克隆与生物信息学分析

为揭示CBF基因在扁桃抗逆机制中发挥的功能,对扁桃CBF1基因进行克隆与分析。以新疆扁桃主栽品种‘鹰嘴’为材料,根据已经报道的CBF1基因序列设计引物,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1基因,命名为YZ-AcCBF1,并已登录GenBank（登录号KJ818900）。经生物信息学分析,该基因开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸,分子式为C₁₁₉₅H₁₈₈₆N₃₄₆O₃₆₈S₁₃,相对分子质量为27.405 kDa,等电点为7.69,半衰期为30 h,脂肪系数为63.72,疏水性平均值为-0.646。对其亚细胞定位、跨膜结构、信号肽及疏水性/亲水性进行分析,表明其定位在细胞核,不存在跨膜结构,为非分泌性亲水蛋白。系统发育分析结果显示其与桃(AGS13699)的亲缘关系最近。二级结构预测显示该蛋白主要由26.86%的α螺旋和58.68%的无规卷曲组成。三维结构预测表明其符合AP2结构域模型特点。

     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝（Ganoderma lucidum）金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3’端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp（包括一个终止密码子）,可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸Ser(S)和丙氨基酸Ala(A),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

苹果属无融合生殖SERKs基因家族的克隆和表达分析

本研究利用同源克隆法以苹果属平邑甜茶和杂种后代叶片为试验材料,克隆得到4个SERK基因家族片段,并分析了SERKs家族基因在平邑甜茶和杂种后代不同器官和组织中的表达情况。研究结果表明:分离获得的4个SERK基因家族片段的氨基酸序列与模式植物拟南芥、烟草等植物的同源性均在84%以上,同时与其他物种的氨基酸序列进行Blast比对都具有较高的同源性;RT-PCR定量分析结果表明SERK1、SERK2、SERK3、SERK4基因主要在生殖器官中表达。因此,推测SERKs基因在平邑甜茶和杂种后代生殖发育过程中起着重要的调控作用。本研究结果为进一步揭示无融合生殖的发生机理奠定了基础。     

青天葵NfD53基因的克隆及生物信息学分析

本研究克隆青天葵NfD53基因并分析其序列特征,可为今后深入研究NfD53蛋白功能及独脚金内酯(SLs)对植物侧枝生长发育的影响提供参考依据.以濒危药用植物青天葵叶片为实验材料,利用RT-PCR及RACE技术克隆获得2条NfD53基因,分别命名为NfD53-1和NfD53-2,应用生物信息学软件分析其序列并进行功能预测.结果 显示:NfD53-1基因全长3523 bp,编码974个氨基酸;NfD53-2全长3916 bp,编码1190个氨基酸.两者等电点分别为:8.34、6.33;亲水性平均数为:-0.250、-0.263;均为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽及切割位点,定位于叶绿体.两蛋白都具有ClpA超家族核心序列,而NfD53-1蛋白还具有ClpC超家族核心序列,并含有3个非特异性位点(ClpA,ClpC和AAA_2),NfD53-2蛋白含有1个ClpA非特异性位点.蛋白的二级结构中均以无规则卷曲占比最高,分别占47.16％和51.21％;其次是α-螺旋,占38.70％和31.69％.系统进化分析表明,NfD53-1与番茄等聚为一支,但氨基酸相似度较低(20.27％),NfD53-2与铁皮石斛聚为一支,同源性较高(66.49％).本研究为后续进一步探讨该基因的功能及SLs在植物生长发育中的作用提供数据参考.