奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种PCR技术,既能快速检测牛传染性鼻气管炎病毒,又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒gG基因的特异性引物,建立PCR方法,对牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株和阳性样本进行扩增,结果均能扩增出一条463 bp的特异性条带;对同属的牛疱疹病毒5型进行扩增,获得651 bp和431 bp两条带;对同属伪狂犬病病毒进行扩增,获得493 bp的条带;而非相关病毒(如猪呼吸与繁殖综合征病毒等),不能扩增出条带。对牛传染性鼻气管炎病毒的检测灵敏度为2×10^-3 PFU/mL。鉴于该方法具有良好的灵敏度和特异性,将在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。     

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列,合成GH-1、GH-2两条引物,分别以IBRV的Barta Nu/67株、IBRVBK125株基因组DNA为模板进行扩增,结果两株IBR病毒DNA均可扩增出362bp的特异性片段;对其同属的伪狂犬病毒（PRV）、火鸡疱疹病毒（HVT）及牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BVDV）进行扩增均未见特异性条带;敏感性检测表明,该法对IBR病毒的检出限量为104.25TCID50/0.1mL.     

小反刍兽疫病毒与产气荚膜梭菌双重RT-PCR检测方法的建立

为实现小反刍兽疫病毒与产气荚膜梭菌的鉴别诊断,采用改良RNA/DNA提取试剂提取动物组织中的细菌DNA和病毒RNA,基于2014年流行的小反刍兽疫病毒N蛋白基因和产气荚膜梭菌α毒素编码基因序列分别设计合成特异性引物,建立双重PCR方法,优化反应条件,并分析方法的灵敏度与特异性。结果表明,所建立的双重PCR检测方法可以同步检测PPRV和产气荚膜梭菌,分别扩增出406bp和272bp大小特异性条带,方法特异性好,检测灵敏度能够分别达到0.001TCID50/mL和10个CFU/mL。     

牛血凝块基因组DNA提取方法的建立

建立了一种牛血凝块基因组DNA提取方法，其过程为机械性粉碎，高盐EDTA处理后用含蛋白酶K和SDS的细胞裂解液消化，苯酚-氯仿抽提，再以本方法抽提的DNA为模板进行PCR扩增，对PCR产物测序，测序结果与抗凝血DNA的PCR产物测序结果比较。结果表明：本方法提取的DNA成功地应用于PCR扩增。     

多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎和赤羽病方法的建立和应用

为满足同时对IBRV和AKAV进行快速诊断的需要,根据牛疱疹病毒1型(BHV 1)gB基因序列和赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:该方法能同时扩增得到2条与试验设计相符的311 bp(I BRV)和392 bp(AKAV)特异性条带;IBRV的灵敏度为0.13 pg/25μL,AKAV的灵敏度为1.04 pg/25μL。本试验方法的建立对于加强进出口牛IBRV和AKAV的检验检疫具有十分重要的意义。     

苯酚/氯仿抽提法提取牛血与鸡血DNA部分条件的比较研究

为了探讨苯酚/氯仿抽提法中加入血液和红细胞裂解液(PBS)的量对DNA提取效果的影响以及找到针对牛血和鸡血最合适的DNA提取条件,试验以安格斯牛和静原鸡为研究对象,采用苯酚/氯仿抽提法提取血液基因组DNA。结果表明:在试验第1步加入200μL鸡血1次,用1 500μL PBS重复裂解2次,可以得到高质量鸡的基因组DNA。当加入鸡血的量过大时,提取的DNA浓度过高且不纯,蛋白质等外源核酸的污染较严重。在试验第1步加入500μL牛血1次,用1 500μL PBS裂解,重复2次,可以得到高质量牛的基因组DNA。苯酚/氯仿抽提法可以节省时间,还可以避免血液的浪费。     

PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成份种类

为防范疯牛病传入我国,有必要鉴别肉骨粉中动物成份的种类。针对牛、羊、猪和鸡四种动物的特异性核苷酸序列,分别选用和设计了四对特异性引物,用试剂盒提取四种动物的肉骨粉或者处理过的肉组织中的DNA,然后进行PCR扩增,所扩增的目的片断大小分别为271bp、199bp、196bp、148bp,运用PCR技术建立了鉴定这四种动物源性成分的方法。结果分别扩增出四种动物的特异性条带,证明该PCR方法具有很高的特异性和敏感性,而且成本低廉,简便易行,因此可以作为鉴别肉骨粉种类的常规方法。     

PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成份种类

为防范疯牛病传入我国，有必要鉴别肉骨粉中动物成份的种类。针对牛、羊、猪和鸡四种动物的特异性核苷酸序列，分别选用和设计了四对特异性引物，用试剂盒提取四种动物的肉骨粉或者处理过的肉组织中的DNA，然后进行PCR扩增，所扩增的目的片断大小分别为271bp、199bp、196bp、148bp，运用PCR技术建立了鉴定这四种动物源性成分的方法。结果分别扩增出四种动物的特异性条带，证明该PCR方法具有很高的特异性和敏感性，而且成本低廉，简便易行，因此可以作为鉴别肉骨粉种类的常规方法。     

温氏附红细胞体PCR检测方法的建立

本研究旨在建立1种快速准确检测温氏附红细胞体感染的分子生物学诊断方法。根据温氏附红细胞体的16S rRNA基因参考序列的保守区,利用软件Primer Premier 5.0设计合成了1对特异性引物,对温氏附红细胞体的基因组DNA进行PCR检测。结果表明,扩增出1段985bp的DNA序列,EcoRⅠ酶切鉴定得到2条500bp左右的条带,与预期结果一致,说明该方法扩增出了温氏附红细胞体的特异性条带。通过敏感性、特异性、重复性和临床样品检测试验证明,该方法具有特异、灵敏、快速的优点。结果提示,所建立的方法具有较高的特异性和灵敏性,可用于牛附红细胞体病诊断和流行情况监测。     

吉林株犬新孢子虫的分离与鉴定

将疑似感染犬新孢子虫而流产的牛胎儿脑组织接种于Vero细胞进行体外培养,同时感染长爪沙鼠进行动物试验.提取牛流产胎儿脑组织DNA、沙鼠脑组织DNA、细胞培养虫体DNA,用犬新孢子虫特异性引物进行PCR扩增.结果显示,PCR扩增出了1条约为681 bp的目的条带;测序结果表明,扩增出的特异性目的基因序列与GenBank中发表的犬新孢子虫NcSAG1基因(AF113004)核苷酸序列的同源性为99.4%.结果表明,在吉林省牛流产胎儿脑组织中分离出犬新孢子虫.