表达PEDV-S1蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建及鉴定

猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起新生仔猪严重腹泻和死亡,给养猪业造成巨大经济损失。根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)调节动物胃肠道菌群平衡的功能和结构特征,选择其作为PEDV S1蛋白表达的宿主菌,构建重组基因工程枯草芽孢杆菌。实验将重组质粒p LA-PEDV-S1电转至枯草芽孢杆菌,提取枯草芽孢杆菌的重组质粒,采用PCR、Western blot和免疫荧光方法鉴定阳性质粒DNA。获得了重组pLA-PEDV-S1/B.Subtilis,S1蛋白成功展示表达在菌体表面,重组PEDV S1蛋白能够和猪源PEDV阳性血清结合,具有反应原性。该重组菌可能成为预防PEDV感染的口服疫苗候选菌株。     

重组牛分支杆菌ESAT-6基因的表达与鉴定

在前期工作的基础上，构建了pGEM—TE—ESAT6重组载体，转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，经诱导表达得到了20kD左右大小的重组蛋白，SDS—PAGE／Western Blot显示该重组蛋白是上清表达。为重组ESAT-6抗原的应用奠定了基础。     

表达羊口疮病毒B2L基因重组腺病毒的构建及鉴定

为构建表达羊口疮病毒(ORFV)B2L基因的重组腺病毒,提取实验室保存的ORFV AH-F10临床分离株的病毒核酸,PCR扩增B2L基因,将其克隆至穿梭载体中,再将重组穿梭质粒pHBAd-ORFV-B2L与骨架载体质粒pHBAdBHGloxΔE1利用脂质体共转染HEK293细胞,转染后48h收获包装成功的重组腺病毒rAd-ORFV-B2L,对rAdORFV-B2L进行病毒滴度测定及遗传稳定性鉴定。结果表明:构建获得的重组腺病毒rAd-ORFV-B2L病毒滴度达到107.9 TCID50·μL~(-1)。Western-blot检测结果表明rAd-ORFV-B2L在体外能够表达B2L蛋白,且能够与ORFV多抗血清发生特异性反应。RT-PCR检测结果表明,连续传代的rAd-ORFV-B2L能够稳定表达外源蛋白B2L。该研究为后续腺病毒疫苗的动物保护试验奠定基础。     

表达犬瘟热病毒融合蛋白基因重组腺病毒的构建与鉴定

利用pVAX1载体的表达元件CMV启动子和poly(A)多聚腺苷酸信号构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因(F)的重组犬腺病毒。首先,利用酶切、连接等实验方法构建了含CDV启动子F蛋白基因表达盒的转移质粒pVAXΔE3LPF。再以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建重组质粒pCAV-2-pVAXLPF,利用脂质体介导方法转染MDCK细胞,转染3次后,细胞出现了典型的犬腺病毒感染样病变。电镜负染和切片观察、酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明,成功构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因的重组犬腺病毒,表达的融合蛋白分子质量为72ku。在MDCK细胞上连续传30代试验表明重组病毒CAV-2-pVAXLPF具有良好的遗传稳定性。     

野生型PTEN基因重组腺病毒表达载体构建的改进及其鉴定

目的为改进构建野生型抑癌基因PTEN重组腺病毒表达载体的方法。方法用抑癌基因PTEN与带有绿色荧光蛋白基因的穿梭载体pAdTrack-CMV重组后转化含腺病毒骨架载体pAdEasy1的E.coliBJ5183(Ad-1 cells),以获得重组腺病毒质粒,经限制酶PacⅠ线性化后,转染293细胞,检测PTEN蛋白的表达,并以Ad-PTEN感染人乳腺癌MCF-7细胞后,测其感染率。结果获得PTEN基因的重组腺病毒表达载体(Ad-PTEN),受Ad-PTEN转染的293细胞发生肿胀或圆缩的形态改变,经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因PTEN,荧光显微镜下能观察到293细胞内有绿色荧光。通过Western blot可检测到293细胞中PTEN蛋白高效表达。Ad-PTEN感染的人乳腺癌MCF-7细胞,感染率达80%~90%。结论PTEN重组腺病毒表达载体可在细菌体内进行同源重组而构建,方法较简便、快速,且生成的病毒滴度高、感染率高。     

水苏糖合成酶基因重组载体的构建及转化农杆菌

以黄瓜叶片中提取的总RNA为模板,经PCR扩增得到长度为1 275bp的基因片断,经过酶切测序之后,将目的基因连接到表达载体,构建成重组质粒。再利用液氮冻融法将表达载体转化农杆菌感受态。     

马MxA基因真核载体表达重组质粒的构建与鉴定

从马外周血单核细胞中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了MxAcDNA.扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pGEMR-T Easy栽体连接,转入大肠杆菌中筛选鉴定重组子.将质粒经酶切鉴定后.把酶切下的目的基因MxA cDNA进一步克隆到真核表达载体pCI-neo中,经PCR及序列鉴定,证实插入栽体pCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列.真核表达重组质粒DCI-neo MxA cDNA的构建成功,为进一步研究马MxA蛋白的抗病毒作用奠定了基础.     

表达鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建与鉴定

[目的]构建表达鹅细小病毒 （GPV） VP3基因的重组腺病毒,为机体免疫试验和免疫效果评价奠定基础.[方法]以重组质粒pcDNA-VP3为模板,以GPV-VP3为目的基因,构建GPV-VP3重组腺病毒载体,通过转染获得能稳定表达GPV-VP3基因的重组腺病毒,通过IFA和Western-blot检测GPV-VP3基因的表达情况.[结果]扩增到的GPV-VP3基因全长为1 605 bp,线性化的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293细胞中瞬时表达GPV-VP3基因,表达蛋白的分子量约为60Ku.[结论]该重组腺病毒的构建将为GPV新型疫苗研发和后期体内试验奠定基础.     

短短芽孢杆菌TetR基因家族的鉴定及表达模式分析

采用生物信息学方法从生防菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)X23全基因组水平鉴定出13个TetR家族基因,将其命名为BbTetR1、…、BbTetR13,对其基本性质、基因结构和高级结构进行分析。结果表明：短短芽孢杆菌TetR家族成员在进化上具有保守性,基因序列长度为477~681 bp,编码的蛋白由168~226 个氨基酸组成,相对分子质量为1.9×104~2.57×104,等电点为4.84~7.77;其基因家族成员可划分为3个亚族,亚族Ⅰ包含5个成员,亚族Ⅱ、亚族Ⅲ各包含4个成员;所有BbTetR蛋白均含有大量α–螺旋,且这些蛋白的空间结构呈现多样化;转录组分析结果表明,不同的BbTetR在短短芽孢杆菌不同生长时期的表达模式和表达量差异显著,BbTetR1、BbTetR5、BbTetR8和BbTetR10在短短芽孢杆菌不同生长阶段均有较高表达,推测其可能发挥更重要的调控作用。     

重组PEDV-S干酪乳杆菌的构建及其表达

猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起猪的呕吐、腹泻及脱水。通过将其S1片段逆转录连接到干酪乳杆菌表面表达载体p LA上,使其表达蛋白,为进一步研究其特性及免疫原性奠定基础。采用TRIzol的方法从PEDV中提取RNA为模板,通过RT-PCR技术获得该病毒的S1片段,然后将该基因连接到载体p LA中并表达。重组菌经过培养表达之后,利用Western blot检测融合蛋白大小约为81 k Da;重组蛋白可被兔源的抗Pgs A血清和鼠源的抗PEDV血清所识别。表明重组干酪乳杆菌成功的表达了融合蛋白。     

人泛素基因原核表达载体构建、表达及鉴定

[目的]构建含人泛素(Ubiquitin,Ub)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]应用PCR扩增人Ub基因片段,插入表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)PLysS,经诱导表达及鉴定。[结果]PCR扩增出约228bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约34000,纯化后鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人Ub蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。     

诺丽ACO基因超量表达及干涉表达载体的构建及鉴定

为构建诺丽ACO基因的超量表达及干涉表达载体,为后期对诺丽进行转基因操作,探究诺丽ACO基因的功能奠定基础。试验前期克隆了诺丽ACO基因的基础上,设计合成了ACO基因的超量表达及干涉表达的引物,采用PCR技术扩增出了目的基因,将扩增出的目的基因分别插入质粒Hellsgate 8、Hellsgate 2,转化大肠杆菌。结果表明:转化大肠杆菌并进行菌落PCR检测,筛选出结果较好的阳性克隆进行测序,测序后与诺丽ACO序列相比较,序列只有几个碱基的差别。取结果较好的超量表达及干涉表达载体质粒电转农杆菌,均能得到清晰而明亮的条带。本课题组利用前期克隆出的ACO基因,试验得到了诺丽ACO基因的超量表达及干涉表达载体质粒。     

鼠疫杆菌YscF抗原基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

为了克隆表达鼠疫耶尔森氏菌的YscF抗原基因,并对其免疫原性进行初步研究,将PCR扩增的YscF基因连接到pMD-18T载体,测序正确后再将YscF基因连接到表达载体PET32a,构建PET32a-YscF重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;诱导表达蛋白采用Ni2+亲和层析法纯化,Western blot检测其免疫原性。结果显示,28 ku的PET32a-YscF融合蛋白能被兔抗鼠的多抗识别,说明表达产物具有良好的抗鼠疫抗原特异性。     

Pyk2激酶区基因重组杆状病毒表达载体的构建及表达

采用PT-PCR扩增Pyk2-kinase基因,定向克隆至转移载体pFastBac HTB,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,转座后利用抗性及蓝白斑筛选阳性克隆获得重组Bacmid/Pyk2-kinase;提取重组杆粒,PCR法鉴定后转染昆虫细胞Sf9包装重组杆状病毒;利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot检测表达情况。最终获得了重组杆状病毒rBac-Pyk2-kinase,实现了Pyk2-kinase在Sf9细胞中的重组表达,其相对分子质量为32 ku,IFA、SDS-PAGE和Western blot检测结果与预期一致。     

重组RNA干扰表达载体的构建与鉴定

干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。本研究以稻纵卷叶螟可溶型海藻糖酶基因(Cm Tre1)为靶标,设计RNAi靶位点并将其命名为Cm Tre1*,在其两端分别添加Bam H I与Spe I酶切位点并进行人工合成,然后经双酶切后与p1301植物表达载体连接,构建重组表达载体p1301-Cm Tre1*。PCR、双酶切和测序鉴定结果证明重组表达载体p1301-Cm Tre1*构建成功,并将其成功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。用含有p1301-Cm Tre1*质粒的农杆菌LBA4404浸染中花11号水稻的愈伤组织,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生,获得26株阳性转基因植株。用取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟作为对照,用实时荧光定量PCR方法分株测定取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因的mRNA表达水平,并检测其体内海藻糖酶活性变化。结果显示,相较于对照组,取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因表达量下降了44.79%,海藻糖酶活力平均下降了14.94%。研究结果表明转基因水稻的RNA干扰效应相当明显,能对取食其叶片的稻纵卷叶螟Cm Tre1基因起到明显的沉默作用。     

表达MDVgB基因重组痘苗病毒的构建及保护性研究

以脂质体转染技术构建了表达鸡马立克氏病毒(MDV)gB基因的重组痘苗病毒(RVV-gB), 表明该病毒在CV-1(猴肾细胞)细胞系内能稳定传代,经腹腔1×106 PFU·羽 -1 将重组病毒、HVT冻干苗及痘苗病毒分别按试验程序,免疫1日龄SPF鸡,并于15日龄以3×10 2PFU·羽-1MDV强毒株GA株攻毒,重组病毒和HVT冻干苗匀获得较高的保护, 结果证明了gB是MDV的宿主保护性抗原.此研究为CTL应答检测奠定了基础.     

含 P43 启动子 aiiA 基因重组枯草芽孢杆菌的构建与表达…

细菌群体可以通过响应N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones, AHLs)激活某些致病基因的表达,而芽胞杆菌可以表达AiiA(Autoinducer inactivation)蛋白降解病原菌的AHLs从而减低损害。为构建外源高效表达AiiA蛋白的工程菌,利用AiiA蛋白降解AHLs分子来防治细菌性植物病害,通过搭桥PCR扩增P43-aiiA联合片段,连接pHY300PLK载体,构建P43-aiiA-C11枯草芽孢杆菌菌株,验证其AiiA酶活。结果成功克隆得到P43-aiiA片段,经鉴定P43-aiiA-pHY300PLK成功转入C11菌株,通过AiiA活性检测,野生菌株组指示菌全部变蓝,3个平行实验组的蓝色指示菌至条状培养基中间变浅,至下端全部为白色菌落,说明实验所构建的P43-aiiA-C11菌株具有高于野生型C11菌株的淬灭酶活性,能明显降解信号分子。与野生型菌株相比,构建菌株P43-aiiA-C11表达产物具有显著降解AHLs的能力,研究结果为推动植物病害防治提供了重要理论基础。     

小鼠CHD5基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠染色质区解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒载体并在NIH3T3细胞中验证其干扰作用.方法:人工合成靶向CHD5的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法插入到穿梭载体pSES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-CHD5siRNA重组质粒,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒Adr-simCHD5,然后感染NIH3T3细胞,用RT-PCR和Western Blot方法检测其对CHD5mRNA和蛋白表达的干扰效果.结果:得到高滴度Adr-CHD5siRNA重组腺病毒,RT-PCR和Western Blot结果表明该重组腺病毒能有效地降低CHD5基因的表达.结论:成功构建Adr-CHD5siRNA重组腺病毒载体,并在NIH3T3细胞上实现CHD5基因表达抑制,为进一步研究CHD5基因功能奠定了基础.     

TAT-Apoptin基因原核表达载体的构建及其表达鉴定

为得到TAT-Apoptin 融合蛋白,以pMD-19T-Apoptin 为模板PCR 扩增出TATApoptin 基因,构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,并对TAT-Apoptin 蛋白进行表达。PCR 和测序表明,成功构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,进一步对其进行蛋白表达,发现该蛋 白能与Apoptin 多抗发生特异性结合。以上结果证明,TAT-Apoptin 基因原核表达载体构建成 功,并能在Rosetta 中进行分泌性表达。     

SARS-CoVS基因重组质粒的构建与瞬时表达

根据GenBank中登录的SARS-COV（BJ01株）基因序列设计引物，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从SARS病毒中扩增得到约3768bp的片段，将其克隆到真核表达质粒pVAX1，鉴定正确后．命名为pVAX1／S。体外转染Hela细胞．间接免疫荧光鉴定S蛋白的表达。构建的重组质粒经酶切及测序鉴定．开放阅读框正确；间接免疫荧光方法鉴定该重组质粒能在Hela细胞中表达。