分枝杆菌中表达重组蛋白的新载体pMSL的构建

为了能够利用耻垢分枝杆菌表达和纯化结核分枝杆菌蛋白,构建了大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pMSL。该质粒包括来源于牛型分枝杆菌hsp60基因启动子序列,目的蛋白插入的克隆位点和用于目的蛋白表达和定位进行跟踪的绿色荧光蛋白质（EGFP）基因,在目的蛋白插入位点和EGFP基因之间整合了凝血酶识别位点,便于融合蛋白纯化后目的蛋白与EGFP分离,在EGFP基因后面融合有6个组氨酸的密码子。结果表明,pMSL质粒能够在耻垢分枝杆菌中有效地表达绿色荧光蛋白,通过6个组氨酸尾,利用Ni—NTA亲和层析柱很好地被纯化。     

共表达EGFP和UreB活载体疫苗的体内外稳定性研究

建立共表达人幽门螺杆菌UreB和绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础.利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的尿素酶编码基因全长片段,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA 73,构建pLA 73-UreB载体,将pLA 73-UreB和pEGFP共转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素和氨苄青霉素双筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测UreB的表达及活性.液体培养菌液在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光.从幽门螺杆菌基因组中扩增出约1 710 bp的基因片段,所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Western blot检测说明幽门螺杆菌的UreB编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性.成功构建了共表达EGFP和幽门螺杆菌UreB基因的耻垢分枝杆菌疫苗,为其在幽门螺杆菌的防治中的应用奠定了研究基础.     

共表达EGFP和UreB活载体疫苗的体内外稳定性研究

建立共表达人幽门螺杆菌UreB和绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。利用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）扩增的幽门螺杆菌的尿素酶编码基因全长片段,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA73,构建pLA73-UreB载体,将pLA73-UreB和pEGFP共转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素和氨苄青霉素双筛选后,柚捉质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测UreB的表达及活性,液体培养菌液在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。从幽门螺杆菌基因组中扩增出约1710bp的基因片段,所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Westernblot检测说明幽门螺杆菌的UreB编码基因在分枝杆菌中获得了表迭并具有良好的免疫原性。成功构建了共表达EGFP和幽门螺杆菌UreB基因的耻垢分枝杆菌疫苗,为其在幽门螺杆菌的防治中的应用奠定了研究基础。     

TetR/AcrR转录因子Ms3469对耻垢分枝杆菌异烟肼抗药性的调控

以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)为研究对象,通过在药物平板上筛选转录因子超表达文库,发现MSMEG_4369(Ms3469)影响耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)对抗结核一线药物异烟肼(Isoniazid,INH)的敏感性。进一步研究发现超表达Ms3469能增强耻垢分枝杆菌的INH抗性;基因保守结构域分析表明Ms3469编码一个TetR/AcrR家族的转录调节蛋白;凝胶迁移率阻滞实验和细菌单杂交实验证明Ms3469能够与自身启动子直接特异结合。     

TetR转录因子Ms2583对分枝杆菌异烟肼敏感性的影响

转录因子在细菌适应胁迫环境中发挥重要作用,但是参与药物胁迫的转录因子还知之甚少。本研究以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)为研究对象,通过在药物平板上筛选转录因子超表达文库,发现MSMEG_2583(Ms2583)影响耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)对抗结核药物异烟肼(Isoniazid,INH)的敏感性。超表达Ms2583使耻垢分枝杆菌对INH的敏感性增强;基因保守结构域分析表明Ms2583编码一个TetR家族的转录调节蛋白;凝胶迁移率阻滞实验和细菌单杂交实验证明Ms2583能够与自身启动子特异结合。     

结核分枝杆菌热休克蛋白70启动子的克隆和测序

根据结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)热休克蛋白70启动子的基因序列设计1对引物,PCR扩增出150 bp的片段后连接到pMD18-T载体上,用重组质粒载体转化大肠杆菌DH5α,PCR鉴定转化菌后进行序列测定。结果表明,该序列与已报道的3株结核分枝杆菌和1株牛型分枝杆菌的相应序列完全同源。该序列可用于构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒载体,启动外源基因在卡介苗菌中的表达。该基因的克隆可为下一步研究开发人和动物以卡介苗为载体的多价活疫苗打下基础。     

结核分枝杆菌保护性抗原TB10.4基因的克隆和真核表达载体的构建

结核分枝杆菌保护性抗原TB10.4属于结核分枝杆菌早期分泌蛋白中的ESAT-6家族,其免疫原性等与ESAT-6相当或者更佳,具有十分重要的研究价值。利用分子生物学技术克隆该基因,并将其与真核表达载体p EGFP-N1连接,构建重组质粒p EGFP-N1-TB10.4,为TB10.4基因疫苗的研究奠定基础。结果表明:成功克隆到TB10.4基因,测序结果与Gen Bank(NP_214802.1)中已发表的TB10.4基因序列同源性为100%。     

绿色荧光蛋白标记穿梭表达载体构建及重组乳酸菌制备

以红霉素耐药性基因/thy A基因双筛选压力大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭表达载体pW425et为基本骨架,将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入该载体,构建GFP标记的穿梭表达载体pW425et-GFP.通过连续的荧光强度检测,验证gfp基因能否在重组菌中得到稳定表达.重组表达质粒pW425et-GFP酶切和PCR鉴定结果与预期片段大小相符,SDS-PAGE显示27 kD的绿色荧光蛋白获得表达,在蓝光的激发下,可见明显的绿色荧光,且荧光稳定性强,连续传代30次仍可见荧光.结果表明已成功构建了GFP标记穿梭表达载体pW425et-GFP,为乳酸菌作为益生生理菌载体进行体内定植规律研究和食品级、疫苗级乳酸菌产品的开发奠定了基础.     

分枝杆菌阿拉伯半乳聚糖生物合成途径研究进展

综述了阿拉伯半乳聚糖生物合成关键基因、合成步骤及其调控因素的研究进展,利用结核分枝杆菌的基因组序列,从比较基因组层面分析了阿拉伯半乳聚糖生物合成的保守性,为利用耻垢分枝杆菌模型筛选阿拉伯半乳聚糖合成过程中潜在的药物作用靶标提供了基础。     

TAT-Apoptin基因原核表达载体的构建及其表达鉴定

为得到TAT-Apoptin 融合蛋白,以pMD-19T-Apoptin 为模板PCR 扩增出TATApoptin 基因,构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,并对TAT-Apoptin 蛋白进行表达。PCR 和测序表明,成功构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,进一步对其进行蛋白表达,发现该蛋 白能与Apoptin 多抗发生特异性结合。以上结果证明,TAT-Apoptin 基因原核表达载体构建成 功,并能在Rosetta 中进行分泌性表达。     

猪瘟兔化弱毒株E~(rns)基因在大肠埃希氏菌中的表达、纯化

将猪瘟兔化弱毒株Erns基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经PCR和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western-Blot检测,结果表明,融合表达蛋白的分子量约为55kD,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45%。表达蛋白与兔抗CSFV多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。利用GST亲和层析柱对Erns融合蛋白进行了纯化。     

人TIMMDC1基因在杆状病毒系统中的表达

旨在杆状病毒系统中表达TIMMDC1/c3orf1(Translocase of inner mitochondrial membrane domain containing l)基因,为其应用和功能研究奠定基础.将TIMMDC1基因克隆至重组杆状病毒表达系统的载体中,构建重组穿梭质粒,转染Bm-N细胞,Western blotting验证蛋白的表达.结果表明,重组克隆质粒pFastBac 1-GFP-TIMMDC1的两两酶切结果证实重组克隆质粒构建正确.PCR结果显示重组穿梭质粒Bacmid pFastBac1+ TIMMDC1+GFP可扩增出目的条带.Bm-N-rBacTIMMDC1的表达产物经Westem blotting分析,分别可见相对分子质量57kD的特异蛋白条带,表明融合蛋白TIMMDC1 +GFP在家蚕Bm细胞中成功的进行了表达.本研究成功在杆状病毒表达系统中表达了TIMMDC1基因,为其临床应用和功能研究奠定了基础.     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白截短表达及多抗制备

文章旨在表达猪流行性腹泻病毒PEDV截短S1基因(rS1636-789),并制备特异性多克隆抗体。扩增PEDV rS1636-789基因克隆到原核表达载体PGEX-6P-1上,构建重组表达质粒PGEX-6P-1-rS1636-789,经IPTG诱导,获得以包含体形式表达重组蛋白。将重组蛋白作为免疫原制备兔抗rS1636-789抗体并进行效价测定及生物活性检测。结果表明,多抗效价达1:65 536,间接ELISA和Western blot说明此多抗可与rS1636-789重组蛋白发生很好抗原抗体反应。研究进一步定位PEDV S蛋白免疫优势区,为PEDV基因工程疫苗研究奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv3872与Rv3873基因的克隆及重组真核表达载体的构建

目的:克隆结核分枝杆菌Rv3872与Rv3873基因,并构建Rv3872与Rv3873基因的重组真核表达载体,为研究这2个基因的功能奠定实验基础。方法:利用PCR技术克隆Rv3872与Rv3873基因序列,将其连接至pMD-18T载体,鉴定成功后将Rv3872与Rv3873序列插入真核表达载体pEGFP-C1,构建重组pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体,并进行质粒PCR、双酶切以及测序验证。结果:经测序比对后,Rv3872与Rv3873序列与Gene Bank中公布的基因序列一致,重组载体构建成功。结论:成功构建重组pEG-FP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体。     

口蹄疫病毒VP31基因在昆虫细胞中的表达

研究了口蹄疫病毒(FMDV)VP31基因在昆虫细胞中的表达.结果表明:利用重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP31基因,目的基因经亚克隆插入到含有一段蜂毒溶血肽序列的转移载体pMelBac B中,构建出穿梭质粒pMel-VP31.将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.重组病毒经扩增后感染Sf9细胞,用Western-blot和间接夹心ELISA检测,证实VP31蛋白获得了表达.     

结核分枝杆菌热休克蛋白70启动子的克隆和测序

根据结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）热休克蛋白70启动子的基因序列设计1对引物，PCR扩增出150bp的片段后连接到pMD18-T载体上．用重组质粒载体转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定转化菌后进行序列测定。结果表明．该序列与己报道的3株结核分枝杆菌和1株牛型分枝杆菌的相应序列完全同源。该序列可用于构建大肠杆菌-分枝杆菌牟梭质粒载体．启动外源基因在卡介苗菌中的表达。该基因的克隆可为下一步研究开发人和动物以卡介苗为载体的多价活疫苗打下基础。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

根据已经发表的Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因序列,设计1对特异性引物(上下游分别插入Bam H I和Sac I酶切位点),利用PCR技术扩增出VP1基因,经Bam H I和Sac I双酶切后,将其克隆至原核表达载体p ET-32a上,获得重组表达质粒p ET-VP1。重组质粒转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),重组蛋白经IPTG诱导成功表达。将重组蛋白切胶免疫6周龄的BALB/c小鼠,3次免疫后采血,制备DHV-Ⅰ的多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,成功表达出的重组蛋白分子量约为46 000。Western-blotting分析结果表明,该重组蛋白可与His组氨酸鼠单克隆抗体发生特异性反应,Western-blotting检测抗鼠DHV多抗的结果显示,DHV多抗能与目的蛋白发生特异性反应。以上结果表明,DHV的VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的DHV多抗能用于VP1蛋白表达的检测。     

结核分枝杆菌RpfE蛋白的原核表达及鉴定

以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增复活促进因子E(rpfE)基因,并将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,重组表达质粒pET32a-rpfE转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示目的蛋白在细菌裂解上清和沉淀中均有表达,进一步对可溶表达的蛋白通过镍柱亲和纯化,获得高纯度的重组蛋白。Western-blotting试验结果表明:重组RpfE蛋白能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。这为探索RpfE蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制等奠定基础。     

牛型结核分枝杆菌ESAT-6原核表达载体的制备和蛋白纯化

本研究拟构建牛型结核分枝杆菌ESAT-6的原核表达载体,并纯化得到目的蛋白。将牛型结核分枝杆菌ESAT-6的PCR扩增产物连接到p NC-His E载体,构建ESAT6-p NC-His E重组质粒。将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定为阳性;将该阳性枯草芽孢杆菌单菌落接种于培养基中,不需诱导即可分泌表达,离心取上清,并对上清进行纯化、检测,得到目的蛋白。本研究提供一种可快速、简便地获得大量枯草芽孢杆菌分泌性表达ESAT-6蛋白的方法。     

猪轮状病毒DN30209株VP4全长蛋白表达及多抗制备和鉴定

为开展猪轮状病毒（PRV）及其VP4蛋白相关特性研究,参照GenBank所收录的猪轮状病毒JL94、OSU等株序列设计一对特异性引物,从实验室分离鉴定的猪轮状病毒DN30209株扩增约2330 bp VP4全长基因,并成功构建重组质粒VP4-pMD18-T。重组质粒经测序、序列比对及分析。结果表明,DN30209株VP4全基因长2331 bp,与参考株JL94的核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.5%。将VP4基因连接到pGEX-6P-1原核表达载体中,构建并筛选出阳性原核表达载体重组质粒VP4-pGEX-6P-1。阳性重组质粒转化Rosetta宿主菌感受态细胞中,经IPTG诱导,获得以包涵体形式表达的重组蛋白,融合蛋白大小约为112 ku,与预期大小相符。回收、纯化并复性该蛋白,将其作为免疫原免疫大白兔,制备兔抗PRV VP4全长蛋白多克隆抗体,间接ELISA测定多抗效价到1??105,间接免疫荧光（IFA）和免疫印迹（Western blot）检测表明该多抗均可与PRV具有很好的抗原抗体反应性,为猪轮状病毒研究提供有效实验材料。