中华蜜蜂OBP18 CDs序列及表达与抗螨性状相关性分析

OBP18是蜜蜂气味结合蛋白质(odorant binding proteins,OBPs)家族中的成员,参与气味分子的识别,对嗅觉起着重要的作用。为研究蜜蜂OBP18基因功能及与抗螨性状的相关性,本研究以中华蜜蜂头部组织c DNA为模板,PCR扩增OBP18基因完整CDS序列,利用生物信息学方法分析其CDS序列及其编码的氨基酸序列,用RT-PCR方法检测OBP18基因在不同抗螨性状的中华蜜蜂头部组织中的相对表达量。结果表明:OBP18基因CDS全长为399 bp,编码132个氨基酸的分泌性蛋白,无跨膜螺旋,是比较保守的基因;RT-PCR检测在螨虫胁迫下的蜂螨抗性中华蜜蜂头部组织中OBP18基因表达量显著高于未受胁迫的抗性群体,及受到同等蜂螨胁迫的敏感性群体,显示中华蜜蜂OBP18基因的表达变化与蜂螨感染过程相关,提示OBP18基因在中华蜜蜂的抗螨行为中起着重要作用。     

中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOR141的克隆与表达分析

[目的]克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉受体基因AcerOR141,并对其全长序列和表达谱进行分析,为该基因的功能研究奠定基础。[方法]利用PCR扩增和基因克隆技术获得中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOR141的cDNA全长序列;利用多种生物信息学软件对该基因编码的氨基酸序列进行结构预测、序列比对和进化树分析;利用qRT-PCR技术检测该基因在1、5、10、15、20、25和30日龄工蜂各组织中的表达情况。[结果]AcerOR141 cDNA全长为1 659 bp,ORF序列长度为1 299 bp,编码432个氨基酸,有7个跨膜结构且N端位于胞内,无信号肽,第184～421位氨基酸之间存在一个昆虫嗅觉受体7tm-6 superfamily的保守结构域。序列比对和进化树分析表明,AcerOR141与西方蜜蜂AmelOR141的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性高达91%。荧光定量PCR结果显示,AcerOR141 mRNA在工蜂触角和头部的表达较高,且极显著高于其他组织(P0.01);在胸、腹、足和翅膀中仅有微量的表达。[结论]克隆获得AcerOR141的全长cDNA序列,其编码产物具有昆虫嗅觉受体的典型结构特征;明确了该基因在中华蜜蜂成蜂触角和头部中有较高的表达,推测其表达产物为普通嗅觉受体蛋白,可能参与挥发性气味分子的识别过程。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因AcerOBP14的克隆及时空表达

【目的】克隆获得中华蜜蜂(Apis cerana cerana)Acer OBP14基因序列,并对其蛋白结构进行预测,分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异,为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织c DNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Acer OBP14 c DNA全长序列,并提交至Gen Bank数据库;利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MEGA5.2软件中的邻位相连法(neighbor-joining,NJ)构建Acer OBP14及其同源膜翅目昆虫OBPs的系统发育树;通过实时荧光定量PCR技术分析Acer OBP14在1、5、10、15、20、25和30日龄中华蜜蜂不同组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中m RNA的表达情况。【结果】克隆获得了中华蜜蜂气味结合蛋白基因Acer OBP14的c DNA序列(Gen Bank登录号为KT24648)。Acer OBP14的开放阅读框(ORF)长度为408 bp,编码135个氨基酸,预测其蛋白分子量为15.08 k D,理论等电点为5.44,有信号肽,无跨膜结构,且第18—127位氨基酸之间存在一个昆虫气味结合蛋白家族PBP-GOBP superfamily保守结构域;存在多个比较明显的疏水区域,可能是脂溶性气味分子的结合位点;含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。亚细胞定位分析表明,Acer OBP14属于分泌型蛋白,主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。Acer OBP14蛋白具有7个α螺旋,α1—α6属于典型OBPs核心螺旋,α7位于C端且暴露在蛋白表面。氨基酸同源序列比对结果显示,Acer OBP14与西方蜜蜂Amel OBP14的氨基酸序列一致性最高,达到86%;其次是大蜜蜂Ador GOBP56a-like,一致性为55%。系统进化树分析表明,同为蜜蜂属的中华蜜蜂Acer OBP14、西方蜜蜂Amel OBP14、大蜜蜂Ador GOBP56a-like、中华蜜蜂Acer OBP21和小蜜蜂Aflo GOBP56d-like聚为一个分支,切叶蜂属的苜蓿切叶蜂Mrot GOBP56a-like、侧沟茧蜂属的毁侧沟茧蜂Mdem GOBP83a-like、壁蜂属的角额壁蜂Ocor OBP3和熊蜂属的Bter GOBP56d-like和Bimp GOBP56d-like聚为另一大分支。荧光定量PCR结果显示,Acer OBP14在成蜂不同发育期的触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,其表达程度有差异。1日龄工蜂的胸部表达量最高,触角次之,且两者均极显著高于头、腹、足和翅(P0.01);其他日龄工蜂触角表达量均极显著高于其他组织(P0.01),其中20日龄工蜂的触角表达量最高。从各组织在不同发育阶段的表达量来看,触角的表达量在1日龄最低,极显著地低于其他日龄(P0.01);5、10日龄逐渐增加,15日龄突然下降,20日龄达到最高,极显著高于其他日龄(P0.01);之后又呈逐渐下降趋势。头、胸、腹、足和翅膀表达量总体上随日龄增加而呈下降趋势,5日龄之后大幅下降,之后趋于平稳且呈低丰度表达。【结论】Acer OBP14属于Minus-C OBP亚家族,具有PBP-GOBP家族的典型结构;组织表达谱结果暗示,Acer OBP14属普通气味结合蛋白GOBP,在中华蜜蜂中除嗅觉识别之外还参与其他生理功能。     

灭字脊虎天牛触角转录组中气味结合蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】发掘灭字脊虎天牛(Xylotrechus quadripes Chevrolat)成虫触角中的OBP基因,明确OBP基因在成虫不同组织的表达情况。【方法】采用Illumina HiSeq~(TM) 2000测序平台对灭字脊虎天牛的触角进行转录组测序,利用BLAST同源搜索的方法鉴定OBP基因,采用RT-PCR技术研究OBP基因的表达谱。【结果】从灭字脊虎天牛的触角转录组中共鉴定到24个OBP基因,所有OBP基因均具有全长开放阅读框(123~180个氨基酸)和信号肽序列(16~23个氨基酸)。多序列比对结果表明,不同OBP间一致性较低,其平均值为19.4%。序列比对和进化树分析结果表明,9个OBP具有6个保守的半胱氨酸,属于Classic OBPs家族;15个OBP具有4个保守的半胱氨酸,属于Minus-C OBPs家族。RT-PCR结果表明,Xqua OBP4、OBP8、OBP18和OBP21在触角特异表达;Xqua OBP2、OBP3、OBP7和OBP20在触角高表达,另外在其他组织中也有表达;其他OBPs基因在检测的两个或多个组织中均有不同程度的表达。【结论】从灭字脊虎天牛触角转录组中共鉴定得到24个OBP基因,其中部分基因在触角特异或高表达,很可能参与嗅觉功能;部分基因在非嗅觉组织中有表达,很可能具有非嗅觉功能。     

小菜蛾三个普通气味受体基因的克隆及表达谱

【目的】克隆小菜蛾（Plutella xylostella）触角中3个气味受体基因,明确这3个气味受体在不同组织中的表达分布,进而推测这3个基因的功能,为进一步深入研究奠定基础。【方法】通过新一代高通量测序技术对小菜蛾成虫触角进行转录组测序,获得小菜蛾的转录组数据信息,通过对高质量序列的拼接组装、基因鉴定和功能注释,并通过Blastx基于数据库进行相似性比对分析,预测小菜蛾的气味受体候选基因;设计引物通过克隆得到3条普通气味受体基因的全长序列,并利用半定量RT-PCR研究其在雌、雄成虫9个不同组织中的表达。【结果】根据预测的基因序列,设计特异引物,克隆得到3条普通气味受体基因的全长序列,分别命名为PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18（GenBank登录号分别为KF717601-KF717603）。PxylOR16开放阅读框全长为1 218 bp,编码406个氨基酸;PxylOR17开放阅读框全长为1 200 bp,编码400个氨基酸;PxylOR18开放阅读框全长为 1 191 bp,编码397个氨基酸。选择已报道的鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）、烟芽夜蛾（Heliothis virescens）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）的气味受体,以及已报道的小菜蛾的6条性信息素受体与1条非典型气味受体与本实验克隆得到的3个气味受体进行序列比对和进化树分析,结果显示这3个气味受体基因与非典型气味受体和性信息素受体同源性低,而与其他的普通气味受体聚类在一起,且PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18彼此同源性较低。半定量的结果显示,3个普通气味受体基因均在触角中表达量最大,在其他嗅觉感器,如喙、下唇须和头部中也有一定量的表达,雌、雄间无显著差异。另外,PxylOR17在雌蛾生殖器中,PxylOR18在雌蛾腹中也有一定表达。但3种气味受体基因在雌、雄蛾的胸、足和翅等组织中均不表达。【结论】鉴定和克隆了3个小菜蛾气味受体基因,明确这些气味受体基因在小菜蛾不同组织中的表达水平,通过进化树分析、序列比对和组织表达谱分析确定PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18为3条普通气味受体,且在功能上高度分化。根据半定量RT-PCR的结果,推测这3个基因可能参与了普通气味分子的识别过程,此外PxylOR17和PxylOR18还可能参与了信息素的产生和释放过程。     

中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA的克隆及原核表达

 【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a（+）/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2（GenBank登录号：DQ449667）的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429 bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7 kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Acer-ASP2极有可能属于GOBP家族。构建的原核表达载体pET/Acer-ASP2,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地表达出一个分子量约为21kD的融合蛋白,融合蛋白大部分以包涵体的形式存在于菌体沉淀中（约59.7%）,经洗涤和尿素梯度溶解对包涵体进行了纯化,经凝胶光密度扫描分析,约占最终产物的81.2％左右。【结论】克隆、分析和表达了一个新的编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA序列,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础。     

美洲斑潜蝇气味结合蛋白OBP13的鉴定与功能

【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇OBP13编码区全长,用DNAMAN对其进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并使用MEGA6.0构建进化树,进行系统发育分析。通过实时定量PCR对OBP13在美洲斑潜蝇不同组织中的表达情况进行分析。构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化,获取重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为337 nm,以1-NPN为荧光探针,研究OBP13与25种不同气味配基的结合特性。使用间接免疫荧光染色技术及制备的OBP13的特异性多克隆抗体,对其在组织中的分布情况进行定位。将美洲斑潜蝇触角进行包埋、切片、免疫染色,并在激光共聚焦显微镜下进行观察,了解OBP13在触角感器中的亚细胞分布。【结果】获得了一个美洲斑潜蝇气味结合蛋白基因,命名为LsatOBP13（GenBank登录号：KT250751）。LsatOBP13开放阅读框全长462 bp,编码153个氨基酸,预测成熟蛋白分子量为17.80 kD,等电点为5.75,N-末端的前17个氨基酸为信号肽序列。具有4个保守的半胱氨酸位点,为Minus-C OBP。系统发育分析显示,其与地中海实蝇CcapOBP99a-like位于同一小分支上,亲缘关系较近。检测LsatOBP13在不同组织的表达水平,发现LsatOBP13在触角中的表达量远远高于其他组织。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。对25种气味配基的结合能力检测,发现LsatOBP13与反式-2-己烯醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、α-紫罗兰酮、苯并噻唑、β-紫罗兰酮具有较强的结合能力,解离常数分别为12.592、10.995、11.165、11.224、10.336、9.218 μmol·L^-1,其中与β-紫罗兰酮亲和能力最强。通过免疫荧光定位,发现其在触角中主要定位在毛形感器和锥形感器上,在触角嗅觉窝及触角芒连接处也有分布。【结论】美洲斑潜蝇OBP13为非典型的气味结合蛋白Minus-C OBP。表达情况、气味结合特性、免疫定位结果表明,OBP13主要存在于美洲斑潜蝇触角中,参与触角对绿叶植物中大量存在的气味物质的识别过程,推测其在美洲斑潜蝇嗅觉识别、寄主植物定位中发挥功能。     

朱砂叶螨精氨酸激酶基因的克隆与表达特征

【目的】拟克隆朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)精氨酸激酶基因,并分析其序列特征及表达模式,探讨该基因在朱砂叶螨生长发育、滞育及响应温度胁迫和紫外胁迫等方面的作用。【方法】通过RT-PCR技术和RACE方法,获得朱砂叶螨精氨酸激酶cDNA全长序列(TcAK),并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测TcAK基因在不同发育阶段、滞育状态和温度胁迫及紫外胁迫条件下的表达情况。【结果】结果表明,TcAK基因阅读框架全长1 071bp,编码356个氨基酸残基,含有典型的精氨酸激酶活性中心位点和底物结合区。TcAK基因在幼螨期和若螨期的表达量较卵期显著增大,在幼螨期的表达量达到最大,远高于其他发育阶段,而TcAK基因在成螨期的表达量较卵期下降。此外,滞育状态、高温/低温胁迫、UV胁迫下朱砂叶螨的TcAK表达量均显著升高。【结论】朱砂叶螨精氨酸激酶与其生长发育相关,并可能参与抵御外界不良环境。     

兴凯湖翘嘴鲌(Culter alburnus)LPL基因克隆及其表达

采用RT-PCR和RACE技术,进行兴凯湖翘嘴鲌LPL基因的克隆与表达分析,旨在为其脂肪性状的研究奠定基础.根据Genbank中已知的鲤科鱼类LPL基因序列设计引物,克隆出兴凯湖翘嘴鲌(Culter alburnus)脂蛋白酯酶(idella lipoprotein lipase,LPL)的c DNA序列;将其提交到Genbank,获得基因登陆号为KC166 231;兴凯湖翘嘴鲌LPL基因c DNA序列共1 947 bp,基因编码区序列共1 524 bp,编码一个终止密码子和507个氨基酸;通过Blast与Genbank上发表的其他物种的CDS区进行比对发现,与草鱼(Ctenopharyngodon)的同源性达到98%.采用荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测了兴凯湖翘嘴鲌野生群体和养殖群体在不同年龄、不同组织中LPL的表达量.结果表明,随年龄的增长野生群体与养殖群体LPL基因相对表达量差异增大,4龄养殖群体LPL基因相对表达量是同期野生群体的17.54倍,二者差异显著(P0.05);LPL基因在心脏当中表达水平最高,脾和肝脏中的表达量次之.     

烟夜蛾气味受体OR18基因克隆及组织特异性表达

应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术,从烟夜蛾雄虫触角中克隆气味受体目的基因,分析鉴定了其在烟夜蛾不同组织的特异性表达情况.序列分析结果表明,目的基因为新的烟夜蛾气味受体基因,命名为HassOR18(GenBank登录号:HM750915).该基因阅读框架全长1 197 bp,编码398个氨基酸,推测编码蛋白质的相对分子质量为46.6 kD,等电点为5.82.氨基酸序列比对表明,烟夜蛾气味受体HassOR18与其他夜蛾科昆虫OR18的氨基酸序列一致性均达80％以上.实时荧光定量PCR结果显示,HassOR18仅在雌雄虫触角中和雌虫喙内表达,而且在雄虫触角内的表达量远高于在雌虫触角和喙内的表达量,推测该基因可能参与性信息素的识别.     

地熊蜂非视觉相关beta-arrestin基因的克隆与表达谱分析

[目的]克隆鉴定地熊蜂非视觉相关beta-arrestin基因并分析其在蜂王不同发育时期及特定组织中的表达差异,以期为该基因的功能研究奠定基础。[方法]利用PCR扩增和基因克隆技术获得地熊蜂非视觉相关beta arrestin基因的cDNA全长序列;利用生物信息学技术对该基因编码的氨基酸序列进行比对和进化树分析;运用Real-time PCR技术分析该基因在地熊蜂蜂王出房前1天、出房第1天、交配后5天、越冬3个月、越冬5个月、产卵第1天和饲养3个月后的脑、卵巢、中肠和脂肪体表达情况。[结果]beta-arrestin基因CDS序列长1 248bp,编码的蛋白大小为415aa。该蛋白氨基酸序列中第27～182个氨基酸残基为Arrestin-N superfamily的保守结构域;第201～354个氨基酸残基为Arrestin-Csuperfamily的保守结构域。相似性分析表明,地熊蜂beta-arrestin基因氨基酸序列与NCBI中收录的地熊蜂转录组数据的氨基酸序列一致性高达97%。Real-time PCR结果表明,beta-arrestin基因在地熊蜂所有检测的发育阶段及特定组织均有所表达,但表达量差异很大(P0.05)。其中在头部和中肠表达量较高的时期是越冬3个月蜂王,在卵巢和脂肪体表达量较高的时期是出房第1天蜂王。[结论]本研究克隆了地熊蜂beta-arrestin基因的CDS序列,确定了beta-arrestin基因CDS序列编码的氨基酸序列,分析了该基因的序列特征和表达谱,推测其与蜂王越冬期间生理代谢过程和蜂王性成熟阶段激素分泌活动有关。     

草菇多酚氧化酶基因的克隆与表达分析

【目的】解析草菇多酚氧化酶基因家族序列信息,明确其特征和表达模式。【方法】通过转录组测序找出含有酪氨酸酶结构域的基因,并根据搜索得到的序列设计引物,以不同发育时期的草菇 v26 菌株,以及草菇蛋形期外菌膜、菌盖、菌柄等不同组织为材料提取 RNA,经反转录为 cDNA,扩增获得草菇多酚氧化酶基因序列。采用在线生物信息学网站预测草菇多酚氧化酶的理化性质。采用 RT-PCR 的方法,检测草菇不同发育时期和不同组织部位多酚氧化酶的表达模式。【结果】获得 4 个草菇多酚氧化酶基因家族的 CDS 序列,依次命名为 VvPPO1、VvPPO2、VvPPO3、VvPPO4,其中 VvPPO1 CDS 全长 1 596 bp、编码 531 个氨基酸,VvPPO2 CDS 全长 2 685 bp、编码 894 个氨基酸,VvPPO3 CDS 全长 1 593 bp、编码 530 个氨基酸,VvPPO4 CDS 全长2 067 bp、编码 688 个氨基酸。生物信息学分析表明,4 个基因编码的蛋白均含有 2 个铜离子结合区,为亲水性蛋白;RT-PCR 结果显示,4 个基因在草菇发育的菌丝期、原基期、蛋形期、成熟期均有表达,VvPPO1、VvPPO3 和VvPPO4 的表达量在子实体时期高于菌丝期,在蛋形期 VvPPO1 和 VvPPO4 在外菌膜的表达量比在菌柄和菌盖中的表达量高。【结论】在草菇中搜索得到 4 个多酚氧化酶基因,均含有 2 个铜离子结合区,4 个基因在各个发育时期均有表达。     

中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP7的表达及结合特性

[目的]中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)是我国本土蜂种,也是重要的传粉昆虫和经济昆虫.气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)是蜜蜂嗅觉感知中的关键蛋白.在前人对中蜂AcerOBP7基因序列特征分析的基础上,本研究进一步对其表达特性及与气味物质的结合能力进行探究,...     

西花蓟马气味结合蛋白的cDNA克隆、序列分析及时空表达

【目的】鉴定西花蓟马(Frankliniella occidentalis)气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）并对其序列特征及分布情况进行研究,为阐明该虫嗅觉识别的机制、利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治提供依据。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马气味结合蛋白基因,用DNAMAN软件进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并用MEGA6.0的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,应用服务器Chou & Fasman预测蛋白的二级结构,通过实时荧光定量PCR检测该基因在西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织中的分布情况。【结果】克隆了一个西花蓟马气味结合蛋白基因,命名为FoccOBP1（GenBank登录号：KM527948）;该基因cDNA序列全长660 bp,其中开放阅读框450 bp,编码149个氨基酸,3′端非编码区长172 bp,具有真核生物polyA加尾结构,5′末端非编码区长38 bp,预测成熟蛋白分子量为16.39 kD,等电点为7.46,N端有22个氨基酸组成的信号肽序列,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸位点特征,其排列方式为C1-X₂₆-C2-X₃-C3-X₄₀-C4-X₉-C5-X₈-C6,符合典型OBP 6个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有3个亲脂性区域,第74-83位的氨基酸残基形成的亲脂性口袋尤为明显,可能是脂溶性气味分子的结合位点;FoccOBP1氨基酸序列与3个半翅目和10个同翅目昆虫OBP聚在同一分支,其中与绿盲蝽（Apolygus lucorum）的AlucOBP8（GenBank登录号为AFJ54049.1）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）的AlinOBP5（GenBank登录号为ACZ58031.1）、牧草盲蝽（Lygus lineolaris）的LlinOBP2（GenBank登录号为AHF71029.1）同源相似性最高,其次是棉蚜（Aphis gossypii）的AgosOBP7（GenBank登录号为AGE97637.1）、大豆蚜（Aphis glycines）的AglyOBP7（GenBank登录号为AHJ80893.1）、禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi）的RpadOBP7（GenBank登录号为AHL30243.1）等昆虫的OBP,表明FoccOBP1与这些基因的亲缘关系也较近;经FoccOBP1蛋白的二级结构预测,FoccOBP1以α-螺旋为主,其次是β-折叠,转角含量较少;经不同发育阶段检测发现,FoccOBP1在西花蓟马若虫期和初羽化成虫期的表达量较高,且随成虫羽化后天数的延长表达量逐渐降低,在雌雄成虫间的表达量也有差异;在初羽化成虫的不同组织检测发现,FoccOBP1几乎在初羽化成虫触角中特异性表达;构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1。【结论】明确了FoccOBP1的核苷酸、氨基酸序列特征,分析了该蛋白的二级结构特征,根据FoccOBP1在西花蓟马中的时空表达情况,推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、定位寄主植物、信息素合成或性行为方面扮演重要角色;成功构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1,为下一步该蛋白表达纯化及其功能的深入研究打下基础。     

盐碱胁迫对莫桑比克罗非鱼TauT2基因表达的影响

【目的】研究在莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）中新发现的编码牛磺酸转运蛋白的基因TauT2在盐碱胁迫下对鱼体渗透压调控的作用,为深入阐明鱼类中牛磺酸转运蛋白的功能提供更全面可靠的数据。【方法】通过PCR和直接测序的方法对TauT2基因的编码区序列（CDS）进行分析,用生物信息学分析方法预测其编码蛋白的氨基酸序列及其高级结构,并利用荧光定量PCR检测该基因在肝、肠、肌肉等13个组织中的表达特征,以及在盐碱胁迫（盐25 g/L,碱4 g/L） 96 h内,不同时间点鳃、肾、肠和肝组织中TTauT2基因mRNA的表达水平。【结果】获得的TauT2基因CDS序列全长1881 bp,共编码626个氨基酸,氨基酸序列与斑马拟丽鱼（Maylandia zebra）牛磺酸转运蛋白的一致性最高,为98.72%,与已报道的莫桑比克罗非鱼的tTAUT1蛋白一致性为88.52%,该蛋白具有典型的牛磺酸转运蛋白跨膜结构域。荧光定量PCR结果表明,TauT2基因在肝、肠、肌肉等13个组织均有表达,其中血液中表达量最高,肠中的表达量最低。盐碱胁迫条件下,TauT2基因mRNA表达水平在鳃、肾、肠和肝组织中的表达均呈先升高再下降的变化趋势,鳃和肝达峰值的时间为48 h,肾和肠达峰值的时间分别是24和72 h,达峰值的时间与莫桑比克罗非鱼的tTauT1基因存在明显差异。【结论】莫桑比克罗非鱼在受到盐碱胁迫后,通过提升TauT2基因的表达量来有效调控体内渗透压,为渗透压稳态的维持发挥作用。莫桑比克罗非鱼体内至少有2种不同的牛磺酸转运蛋白,已发现的这2个蛋白氨基酸序列、三级结构及在鱼体不同组织中精细调节体内渗透压的功能存在一定差异。     

木薯ERF转录因子基因MeERF5克隆及表达分析

【目的】克隆木薯ERF转录因子基因MeERF5,并分析其在多种逆境胁迫下的表达模式,为深入研究MeERF5基因在木薯逆境胁迫应答中的调控机制提供参考。【方法】PCR扩增木薯品种华南8号的MeERF5基因编码区(CDS)全长序列,对其进行生物信息学分析,并利用根癌农杆菌介导法进行蛋白亚细胞定位。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MeERF5基因在木薯不同组织及多种逆境胁迫处理下的相对表达量。【结果】克隆获得MeERF5基因CDS序列为948 bp,与Phytozome数据库中的参考序列(登录号:Manes.01G085200.1)的核苷酸序列相似性为100.00%,其编码315个氨基酸残基,蛋白分子量为77.84 kD,理论等电点(pI)为5.08,属于酸性蛋白,其二级结构中α-螺旋占16.51%,β-转角占3.81%,无规则卷曲占62.22%,延伸链占17.46%,亚细胞定位于细胞质。通过多序列比对及系统进化分析发现,MeERF5蛋白含有1个AP2/ERF保守结构域,与同属大戟科的橡胶树ERF蛋白氨基酸序列相似性最高(76.8%),亲缘关系最近。MeERF5基因在木薯不同组织中均有表达,其中,在茎中的相对表达量最高,在腋芽中的相对表达量最低。MeERF5基因能快速响应低温胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫、盐胁迫及ABA处理,均出现诱导表达上调的现象,其中,在氧化胁迫下,MeERF5基因的相对表达量持续上升;在干旱胁迫、盐胁迫及ABA处理下,MeERF5基因的表达量先上升后降低;在低温胁迫下,MeERF5基因在处理5 h时的相对表达量达到最大值,之后有所下降,但在处理48 h时再度上升。【结论】克隆获得的MeERF5基因属于AP2/ERF类转录因子,参与木薯多种非生物胁迫应答过程。     

一种桔小实蝇Minus-C气味结合蛋白的分子克隆和结合特征分析

为了更好地了解昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在桔小实蝇Bactrocera dorsalis嗅觉识别中的作用,并明确其与寄主挥发物的结合特性,本研究克隆了一个"Minus-C"OBP基因Bdor OBP1a。BdorOBP1a基因长480 bp,编码159个氨基酸,其N端含有26个氨基酸的信号肽,去信号肽氨基酸序列中有4个保守的半胱氨酸。利用荧光竞争结合实验对Bdor OBP1a与21种寄主挥发物进行结合特征的测定,结果表明Bdor OBP1a可以与15种寄主挥发物结合,其中结合能力最强的是β-紫罗兰酮和苯甲醛,解离常数分别为31.1、31.8μmol/L。行为反应表明桔小实蝇对β-紫罗兰酮,乙酸异戊酯,苯甲醛和己酸乙酯都具有趋性。由此推断,Bdor OBP1a具有选择性识别和结合各种配基的特性,并在桔小实蝇对寄主植物气味的定位过程中起着重要的作用。     

异齿裂腹鱼PYY基因的克隆、组织分布及其调节摄食功能研究

【目的】克隆异齿裂腹鱼肽YY基因(PYY)的编码区(CDS)全长序列,对其生物信息学进行分析,并研究PYY基因在异齿裂腹鱼组织中的分布情况,以及餐前餐后和禁食复喂对PYY基因表达量的影响,为异齿裂腹鱼摄食调控机制研究提供依据。【方法】以采集于西藏雅鲁藏布江的7～12龄,体质量为(1.22±0.20) kg/尾的异齿裂腹鱼为对象,采用RT-PCR和Race-PCR技术克隆异齿裂腹鱼PYY基因的CDS全长序列,分析其编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白结构;采用实时荧光定量PCR,分析PYY基因在异齿裂腹鱼组织中的分布情况,以及餐前餐后和禁食复喂对PYY基因在异齿裂腹鱼脑组织中表达量的影响。【结果】异齿裂腹鱼PYY基因CDS序列长度为735 bp,其中开放阅读框(ORF)为294 bp,编码98个氨基酸。系统进化分析表明,异齿裂腹鱼PYY基因与同属裂腹鱼属的鱼类亲缘关系最近;氨基酸序列分析表明,PYY蛋白质包括典型的特征序列和信号肽,其蛋白结构中具有亲水性结构和跨膜结构。PYY基因在异齿裂腹鱼脑组织中高度表达,在其他组织中微弱表达;餐前异齿裂腹鱼PYY基因的表达量无显著性差异,但餐后PYY基因的表达量显著升高,且随着餐后时间的逐渐延长,其表达量继续升高;禁食使异齿裂腹鱼脑组织中的PYY基因表达量下降,复喂后PYY基因的表达量极显著升高。【结论】成功克隆了异齿裂腹鱼PYY基因的CDS全长序列,PYY基因在异齿裂腹鱼脑组织中高度表达,但在肠道中微量表达,异齿裂腹鱼PYY基因是餐后饱感信号因子,具有调节动物摄食的功能。     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1 177 bp,开放阅读框长1 050 bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6 kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究(英文)

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1177bp,开放阅读框长1050bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。