致病性鸡大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimA基因的克隆和同源性分析

根据Genbank已发表的致病性鸡大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)Ⅰ型菌毛fim A基因序列,设计并合成了位于fim A基因保守区的1对引物.应用PCR技术以鸡大肠杆菌标准株和分离株DNA为模板,扩增到片段长为549 bp的阳性产物;经酶切、连接、转化和筛选,得到fim A基因,并克隆、测序;运用DNAStar软件对核酸序列分析,确定所扩增和克隆的DNA片段为fim A基因.     

鸡致病性大肠埃希氏菌的菌毛血清型检测

使用透射电镜对3株鸡致病性大肠埃希氏菌(E.coii)的菌型进行了形态观察,发现其中2株菌具有纤细、中空、挺直的菌毛,另外1株未见菌毛。有菌毛的2株菌与K88、K99、987P和F41单因子兔高免血清的玻片凝集反应阴性,而与2株兔源的具菌毛的E.coli菌的兔高免血清呈强阳性。未见菌毛的那株菌与上述所有血清的玻片凝集反应均呈阴性。     

大肠埃希氏菌表面菌毛黏附因子多价菌毛疫苗的研制

为了预防仔猪黄痢,选取ETEC野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K88ad)、HN2004(K99)、HN2005(987p)、HN2006(F41)培养后用低温磁力搅拌法提取到菌毛,制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗,实验室试验结果表明,5批多价灭活疫苗对小白鼠的平均保护率达95.0%,为进一步进行田间试验提供了理论依据,并将为生产上防治仔猪黄痢提供一种保护范围更加全面的生物制品.     

2株O109血清型鸡大肠埃希菌iss基因的序列分析

对2株强致病性O109血清型鸡大肠埃希菌扩增了iss基因.结果表明,iss基因在2株O109血清型鸡大肠埃希菌中的序列与已知禽大肠埃希菌iss基因序列同源性为100%, 与人源大肠埃希菌iss基因序列同源性为90.9%,显示了此基因的保守性.     

鸡大肠埃希氏菌致病性,菌毛表达及血凝特性

观察比较了鸡大肠埃工菌某些分离株腹腔接种,气管接种对１日龄鸡的致病性,研究了在体外不同培养条件下,菌株菌毛的表达情况,菌株的血凝谱及血凝特性。     

164株大肠埃希菌耐药性分析

目的分析临床分离的大肠埃希菌株耐药性,为合理选用抗生素提供依据.方法根据NCCLS推荐使用的常用抗生素,采用Kirby-Bauer法检测164株大肠埃希菌对8种抗生素耐药性.结果164株大肠埃希菌耐2～4种抗生素居多,少数菌株可耐5～8种抗生素;对氧哌嗪青霉素、氨苄青霉素、复方磺胺、四环素、诺氟沙星的耐药率分别为45%、39%、32%、30%和24%.讨论大肠埃希菌耐药严重,多重耐药现象普遍,应引起临床高度重视.     

大肠埃希菌内参基因gapA克隆表达及抗体的制备与应用

针对原核生物细菌作为内参蛋白至今鲜见报道,基于大肠埃希菌gapA基因编码的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白高度保守性,PCR扩增出人源大肠埃希菌益生菌Nissle1917的gapA基因并克隆入原核表达载体pET-28a(+),经IPTG诱导表达重组GAPDH蛋白。通过对重组蛋白的纯化并免疫BABL/c小鼠制备大肠埃希菌内参蛋白GAPDH多抗血清,结合SDS-PAGE和Western-blot试验。结果表明:GAPDH对大肠埃希菌及沙门氏菌属细菌代表株均具有良好的特异性识别反应。证明GAPDH蛋白可应用于原核生物细菌一类的内参蛋白,为深入研究肠杆菌,尤其是致病性大肠埃希菌和肠炎沙门氏菌的代谢通路以及合成生物学提供基础材料。     

扬州市流浪犬肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌耐药性分析及PMQR基因检测

为了解扬州市流浪犬相关肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的耐药情况及质粒介导的喹诺酮类耐药(plasmid-mediated quinolone resistant, PMQR)基因的流行性与多样性,从扬州市犬只留检所采集156份样品进行肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的分离、纯化与鉴定;采用琼脂稀释法测定分离株对15种抗菌药物的最小抑菌浓度,PCR检测喹诺酮类耐药菌株PMQR基因的携带情况。结果表明：共分离到82株肺炎克雷伯菌和119株大肠埃希菌,其中肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率最高(97.56%),其次是磷霉素(75.61%),有7株菌对6种以上的药物耐药;119株大肠埃希菌中有79株菌至少对1种药物耐药,对四环素、氨苄西林、萘啶酸、复方新诺明和环丙沙星的耐药率分别为48.74%、37.82%、26.05%、29.41%和10.08%, 12株菌耐6种以上药物。共分离到40株喹诺酮耐药菌株,PMQR基因qnrS、oqxAB、qnrD和aac(6′)-Ib-cr的检出率分别为22.50%、17.50%、7.50%和7.50%,且有1株肺炎克雷伯菌和1株大肠埃希菌同时携带aac(6′)-Ib-cr、q...     

鸡源大肠埃希氏菌(ESCHERICHIA COLI)菌毛的电镜观察

为了摸清鸡源大肠埃希氏菌的菌毛与致病性的关系而进行了本课题的研究。我们从内蒙古自治区7个盟市9个具有代表性的养鸡场死胚和死雏鸡中分离到的203株大肠埃希氏菌中选择了13株有致病性和2株无致病性的菌株进行电子显微镜观察。通过观察发现,我们所分离到的鸡致病性大肠埃希氏菌菌株在适宜的条件下培养均能形成菌毛,而无致病性大肠埃希氏菌未能形成菌毛。     

宠物源大肠埃希菌耐药性及耐药基因调查

【目的】了解广州市宠物源大肠埃希菌Escherichia coli耐药性和耐药基因携带情况。【方法】2016年7月至2017年7月从广州市4家宠物医院采集健康或患病犬猫样品共319份,其中,健康动物127份,患病动物192份。采用选择性培养基分离大肠埃希菌,利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定菌种;采用琼脂稀释法测定大肠埃希菌对11种抗菌药物的敏感性,利用PCR和测序检测耐药基因的携带情况。【结果】319份样品共分离得到大肠埃希菌203株,其中,患病动物源109株,健康动物源94株。203株大肠埃希菌中有179株至少对1种抗生素耐药;对氨苄西林耐药率最高(76.85%),对头孢噻肟、四环素、多西环素和磺胺甲噁唑-甲氧苄啶耐药率均高于50%;对阿米卡星最为敏感,耐药率仅为10.84%。患病动物源大肠埃希菌对11种抗菌药物的耐药率均高于健康动物源,除阿米卡星、氟苯尼考和磷霉素外,对其他药物的耐药性均差异极显著(P 0. 01)。耐药基因检测结果显示,floR检出率最高(检出率为34.97%),blaCTX-M-9G、blaCTX-M-1G、fos A3、rmt B和bla CMY-2检出率分别为22.66%、20.19%、17.73%、10.34%和1.48%,未检测到blaCTX-M-2G和blaCTX-M-25G。【结论】广州地区宠物源大肠埃希菌耐药状况严峻,且常携带多种重要耐药基因。应当加强对宠物源细菌耐药性的监测。     

大肠埃希菌Ⅰ类整合子与多重耐药的相关性分析

采用从粪便中分离并鉴定出的40株鸡源大肠埃希氏菌,用K-B法测定大肠杆菌多重耐药性,通过PCR法扩增Ⅰ类整合子,电泳检测扩增产物。结果表明,40株大肠杆菌对10类18种抗菌药物的耐药率,最高为S,C,SMX,SXT 100%,最低为PB,CTX 0%,多重耐药率(耐3种以上药物)为100%。Ⅰ类整合子阳性菌株35株,阳性率87.5%。Ⅰ类整合子对大肠杆菌多重耐药性的产生和传播起着重要作用,应加强基因水平耐药监测。     

蓝狐脑型大肠埃希氏菌的分离鉴定

从有神经症状的病死蓝狐脑组织中分离出两株大肠埃希氏菌，两株菌对小白鼠致病性强，对痢特灵、氨苄青霉素等敏感。     

猪源大肠埃希菌喹诺酮类耐药基因的检测及分析

【目的】探究江苏泰州地区猪源致病性大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药情况以及喹诺酮相关耐药因子的流行情况.【方法】采用纸片法对81株临床分离的猪源致病性大肠埃希菌进行喹诺酮类药物耐药性的检测,通过PCR方法检测质粒介导的喹诺酮类耐药基因(PMQR)和喹诺酮类耐药决定区基因(QRDR)并进行分析.【结果】菌株对萘啶酸和环丙沙星的耐药最为严重,耐药率分别为69.1%和51.9%,且多呈现多药耐药现象.PMQR检测结果表明aac(6′)-Ib-cr基因检出率最高,为76.5%,其次为qnrS,qnrA,qnrD,qnrB,检出率依次为45.7%,34.6%,23.6%,2.5%,未检出qepA基因.QRDR突变分析中,常见的gyrA中Ser83突变为Ile, Asp87突变为Asn或Gly和parC中Ser80突变为Ile均被检测到,突变率分别为84.0%,61.7%和60.5%.而gyrB中Asp426突变为Gly还是首次报道,突变率为35.8%.此外,parC还检测到1株Phe64突变为Pro,2株Gln91突变为His.【结论】江苏泰州地区猪源大肠埃希菌中PMQR基因普遍存在,且QRDR基因突变严重,提示应加强抗生素的合理使用以及对喹诺酮相关耐药基因的监控.     

产肠毒素大肠埃希菌sfmH基因的原核表达及多克隆抗体的制备

以产肠毒素大肠埃希菌F4ac(F4ac~+ETEC)基因组DNA为模板,通过PCR扩增出Sfm菌毛操纵子顶端黏附素sfmH基因,然后将PCR产物插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建出阳性重组质粒pET-28a(+)-sfmH,再将其导入大肠埃希菌BL21中进行诱导表达。通过对IPTG浓度、诱导温度和诱导时间进行探究,发现重组菌在0.8mmol·L~(-1)IPTG、25℃诱导7h时蛋白表达量最高,且重组蛋白以包涵体形式存在,大小约为26ku。将重组蛋白在最优诱导条件下进行大量表达并纯化,利用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获得SfmH多克隆抗体(简称多抗),通过ELISA和Western blot试验对多抗效价和特异性进行鉴定。这一研究构建并获得了高纯度的融合蛋白rSfmH,将其免疫小鼠后成功获得鼠源高免血清,为进一步探究Sfm菌毛的功能奠定了研究基础。     

2种养殖模式下蛋鸭大肠埃希菌毒力基因和耐药特征分析

为比较分析在网床水面圈养与网床全旱养2种不同养殖模式下蛋鸭肠道中大肠埃希菌的毒力基因状况和耐药特征,分别在温州地区选择3家网床水面圈养和3家网床全旱养的蛋鸭场,每个蛋鸭场各选取10只蛋鸭,用棉拭子在直肠中采集微生物,用于大肠埃希菌分离,采用VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定及药敏分析系统对分离株进行鉴定和开展耐药表型分析,并通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增毒力基因、耐药基因和Ⅰ型整合酶基因。结果表明:蛋鸭中大肠埃希菌的分离率为100%;网床全旱养蛋鸭肠道大肠埃希菌的毒力基因eae、ipa H、invE、aggR和pic检出率高于网床水面圈养蛋鸭。对于耐药表型,网床全旱养蛋鸭肠道大肠埃希菌耐药数≥3的菌株比例为23.33%,而网床水面圈养中耐药数≥3的菌株比例为10.00%。同样地,耐药基因和Ⅰ型整合酶基因的检出率也为网床全旱养高于网床水面圈养。10株Ⅰ型整合子阳性大肠埃希菌中4株携带基因盒插入片段,其中:1株来源于网床水面圈养蛋鸭,其大肠埃希菌Ⅰ型整合子基因盒插入的为dfrA12-aadA2;3株来源于网床全旱养蛋鸭,均为dfrA1-aadA1。网床全旱养蛋鸭肠道大肠埃希菌的毒力基因携带率和耐药性表型均高于网床水面圈养蛋鸭,说明养殖模式变化对水禽肠道微生物耐药性可产生一定的影响。     

大肠埃希菌F4菌毛凝集性单抗制备及抗原表位差异

采用杂交瘤单克隆抗体制备技术,获得4株能稳定分泌产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)F4菌毛特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为8EH2、8EH3、9E10、11D4。免疫印迹和凝集反应结果表明:这4株单抗均能与纯化的F4菌毛蛋白发生特异性反应,且与F4大肠埃希菌不同血清型变异株F4ab、F4ac和F4ad发生特异性肉眼可见的凝集反应;而与F18、F6(987P)、F5(K99)产肠毒素大肠埃希菌参考株、分离株以及肠炎沙门氏菌参考株50336、分离株等多种肠杆菌科细菌无任何交叉反应。对单抗亚类的特性检测结果显示,这4株单抗均属于IgG1抗体,且主要识别F4ac的抗原表位,其中,8EH2、8EH3、9E10也能够较好地识别F4ab的抗原表位。结果说明F4菌毛凝集性单克隆抗体为ETEC F4感染的快速特异诊断提供技术基础。     

三株O_(78)、O_(137)混合血清型鸡大肠埃希菌iss基因的序列分析

采用1日龄雏鸡对3株O78、O137混合血清型鸡大肠埃希菌的致病性进行了测定,并扩增了iss基因。结果表明,3株O78、O137混合血清型鸡大肠埃希菌均对1日龄雏鸡具有较强的毒力。iss基因在3株O78、O137混合血清型鸡大肠埃希菌中的序列与已知的禽大肠埃希菌iss基因序列的同源性为100%,与人源大肠埃希菌iss基因序列的同源性为90.9%,显示了此基因的保守性。     

F4菌毛FaeG基因的克隆与序列分析

[目的]克隆F4菌毛FaeG基因,并对其进行序列分析。[方法]利用PCR方法从6株标准F4菌株中扩增FaeG基因片段,测序后用DNAStar软件进行分析和拼接,并与已发表的F4菌毛基因序列进行分析和比较,绘制基因进化树,比较它们之间的同源性和进化关系。[结果]试验成功扩增出FaeG基因片段;所扩增的6株已知血清变异型F4大肠杆菌与标准F4菌株同属于各自基因型,且F4ab与F4ac间的进化关系比与F4ad菌株间的近。[结论]通过该研究可推测F4菌株3个血清变异型的检测不仅可用单因子血清,而且可从DNA水平上进行检测。     

产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检测及耐药性分析

目的:检测临床标本中产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,分析其耐药性,为指导临床合理地选用抗菌素提供可靠的依据。方法:用VITEK-32型全自动细菌分析系统进行细菌鉴定、药敏试验和ES-BLs测定。结果:产ESBLs大肠埃希菌为43.1%,产ESBLs肺炎克雷伯菌为19.4%;2种产ESBLs菌对氨苄西林、头孢唑林等7种抗生素的耐药率为100%,对头孢吡肟、环丙沙星等8种抗生素耐药率为54.5%~85.7%,而对亚胺培南敏感未出现耐药现象。结论:临床标本产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率较高,应限制广谱β-内酰胺类抗生素特别是第三代头孢菌素的使用;亚胺培南可作为治疗产ESBLs菌严重感染的首选药物。ESBLs;大肠埃希菌;肺炎克雷伯菌;耐药性