水貂α-干扰素基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法从体外诱导的水貂外周血淋巴细胞中扩增出水貂的α-干扰素基因(MiIFN-α)。测序结果显示,水貂的IFN-α基因序列全长为564个核苷酸,共编码187个氨基酸,与GenBank上已发表的雪貂的IFN-α核苷酸序列同源性为97.5%,氨基酸同源性为92%。     

3个品种鸡α干扰素基因的克隆与序列分析*

 根据GenBank中鸡α干扰素（IFN-α）基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从鸡肝组织基因组中扩增罗曼鸡、海兰鸡及固始鸡α干扰素基因,并进行克隆和测序。结果表明,获得了3个品种鸡IFN-α全基因序列,长度均为582bp,编码193个氨基酸残基。3个品种鸡IFN-α基因及推导的氨基酸序列比较结果显示,海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因序列完全一致,而固始鸡与海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因核苷酸同源性99.3%,有4个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为97.9％。克隆的3个品种鸡IFN-α基因序列与GenBank上发表的7条鸡IFN-α基因序列进行比较分析发现,核苷酸同源性在98.1%～100%之间,氨基酸同源性在96.9%～100%之间。     

广西鹅α干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank上已发表的东北白鹅α干扰素（IFN-α）基因（AY524422）序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR从经鹅副粘病毒（GPMV）刺激培养的鹅外周血淋巴细胞中克隆获得广西鹅IFN-α基因,将其连接pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞后进行序列分析.结果表明,广西鹅IFN-α基因完整的开放阅读框大小为576 bp,共编码192个氨基酸残基,其推导的氨基酸中有7个半胱氨酸残基和2个潜在的糖基化结合位点（NDT和NHT）.与GenBank上已公布的其他IFN-α基因进行同源性比较分析,发现广西鹅IFN-α基因与东北白鹅的同源性最高（核苷酸同源性为98.3%、氨基酸同源性为96.4%）,与鸡、牛、猪、鼠、犬、人等的同源性较低.说明IFN具有种属特异性,且亲缘关系越近同源性越高,这与物种之间的进化亲缘关系一致.     

牦牛α1-珠蛋白基因的克隆和序列分析

根据α-珠蛋白基因起始密码子上游及终止密码子下游的保守序列设计引物，以牦牛基因组DNA为模板克隆并测定了α-珠蛋白基因序列。结果表明，所测的氨基酸序列与牦牛α-珠蛋白链的氨基酸序列完全相同，即为牦牛α1-珠蛋白基因，长706bp，编码141个氨基酸。通过与其他物种的同源性比较，发现牦牛α1-珠蛋白基因的核苷酸序列与黄牛和水牛的同源性分别为99．71％和98．58％，与山羊、绵羊、人和马的同源性只有96．0：3％、95．57％、68．55％和51．13％；氨基酸序列与黄牛和水牛的同源性分别为99．29％和96．45％，与山羊、绵羊、人和马的同源性只有92．90％、91．49％、87．23％和87．23％，说明牛亚科α-珠蛋白基因在进化上高度保守。同时发现第254位的碱基A为牦牛α1-珠蛋白基因所特有。牦牛的两个α1-珠蛋白基因长度相等，都为706bp，且间距为2．47kb，距离比山羊的远。     

京巴犬α-干扰素全基因的克隆与分子进化分析

根据基因库(CenBank)中收录的犬α-干扰素(IFN-α)基因核苷酸序列(AB102731),设计并合成了1对引物,PCR扩增京巴犬IFN-α全基因,并克隆、测序.结果表明,犬IFN-α基因全基因序列为564 bp,包含1个开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸.序列比较分析发现,京巴犬IFN-α基因序列与GenBank发表的其它品种犬IFN-α基因序列核苷酸同源性为96.3%以上,氨基酸同源性为94.1%以上,其中与AB102731核苷酸同源性最高,为99.5%.仅有3个碱基差异.京巴犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.京巴犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

狸猫α-干扰素全基因的克隆及生物信息学分析

根据猫α-干扰素基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增狸猫α-干扰素全基因,并克隆、测序。用DNAStar软件及在线分析方法对克隆的IFN-α基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行分析,并与人和其他种动物的IFN-α基因进行同源性和进化分析。结果表明,获得了狸猫α-干扰素全基因序列,其大小为631 bp,编码194个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和7个潜在的O-糖基化位点。IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。狸猫IFN-α基因的成功克隆为进一步研究猫IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

3个品种鸡α干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank中鸡α干扰素(IFN-α)基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从鸡肝组织基因组中扩增罗曼鸡、海兰鸡及固始鸡α干扰素基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了3个品种鸡IFN-α全基因序列,长度均为582bp,编码193个氨基酸残基.3个品种鸡IFN-α基因及推导的氨基酸序列比较结果显示,海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因序列完全一致,而固始鸡与海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因核苷酸同源性99.3%,有4个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为97.9%.克隆的3个品种鸡IFN-α基因序列与GenBank上发表的7条鸡IFN-α基因序列进行比较分析发现,核苷酸同源性在98.1%～100%之间,氨基酸同源性在96.9%～100%之间.     

藏獒犬α-干扰素全基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的犬α-干扰素(IFN-α)基因核酸序列(AB102731),设计并合成1对引物,利用PCR技术从藏獒犬肝脏基因组DNA中扩增犬α-干扰素全基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了犬IFN-α全基因序列,其大小为564 bp,包含1个完整阅读框,编码187个氨基酸残基.序列比较分析发现,克隆的藏獒犬IFN-α基因序列与GenBank中5条犬IFN-α基因序列核苷酸同源性在96.8%～99.3%之间,氨基酸同源性在94.7%～98.9%之间,并无插入和缺失变异,但是存在氨基酸点变异.藏獒犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究藏獒犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

山羊抑制素α前体基因5'侧翼区及外显子的克隆与序列分析

[目的]弄清INHα前体基因与山羊繁殖季节性的关系,并研究INHα前体基因进化的保守性。[方法]对常年发情的山羊品种海门山羊和季节性发情的山羊品种安徽白山羊共20只母羊的抑制素0【前体基因（INHα）5’侧翼区和外显子进行了克隆和序列比较分析。[结果]与安徽白山羊相比,海门山羊INHα前体基因存在3个SNP,不存在氨基酸改变,核苷酸同源性为99．7％,氨基酸同源性为100％。在山羊、牛、猪、人、鸡、马、大鼠、狗之间INHα前体基因的核苷酸序列同源性为12．7％-96．5％。[结论]INHα前体基因在物种内趋于高度保守,任何核苷酸和氨基酸的改变都可能直接影响整个基因编码和基因调控能力的改变。     

番鸭IFN-α基因的克隆与序列分析

从经免疫的番鸭外周血分离淋巴细胞，经PHA刺激培养后提取总RNA，采用RT－PCR的方法，按照GenBank中序列号为X84764鸭I型IFN（DIFN1）基因设计引物，成功扩增出番鸭IFN基因，命名为MDIFN－α，包含编码MDIFN－α成熟蛋白全部核苷酸序列。DIFN1开放阅读框架（ORF）有576个核苷酸，编码191个氨基酸，其中切除信号肽的IFN－α为成熟DIFN1，共有486个核苷酸组成，编码161个氨基酸。MDIFN－α（含有不完整的信号肽）与X84764的核苷酸同源性为97．7％，推导氨基酸同源性为95．7％，结果显示，MDIFN－α可能为鸭I型IFN一个新的亚型。     

斗鸡新城疫病毒DQ株融合蛋白基因序列分析

从越南斗鸡暴发的病例中分离出1株新城疫病毒（NDV）,命名为贵州分离株（DQ）。采用RT—PCR方法扩增分离株（DQ）的整个F基因片段,并将其克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明,DQ株F基因分子长为1662bp,编码553个氨基酸。该毒株与国内2株分离株（CH2000、TW2000）之间的亲缘关系较近,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95．7％-96．6％和96．6％-96．8％;但与LaSota、B1及1748E9等常见毒株的核苷酸和氨基酸同源性仅为84．0％-86．5％和87．2％-89．9％。DQ分离株在F蛋白裂解住点的氨基酸顺序为^112R—R—Q—K—R—F^117,与NDV强毒株特征相符,且具有101处的K（赖氨酸）和121处V（缬氨酸）2个特征性氨基酸,与NDV基因Ⅶ型的特性完全相符。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树表明该分离株为基因Ⅶd亚型。     

贵宾犬α-干扰素基因的扩增、克隆与序列分析

参照基因库中收录的犬α-干扰素基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从贵宾犬肝组织基因组DNA中扩增IFN-α基因,将回收得到的特异性片段克隆于pGEM-T Easy载体中,转化感受态细胞DH5α,经蓝白斑筛选,质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性重组质粒,测定其核苷酸序列。测序结果表明,贵宾犬α-干扰素基因全长为564 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸。用DNAStar软件将所得序列与人和其他种动物的IFN-α基因进行核苷酸及氨基酸同源性比较,并通过绘制系统进化树可知,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。     

家蚕ga Pdh基因的克隆及分析

从家蚕EST数据中检索到果蝇（Drosophila melanogaster）甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（AAN09371）氨基酸同源序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕gapdh的cds,用PCR克隆家蚕gapdh基因序列．家蚕甘油醛-3-磷酸脱氢酶（bmga pdh）基因长1485 bp（NO：DQ202316）,包括5′UTR 221 bp,3′UTR 265 bp和完整的999 bp ORF框,编码333个氨基酸残基．用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为91％,与鹌鹑胚胎纤维细胞序列同源性最差,为71％．bmgapdh基因在家蚕基因组中是单拷贝的,包含3个外显子．3′UTR序列包含AATAA终止信号和Poly（A）．推导的氨基酸序列N端包含与NAD^＋结合的保守结构域：ASCTTNCL．     

赤眼鳟线粒体NADH脱氢酶6基因克隆及序列特征分析

[目的]根据赤眼鳟线粒体NADH脱氢酶6（ND6）基因序列分析不同种鱼类的分子进化关系。[方法]根据其他鱼类的线粒体ND6基因及侧翼序列设计引物,采用PCR扩增并克隆、测序赤眼鳟ND6基因,通过MEGA4．0Neighbor—Joining法分析不同鱼类的进化关系。[结果]赤眼鳟（Squaliobarbus curriculus）线粒体基因组ND6基因序列长度为522bp,编码173个氨基酸。该基因碱基组成为：A41．5％、C32．7％、G12．4％、T13．4％,其中A＋T含量（54．9％）高于G＋C含量（45．1％）。将赤眼鳟ND6基因序列与GenBank中其他11种鱼类ND6基因序列进行比对发现,赤眼鳟ND6核酸序列与团头鲂的同源性最高,为90．8％;与红点鲑鱼的同源性最低,为73．0％。赤眼鳟ND6氨基酸序列与其他物种ND6氨基酸进行比对发现,赤眼鳟与团头鲂同源性最高,为98．3％;与大黄鱼的同源性最低,为75．7％。以ND6氨基酸序列采用NJ法构建12种鱼类的系统发生树基本反映了它们的种间、属间和科间的关系。[结论]首次得到了赤眼鳟线粒体ND6基因序列,并确定了赤眼鳟与其他11种鱼类的分子进化关系。     

4个H9N2亚型禽流感病毒毒株HA基因序列比较与分析

[目的]测定H9N2AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律：[方法]参照H9N2亚型禽流感HA基因序列设计1对引物,对禽流感A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）、A／Chiken／Hebei／ZD／04（}19N2）、A／Chicken／Beijing／MY／06（H9N2）和A／Chicken／Beijing／PG／08（H9N2）4个毒株删基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的HA基因序列分剐与GenBank登录的10个H9N2亚型禽流感毒株进行比较分析,[结果]获得了4个毒株圳基因（ORF）全长1683bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92．5％～95．6％和95．2％～96．8％;WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10O个毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82．6％～95．1％、83．O％～99．0％、82．7％～95．5％、81．30％～95．7％、86．6％～96．3％、86．6％～97．9％、87．O％～97．1％、86．9％～97．3．[结论]HA基因在不同毒株间具有很高的同源性.     

猪乳脂肪球表面因子8的克隆与表达分布

基于电子延伸序列,本试验成功克隆了猪乳脂肪球表面因子8（MFGE8）基因（GenBank登录号：EU559724）并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了MFGE8基因的组织分布规律。序列分析结果表明MFGE8开放读码框全长为1296bp,编码431个氨基酸残基的多肽链,克隆的MFGE8基因与人、大鼠、小鼠、牛的同源性分别为71．9％、78．7％、79．1％、87．7％,推测的氨基酸序列的同源性分别为65．7％、74．0％、74．0％、84．5％。氨基酸序列N端含有Notch样“EGF”结构,C端含有FA58C结构域。构建的系统发育树显示猪与牛的亲缘关系最近。组织表达分析结果表明MFGE8在乳腺中表达最高,在大脑中表达量最低。     

广西鹅γ干扰素基因的克隆与序列分析

为进一步研究鹅干扰素（IFN）的分子生物学特性及抗病毒作用机理,提取经刀豆素（ConA）刺激培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增获得鹅IFN-γ基因,将其克隆至pMD18-T载体并进行序列测定分析。结果表明,克隆获得的广西鹅IFN-γ基因与GenBank上已公布的鹅IFN-γ基因核苷酸序列的同源性均高于99.2%、氨基酸同源性均高于98.2%;与其他动物的IFN-γ基因核苷酸及氨基酸序列比较,亲缘关系越远,同源性越低。     

小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α亚基cDNA片段的克隆和序列分析

利用简并引物，采用PCR等分子生物学技术，对小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)α亚基的cDNA片段进行克隆，并对序列进行分析。测序结果显示，扩增的目的基因片段包含了nAChRα亚基的3种亚型（分别命名为Pxαl，Pxα2，Pxα3）。都具有典型的α亚基的结构；2个相邻的半胱氨酸，由2个半胱氨酸之间二硫键形成包含15个氨基酸的胞外环，与烟碱和α银环蛇毒素结合有关的氨基酸残基，克隆的基因片段在氨基酸序列上和其他昆虫nAChRα亚基基因之间有高达65%-99%的同源性，表明克隆的cDNA片段是小菜蛾nAChRα亚基基因的部分序列。     

内蒙古绒山羊MTNR1α盛因外显子2克隆及序列分析

依据已发表的绵羊MTNR1α基因外显予2扩增引物序列。以内蒙古绒山羊基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到824bp的基因序列,将扩增产物进行克隆测序后与GenBank数据库进行序列同源性比较分析。结果表明,绒山羊MTNR1α外显子2扩增序列与已发表的山羊同源性为99．2％,与绵羊、牛、人、鼠同源性分别为98．5％、96．8％、82．O％和78．4％,内蒙古绒山羊MNTR1α基因第2外显子氨基酸序列与已发表的山羊氨基酸序列的同源性为97．7％,与已发表的绵羊、牛、人和鼠的氨基酸同源性分别为94．1％、91．8％、82．2％、83．1％。     

盐芥ThNHX1基因的3’RACE

以盐芥为材料，依据拟南芥AtNHX1基因的序列信息设计引物，扩增出盐芥中ThNHX1基因的部分序列，然后使用快速扩增cDNA3’末端（3’RACE）方法，从盐芥中克隆到ThNHX13’cDNA序列。该序列全长680bp，编码104个氨基酸，其编码序列、氨基酸序列与拟南芥AtNHX1基因的相应序列同源性分别为91％和91．5％，而盐芥ThNHX1基因3’端非翻译区序列与拟南芥相应序列的同源性为68．5％，明显低于编码区。