基于诱变和抗性突变的多杀霉素高产菌株的选育

为提高菌株发酵液中多杀霉素产量,本试验利用常温常压等离子体(ARTP)诱变、紫外(UV)诱变和抗性突变技术处理刺糖多孢菌株DS0322-3,结合高通量筛选和摇瓶发酵选育多杀霉素高产菌株。结果显示,通过ARTP诱变和UV诱变育种,筛选获得384株突变菌株,其中有9株突变菌株的效价较原始菌株增加10%以上,且1株效价较原始菌株增加20%以上,经过ARTP诱变30 s,得到的突变菌株AR1019-4效价为547.78 mg/L,较原始菌株增加了21.88%。以ARTP诱变得到的高产突变菌株AR1019-4为出发菌株,通过抗性突变筛选技术筛选获得1 152株突变株,其中13株突变菌株的效价较出发菌株增加10%以上,且2株效价较出发菌株增加15%以上,在0.5 mg/L的氯霉素平板上得到的突变菌株Chl 1215-5效价为637.12 mg/L,较出发菌株增加了16.31%;12 mg/L的庆大霉素抗性突变筛选到了突变菌株Gen 1207-8,效价为597.59 mg/L,该菌株的Spinosyn D组分由10%～15%增加至30%～35%左右,经遗传稳定性试验验证,突变菌株Chl1215-5和Gen1207-8可稳定遗传。试验结果表明ARTP诱变、紫外诱变和抗生素突变技术对选育多杀霉素高产菌株具有重要意义。     

木霉菌素产生菌的诱变育种

[目的]筛选高产木霉菌素菌株,提高木霉菌素产量。[方法]以从枸骨中分离到的产木霉菌素的内生真菌———哈茨木霉为出发菌株,进行紫外线二次复合诱变处理,将筛选出的突变菌株连续转接5代,测定其遗传稳定性。[结果]随着照射时间的延长,哈茨木霉的致死率增大,选取致死率为88.1%的紫外线照射45 s作为最适处理剂量进行诱变育种。经过2次诱变的菌株的产孢时间提前,长出的菌落更为致密。经过初筛和复筛,最终获得1株高产突变株UV-5-3,其产抗生素的水平最高,为164.75μg/m l,比初次诱变筛选获得的突变株UV-3-1提高了56.77%,是出发菌株的2.3倍。传代试验表明,突变株UV-5-3的高产性能遗传特性稳定。[结论]利用紫外线二次复合诱变处理哈茨木霉可以获得高产木霉菌素菌株。     

紫外线诱变选育高产醋酸的醋酸菌研究

[目的]选育适合酿造杏渣醋的高产醋酸的醋酸菌株.[方法]对初始醋酸菌C1-0的生长曲线进行测定,对处于对数期的C1-0进行紫外线诱变,使诱变菌株的致死率达85;～90;,以产酸量为指标,选育高产醋酸的醋酸菌菌株,通过初筛和复筛,选育高产醋酸的醋酸菌菌株,并将其进行传代培养,测定产酸的稳定性.[结果]采用紫外线对培养至24h的初始菌株C1-0照射20s,使其致死率达到88.72;,获得了3株高产醋酸的醋酸菌突变株C1-11、C1-27、C1-30,产酸量分别达到37.29、38.80和36.60g/L.这3株突变株传代5次,产酸量变化幅度较小.[结论]通过紫外线诱变的方法获得三株高产醋酸的醋酸菌株C1-11、C1-27、C1-30,比初始菌株C1-0产酸量分别提高4.5;、8.6;、2.6;,且遗传稳定性较好.     

复合诱变选育高产纤维素酶黑曲霉菌株

[目的]选育高产纤维素酶生产菌。[方法]以1株黑曲霉(Aspergillus niger F1)为出发菌株,经过紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯诱变处理,选育出1株纤维素酶高产菌株生产菌。[结果]在适宜条件下,选育得到的菌株D3产CMC活力为出发菌株的145.5%。[结论]NTG、DES和紫外线作用机理不同,但都能对微生物细胞中的DNA造成突变,使其具有新的特性。     

壳低聚糖高产菌的诱变选育

[目的]探讨壳低聚糖高产菌诱变选育的方法。[方法]以壳低聚糖产生菌蓝色犁头霉ZH08为出发菌株,经紫外诱变和亚硝酸诱变处理,以对硝基乙酰苯胺为指示剂,利用双层平板颜色反应法,挑取菌落黄色比较深的脱乙酰酶高活性突变株,再经摇瓶发酵复筛,以获得壳低聚糖产量较高的菌株。[结果]通过对出发菌株ZH08进行理化诱变,获得突变株共7株（XH01～07）,经过反复传代和筛选,这几株突变株的壳低聚糖含量均高于出发菌株,其中XH05菌株的壳低聚糖含量最高,其产量稳定在1.07 g/L,比出发菌株提高72.6%。[结论]利用对硝基乙酰苯胺作为筛选具较高甲壳素脱乙酰酶酶活的跟踪试剂,用于筛选壳低聚糖高产菌株,是一种快速、有效的筛选方法。     

紫外诱变结合链霉素抗性选育小诺霉素高产菌株

以自然筛选的小诺霉素产生菌XDBJ-CF为诱变选育的出发菌株,经最适照射剂量60 s的紫外诱变后,在含20μg/mL链霉素的高氏平板上培养,获得链霉素抗性突变株。突变株摇瓶初筛试验显示,高产突变株的数量大于低产突变株。从正突变株中挑选相对发酵单位130%以上的16株高产突变株进行摇瓶复筛,获得2株小诺霉素高产突变株XDBJ-CF-09-24、XDBJ-CF-09-90,其小诺霉素产量分别比出发菌株提高37.8%和46.3%,C_2b组分分别较出发菌株提高10%和20%。     

YAG激光对番茄早疫病菌拮抗菌WB7的诱变效应

[目的]探明YAG激光对枯草芽孢杆菌WB7诱变作用。[方法]采用YAG激光(波长1060 nm,功率7 W)照射1株对番茄早疫病菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌WB7,综合各辐照时间组里菌株致死率和正变率的大小以及拮抗能力提高程度,分析不同辐照时间对WB7生长以及诱变的影响效果。采用连续传代培养,测定正变株拮抗能力的遗传稳定性。[结果]利用YAG激光辐照枯草芽孢杆菌对WB7有显著的诱变效应,不同辐照时间的诱变率有显著性变化,辐照1.5 min诱变作用最强,且正变率最大;筛选的最佳突变株WB7-L1.5’5高抗番茄早疫病菌,经过7代传代试验证明其可稳定遗传。[结论]该研究建立了YAG激光诱变枯草芽孢杆菌WB7的试验体系,对番茄早疫病的生物防治具有广阔的应用前景。     

原生质体紫外诱变选育普鲁兰酶高产菌株

[目的]对酸性普鲁兰酶产生菌的原生质体制备条件及诱变育种进行研究。[方法]对盐球菌（Halococcus sp.）Z1的原生质体制备和再生条件进行了研究,并对其原生质体进行紫外诱变选育普鲁兰酶高产菌株。[结果]菌体经培养14 h后,在36℃、2.8 mg/ml溶菌酶作用下酶解1.5 h,其原生质体形成率和再生率分别为87.4%和19.4%。采用紫外线对原生质体进行诱变,筛选得到9株普鲁兰酶活性比出发菌株高的突变株,其中D9-08的酶活达6.37 U/ml,比诱变前提高了0.96倍,经10次传代遗传性稳定。[结论]利用原生质体紫外线诱变手段进行酸性普鲁兰酶产生菌的育种是一条可行并具有较好效果的途径。     

复合诱变选育高产纤维素酶绿色木霉菌株

[目的]选育高纤维素酶活的绿色木霉菌株。[方法]以一株绿色木霉F1为出发菌株,以每一轮诱变处理筛选到的酶活最高的突变株作为下一轮诱变的出发菌株。经过紫外线、亚硝基胍（NTG）、硫酸二乙酯（DES）诱变处理。计录菌落数,计算致死率并测定CMCase的酶活。[结果]紫外线处理200 s时,孢子的致死率接近100%。U1突变株的相对酶活最高,为出发菌株F1的110.4%。NTG处理50 min时,孢子的致死率接近100%,N4诱变菌株的相对酶活最高,为出发菌株F1的128.9%。DES处理50 min时的诱变致死率接近100%,D8菌株的配对酶活最高,相对酶活为出发菌株F1的140.6%。[结论]得到了一株产酶量高且性状稳定的高产绿色木霉菌株D8,其CMCase相对酶活较出发菌株F1提高了40.6%。     

利用常压室温等离子体诱变选育三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素产量差异菌株

为筛选β-胡萝卜素产量差异菌株,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,简称ARTP)诱变三孢布拉氏霉菌孢子,研究不同处理时间对三孢布拉氏霉菌存活率的影响,建立有效的筛选方案,经由洛伐他汀筛选,菌丝产生不同的颜色差异,初步获得β-胡萝卜素产量差异菌株。结果表明,随着ARTP诱变处理时间的增加,其致死率逐渐增高,较为理想的处理时间为160～200 s;洛伐他汀扩大了突变体之间的颜色差异,促进了正突变株的产生;传代并纯化突变体,获得洛伐他汀筛选菌株10株,其中深黄4株、黄色3株、浅黄2株、白色1株,正突变菌株β-胡萝卜素产量上升48.6%,负突变株产量下降16.5%。     

絮凝剂高产菌株的离子注入诱变选育

[目的]提高生物絮凝剂的絮凝活性。[方法]以絮凝剂产生菌FJ-15为出发菌株,采用低能N＋注入的方法对其进行诱变处理,从突变体中筛选高絮凝活性、性能稳定的菌株,并检测其絮凝活性。[结果]N＋注入剂量为2×10^14ions/cm^2时,菌株存活率较低,随N＋注入剂量增加,菌株存活率呈上升趋势,当N＋注入剂量为8×10^14ions/cm^2时,菌株存活率最高（75.34%）,当N＋注入剂量为1×10^16ions/cm^2时,正突变率较大;通过初筛试验,得到了193株正突变菌株;通过复筛试验,得到了3株高絮凝活性的菌株FJM-10、FJM-19、FJM-29,其絮凝率分别为93.81%、86.64%、83.65%,平均较原菌株的絮凝活性（64.55%）高20%左右。其中,FJM-10菌株的稳定性最好,絮凝活性最高。[结论]FJM-10菌株的最佳发酵碳源和氮源分别为葡萄糖（或麦芽糖）和蛋白胨（或尿素）。     

三重诱变选育腈水合酶高产菌株

[目的]获取高产的腈水合酶产生菌。[方法]以腈水合酶产生菌诺卡氏菌（Nocardia sp.）为出发菌株,采用加热、紫外线（UV）照射、硫酸二乙酯（DES）处理三重复合诱变,研究不同诱变剂量对致死率和正突变率的影响,选育腈水合酶高产菌株,并研究底物类似物乙腈对该菌株腈水合酶活性的影响。[结果]从中筛选出1株稳定、高活力的腈水合酶生产菌,所产腈水合酶最高活性提高到1 238万U。在一定浓度下,随着底物类似物乙腈浓度的增大,菌株正突变率和所产腈水合酶最高酶活增大,但超过一定浓度后正突变率和最高酶活反而下降。[结论]获得了1株稳定的腈水合酶高产菌株,所产腈水合酶活性高达1 238万U。底物类似物乙腈对该菌株的正突变率和所产腈水合酶最高酶活性有一定的影响。     

豆豉纤溶酶高产突变株的选育

[目的]从豆豉中筛选出高产纤溶酶的菌株,并通过平板筛选得到高产突变株。[方法]从6种不同豆豉样品中,筛选得到具有较高纤溶酶活性的菌株,采用物理化学诱变方法进行复合诱变,再利用纤维蛋白平板对诱变后菌株进行筛选。[结果]得到1株高纤溶酶活力菌株,命名为DC-YC41,酶活达到742 IU/ml。[结论]初步判断,得到的这株高纤溶酶活力菌株为枯草芽孢杆菌。     

蛋白酶高产菌株的紫外诱变选育

［目的］提高地衣芽孢杆菌B7的产蛋白酶能力。［方法］采用福林酚法测定酶活力,通过诱变育种试验和遗传稳定性试验选育出遗传性能稳定的蛋白酶高产菌株。［结果］紫外线照射时间为2 min,菌落的总致死率为62.47%。371株菌株的HC值变化小于5%,53株菌株的HC值正变大于5%,76株菌株的HC值负变大于5%。正变大于10%的12株菌株的HC值是出发菌株的1.18-1.34倍。所有变异株的蛋白酶活力均显著高于出发菌株,其中菌株B720和B749的蛋白酶活力达50 U/ml,比出发菌株提高了40%以上。经过复筛得到菌株B7 49,诱变前后其最高酶活分别为33.97和50.29 U/ml。遗传稳定性试验中菌株B749的蛋白酶活力变化小于10%。［结论］该试验成功选育出的遗传性能稳定的蛋白酶高产菌株B749可用于发酵法制备大豆肽。     

60Co γ射线辐照选育阿维链霉菌及辐射效应研究

[目的]采用60Coγ射线辐照选育阿维链霉菌,筛选B1a产量提高的突变菌株。[方法]用60Coγ射线作为诱变源,在辐照剂量200～1 600 Gy、剂量率10 Gy/min的条件下对一株未经任何诱变的微生物农药阿维菌素菌株Av2进行了诱变改良;对该菌株的致死率、突变率、菌落形态变化与60Coγ射线辐照剂量的关系进行了探讨,其中初筛采用抑菌圈法,复筛采用摇瓶培养发酵,阿维菌素含量测定采用高效液相色谱法。[结果]在800 Gy辐射剂量下得到了Av2-m212、Av2-m245和Av2-m286 3株高效突变菌,其Bla产量分别比原始菌株提高了36%、41%和46%,均属于皱缩型菌株。高于30%的正突变菌均在800 Gy辐射剂量下产生,该剂量点是致死率和正突变率趋于平稳的交叉点。辐照后皱缩型和火山型突变菌有正突变菌,其他形态菌株均为负突变。[结论]60Coγ射线在阿维菌素产生菌的诱变筛选中起到了重要作用,是一种非常有效的微生物诱变育种方法。     

TiCl_3法快速筛选L-苹果酸高产突变株

[目的]探讨并验证TiCl3法筛选L-苹果酸高产突变株的可行性。[方法]将34株米根霉诱变株及出发株(CK)分别接种到含葡萄糖的发酵培养基中发酵96 h,发酵液经稀释后加入TiCl3,根据沉淀发生情况,筛选L-苹果酸高产突变株。[结果]当发酵液稀释40倍时,有4株诱变株发酵液产生沉淀,而出发株发酵液未产生沉淀。据此筛选出4株发生显著正突变的诱变株,其L-苹果酸产量约为16~20g/L。其发酵液经HPLC测定分析,表明4株突变株发酵液中L-苹果酸的产量为15.88~18.26 g/L,而出发株L-苹果酸产量为11.76 g/L,突变株L-苹果酸产量增幅达35%~55%。[结论]TiCl3法可有效应用于L-苹果酸高产突变株的筛选。     

拟南芥二氧化碳突变体生理特性的分析

[目的]对2个已获得的拟南芥突变体：二氧化碳敏感突变体（cds1）和二氧化碳不敏感突变体（cdi1）进行一些生理特性分析,寻找它们同野生型之间的差异表型。[方法]利用表皮条生物学试验方法对拟南芥野生型和突变体叶片进行气孔开度、气孔密度和叶片失水率测定,同时采用培养基中添加脱落酸（ABA）、甘露醇（Man）和NaC l作为胁迫处理测定种子萌发率。[结果]2个突变体气孔密度同野生型基本一致,而气孔开度和叶片失水率则有明显差异。此外,种子萌发试验也表明cdi1对外源ABA、甘露醇和NaC l不敏感,而cds1则刚好相反。[结论]2个突变体同野生型之间生理特性存在一定的差异。     

三系水稻保持系航天育种的研究

[目的]研究三系水稻保持系航天诱变突变株的育性变化情况。[方法]以籼型水稻单株纯系品种特B、湛B、双青B和II-32B的种子为材料,各品种取1/2种子进行航天诱变,余下1/2种子为对照,研究航天诱变突变株测交和回交后代的性状表现及遗传变异。[结果]4个保持系突变株测交后代可育花粉率变幅为0~25.6%,回交一代可育花粉率变幅为0~72.2%。各突变株测交后代自交结实率变幅为0~8.2%,突变株对不育系的不育性保持能力表现出一定的下降趋势;回交后代自交结实率与对照差异显著,II-32A×II-32B3-1的后代自交结实率最高,为33.4%。回交后代农艺性状与对照的差异比上一代更明显。[结论]三系水稻保持系航天诱变突变株回交后代的育性有较大变化。