噬菌体P1侵染大肠杆菌Nissle1917(EcN)机理研究

[目的]找出噬菌体侵染大肠杆菌的位点。[方法]选择血清型为O6∶K5∶H1的大肠杆菌Nissle 1917(Ec N)作为试验菌株。通过λ-RED系统,突变其K抗原和O抗原合成基因,通过检测P1转导至这一系列突变株的转导效率来确定P1的侵染位点。[结果]双突变株Ec NΔkfi AΔwaa G::Cm具有最高的转导效率。kfi A基因突变导致了K抗原缺失,waa G基因突变导致了LPS核心寡糖中第2位庚糖(HepⅡ)的暴露,使得P1更容易接触到HepⅡ,从而侵染细菌。[结论]研究认为HepⅡ很可能就是噬菌体P1的识别位点。     

鸡大肠杆菌荚膜多糖——蛋白质抗原免疫原性的研究

用碳化二亚胺作为交联剂将荚膜多糖与载体蛋白质交联后加入蜂胶佐剂制成疫苗免疫鸡只。７周龄同源菌株攻毒结果表明，荚膜多糖－破伤风类毒素苗组鸡有很好的保护效果且试验重复性好；在免疫后３个月的同源攻毒保护指数也达１３／２０以上。但对异源菌株的攻毒没有明显保护效果。该研究采用微量法间接血凝试验检测了免疫鸡抗体水平。     

E.coli Nissle 1917(EcN)curli菌毛和鞭毛对其生物被膜形成的影响

E.coli Nissle 1917是被广泛认可的益生菌,可以通过形成生物被膜定殖在肠道中抑制沙门氏菌等病原菌的生长.通过λ-Red同源重组系统构建curli菌毛合成基因(csgA)和鞭毛调控基因(hnsA)突变菌株,探究curli菌毛和鞭毛对EcN生物被膜形成的影响.结果表明,curli菌毛对EcN运动能力以及生物膜形成没有影响;EcNΔhnsA菌株的运动能力下降,生物被膜含量升高,说明鞭毛通过促进EcN运动,抑制细菌的附着,从而抑制生物膜的形成.     

鸡病原性大肠杆菌（O2）亚单位疫苗的研究

试验提取并纯化了鸡病原性大肠杆菌血清型（Ｏ２）的菌毛，并电镜观察了菌毛及菌毛表达。提取了鸡病原性大肠杆菌血清型（Ｏ２）荚膜多糖及菌体可溶性蛋白质，电镜观察了提取过程中荚膜、细胞壁以及胞内物质等细菌结构变化。将提取的菌毛、荚膜多糖和灭活的菌体作为抗原、蜂胶作佐剂，制成蜂胶疫苗，免疫鸡只，于７周龄进行同尖毒保护试验，从保护指数、细菌分离和病变级数三方面比较了３种疫苗的免疫效果，试验结果表明：荚膜疫苗效     

大豆24 kDa油体蛋白基因在大肠杆菌中的表达

 分别构建了含全长大豆24 kDa油体蛋白基因、与大肠杆菌热敏毒素B亚基和定居因子CS6 B亚基基因以串联方式融合的全长大豆24 kDa油体蛋白基因、缺失N端74个氨基酸编码序列的油体蛋白基因及缺失C端152个氨基酸编码序列油体蛋白基因等4个大肠杆菌表达载体。除N端缺失的油体蛋白基因外,其它3个载体的IPTG诱导表达产物对E.coli生长表现出明显的抑制作用,菌液浓度与对照菌株相比,至少降低了3倍;而N端缺失了222个编码核苷酸的油体蛋白基因则对宿主细菌细胞的生长繁殖不再表现有任何毒性。进一步通过SDS-PAGE和Western印迹反应检测各表达载体的IPTG诱导表达产物时发现,仅有N端缺失的24 kDa油体蛋白基因片段在宿主细胞BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中有重组油体蛋白积累。     

紫外诱变选育大肠杆菌营养缺陷型菌株的研究

营养缺陷型是一种生化突变株,它的出现是由基因突变引起的。营养缺陷型菌株在遗传学、食品生物技术、微生物代谢等领域的研究中均具有重要作用,另外它还是研究基因的结构与功能的常用材料。该研究以大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α为实验材料,利用紫外线(UV)对其进行诱变,并且采用青霉素法浓缩营养缺陷型细菌,采用逐个测定法检出营养缺陷型,利用生长谱法对缺陷型菌株进行鉴定、分析,得到了4株稳定的营养缺陷型突变株,分别为赖氨酸、组氨酸、精氨酸和嘧啶营养缺陷型菌株。     

鸡致病性大肠杆菌O78菌株iss基因的克隆与测序

对1株O78血清型鸡源致病性大肠杆菌采用PCR方法检测iss基因的存在。结果显示,鸡E.coliO78菌株携带iss基因,但采用目前通用的PCR方法并不能检测出iss基因,必须经套式PCR扩增才能检测出来。O78菌株所携带iss基因的序列与已知禽大肠杆菌iss基因序列同源性为99.4%,与人源大肠杆菌iss基因同源性为90.3%,与λ噬菌体bor基因序列同源性为87.7%,显示了该基因的保守性。     

蜘蛛丝蛋白基因的合成及其串联体在大肠杆菌中的表达

赋有许多独特性能的天然蛋白质纤维--蜘蛛丝在生物医学、材料和军事等领域具有广泛的应用前景，但惟有通过基因工程手段才能大量获取。根据已报道的蜘蛛丝蛋白的氨基酸序列，结合蜘蛛丝蛋白的模块结构特性和功能的关系，优化设计并人工合成了全长为429bp的蜘蛛丝蛋白基因SPS。将该基因克隆到质粒pET-32a中，构建成表达载体pET-SSPS1，并进一步构建了它的多个串联体表达载体pET-SPS（2～8）。所有表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了诱导表达，重组蜘蛛丝蛋白得到了纯化。结果表明，合成的蜘蛛丝蛋白基因与预期一致，融合表达的蜘蛛丝蛋白几乎全部可溶。其中，1-3串联体蜘蛛丝蛋白基因能够有效表达，但随着串联数的进一步增加，蜘蛛丝蛋白基因融合表达效率下降，初步探讨了下降的可能原因。     

大肠杆菌新菌毛抗原的研究—Ⅳ菌株的致病作用检验

应用消化道接种途径，测定了产生Ｆ１９８７新菌毛抗原大肠杆菌菌株对貂、兔、犬、猪、貉子的致病作用，同时对貉子进行了静脉，肌肉接种的感染试验，结果初步表明：供试菌株仅引起了貉子明显发病，经消化道接种能引起腹泻并随粪便向外界排菌，剖检可见出现眼观，组织学及超微结构的病变，且在肠道内容物中能回收到原感染菌。     

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

对已构建的重组质粒ｐＸＳＴ１进行了核苷酸序列分析和免疫原性研究。序列分析结果表明，该粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫实验结果表明，构建的ＤＨ５α重组菌株安全无毒。     

猪源ETEC的黏附素基因克隆与原核表达

[目的]克服传统方法制备黏附素抗原的缺点。[方法]应用PCR对猪源性产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的黏附素F4、F5和F6的质粒中扩增出faeG、fanC和fasG基因片段,克隆测序并与pET 32a(+)构建重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli表达菌株BL21(DE3),并分析其免疫原性。[结果]重组表达载体经IPTG诱导获得高效表达。血凝抑制试验表明,鼠抗血清能抑制标准的ETEC强毒株凝集红细胞,抑制效价在1∶128以上。这说明克隆表达的猪源ETEC黏附素蛋白具有良好的免疫原性。[结论]该研究可为进一步开发抗体制剂奠定基础。     

猪场大肠杆菌耐药性的流行病学调查

按照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的K irby-Bauer药敏纸片法,对从2个猪扬分离到的大肠杆菌进行了17种抗菌药物的敏感性测试.结果显示,从用药习惯和用药频率存在较大差异的新旧2个猪场分离到的大肠杆菌对这些抗生素的耐药情况比较接近,对大部分抗生素仅为程度上的差别.表明细菌耐药性形成有其特定规律,对某些抗生素的耐药性一旦形成,很难恢复到敏感状态.药物使用频率与多重耐药细菌的出现有直接的关系.     

食源性大肠杆菌耐药性检测

采用美国临床实验室标准化委员会(National Committee of Clinical Laboratory Standard 简称NCCLS)推荐的琼脂稀释法,以大肠埃希氏菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212和金黄色葡萄球菌ATCC29213为质控菌株,对411株分离自鸡肉和凉拌菜的大肠杆菌进行了6大类共12种抗生素的药敏性检测.结果表明受试菌株对四环素的耐药率(98.3%)最高,其次是链霉素(71.3%)、奈定酮酸(68.4%)、阿莫西林(67.6%)、氨苄青霉素(61.8%)、环丙沙星(50.6%)、氯霉素(48.4%)、卡那霉素(40.6%)、庆大霉素(36.7%),所有受试菌株对阿米卡星的敏感性最强,仅有11.9%(49)的耐药率,其次是头孢西丁(14.1%)和头孢哌酮(29.9%).247(60.1%)株分离菌表现5重以上耐药性,其中鸡肉分离株占236株.     

牛产肠毒素性大肠杆菌病病原的分离与鉴定

黑龙江省安达市某牛场二月份发生牛腹泻,采集病牛腹泻物进行细菌分离培养,涂片、染色、镜检观察,并对其形态特征、培养特性、生化特性、药物敏感性及致病性等生物学特性进行研究。结果表明引起该病的病原是产肠毒素性大肠杆菌。该菌株对环丙沙星、阿莫西林、羧苄青霉素等高度敏感,而对链霉素、四环素、土霉素等表现耐药性。     

透明颤菌血红蛋白基因的植物化改造合成及其在大肠杆菌中功能的鉴定

 根据透明颤菌血红蛋白（VHb）的氨基酸序列，按照植物偏爱密码子，对透明颤菌血红蛋白基因（vgb）进行优化改造，同时考虑到可实现分别克隆拼接的酶切位点，设计并合成了22条单链DNA短片段，通过拼接获得了全长450 bp的透明颤菌血红蛋白基因vgbM，并将其克隆至pUC19上，获得重组质粒pGSVHB。利用设计的引物，通过PCR在vgbM基因的5′端引入NcoⅠ位点，将其克隆到原核生物高效表达载体pBV221上，获得质粒pBV221SVHB。转化E.coli. BL21并经热激诱导表达后，在培养物中检测到了约16 kD的VHb蛋白。经CO差示光谱分析测定，该蛋白具有生物活性。为透明颤菌血红蛋白基因vgbM在植物基因工程研究中的应用奠定了基础。     

肉鸡HSP70的基因克隆、原核表达及单克隆抗体制备

 【目的】制备高特异性的肉鸡热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）单克隆抗体,研究肉鸡HSP70与热应激损伤的关系。 【方法】 利用RT-PCR方法扩增肉鸡HSP70 mRNA,将其扩增产物克隆到PGEM-T Easy 载体和原核表达载体pET-28a(+)上,进一步转化至大肠杆菌BL-21中,用IPTG诱导表达重组肉鸡HSP70。以纯化的重组肉鸡HSP70制备多克隆抗体,免疫印迹分析说明重组肉鸡HSP70具有很好的免疫原性。以纯化的重组肉鸡HSP70免疫Balb/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。【结果】获得2株分泌肉鸡HSP70单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步通过免疫印迹分析筛选出1株高特异性的肉鸡HSP70单克隆抗体,命名为BH70-1。 【结论】免疫组织化学结果显示,单克隆抗体BH70-1是一种理想的抗体。     

乳糖诱导酸性木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

[目的]以融合酸性木聚糖酶基因的大肠杆菌（E．coli）B121（DE3）为研究对象,研究以乳糖作为诱导剂时重组目的产物的表达规律。[方法]以重组木聚糖酶比酶活为评价指标,利用单因素试验和k（3。）正交试验考察摇瓶发酵条件下诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间和诱导培养温度对木聚糖酶表达的影响。[结果]各因素影响程度依次为：诱导时机〉诱导温度〉诱导时间〉诱导剂浓度;最优表达条件为：诱导剂浓度5∥L、诱导时机0．5h、诱导培养时间4．5h、诱导培养温度32℃;在此工艺条件下,重组木聚糖酶比酶活可达49．69U／mg。[结论]乳糖作为诱导剂能够成功诱导酸性木聚糖酶在大肠杆菌中的表达。     

猪A组轮状病毒Vp7基因与双标记表达载体pW425et的重组及在大肠杆菌中的表达

以猪A组轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了981 bp的Vp7基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,构建出克隆质粒pGEM-T-Vp7。以SacⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM-T-Vp7及双标记表达载体pW425et,并将纯化的Vp7基因亚克隆至双标记表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-Vp7。将pW425et-Vp7转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态Escherichia coliX13中,经生长功能弥补筛选阳性克隆和SDS-PAGE分析,可见约40 kD的融合蛋白。Western blot分析表明该蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性。     

乙脑病毒E蛋白中和表位与结核杆菌hsp70 在大肠杆菌中的融合表达

根据大肠杆菌偏嗜性密码子原则,人工合成了乙脑病毒E蛋白C末端的中和表位,位于E蛋白上373~399 aa,通过EcoRⅠ和HindⅢ连接构建原核表达载体pET-32a-epitope。将hsp70通过HindⅢ和XhoⅠ连接到载体pET-32a-epitope上中和表位的3′端,构建融合表达载体pet-32a-epitope-hsp70。诱导表达后,将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE,结果表明该融合蛋白以包含体形式存在。将包含体在8 mol/L的尿素中过夜溶解,然后将上清过柱,获得良好的纯化结果。融合蛋白的分子量为94 kD。Western blot显示该蛋白兼具对JEV和结核杆菌热休克蛋白70(M.Thsp70)的特异抗原性。     

K88菌毛基因的克隆及ST表位序列在菌毛基因上的融合

[目的]为了建立用于细胞表面展示的载体系统。[方法]利用PCR技术,以大肠杆菌质粒为模板扩增K88菌毛操纵子的结构基因faeC~faeH,并克隆到pBR322质粒载体中。合成一段替换序列,在菌毛抗原基因的超变区引入酶切位点ApaI和NcoI,合成耐热肠度素STII表位编码序列,并引入菌毛抗原基因的超变区。[结果]经PCR鉴定和限制性内切酶酶切证明,重组质粒pBR-fae插入片断大小为6.6kb,与预期相符。核苷酸序列分析证明,所得faeC~faeH序列正确。PCR筛选和测序验证证明,构建了K88菌毛-耐热肠度素STII的融合基因。[结论]试验成功获得了重组质粒pBR-fae-ST。