抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C7重轻链可变区基因的克隆及序列分析

应用分子生物学技术，从分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1C7中提取总RNA，经反转录，PCR扩增及克隆，分别得到VH基因及VL基因。序列测定结果表明：1C7的VH基因为368bp,VL基因为323bp。用NCBI GenBank分析表明，VH和VL均符合小鼠抗体可变区特征，为功能性重排的抗体可变区基因。根据Kabat分类体系，1C7的VH基因中的VH基因片段隶属于抗体重链第7183家族，其VL基因中的VL基因片段隶属于抗体K轻链20家族，VH基因由VH76－1BG－DFL16．1－JH4重排而形成，VL基因由KVbw20-JK2重排而形成。1C7的VH和VL基因的克隆为抗FMDV scFv的构建与表达奠定了基础。     

鸡源 Bursin-ScFv 噬菌体展示文库的构建及初步筛选

本研究利用抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体免疫SPF来航鸡,获得产生抗独特型抗体的脾细胞,从中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链.以cDNA第一链为模板,根据来航鸡 IgG 抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因FR设计引物,进行PCR扩增.在体外扩增出该抗体的可变区VH和VL基因(大小分别约为370和320 bp).通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VL ScFv,将ScFv DNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素独特型抗体全套单链噬菌体抗体库.并测得该库容量约为5×105,噬菌体中ScFv基因的插入率为80%,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为1011PFU/mL的初级噬菌体抗体库.用抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛,出现特异性富集.经ELISA、动物试验表明所筛选的5个阳性克隆可与抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)特异性结合,并能促进抗体的生产.     

抗隐孢子虫子孢子表膜单链抗体基因的克隆和核苷酸序列分析

应用RT－PCR技术，从分泌具有抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞3D6中扩增出抗体VH和VL基因，用linker(Gly4Ser)3基因，将VH和VL基因连接成ScFv基因，并将其克隆至pMD-18T载体中。经核苷酸序列分析证实，VH、VL基因和linker基因拼接正确，基因全长为720bp。经计算机分析，VH和VL基因均为新发现的基因序列，符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A）和轻链κⅢ家族。     

抗ICAM-1单链抗体基因的克隆及序列分析

应用 RT- PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 ICAM- 1单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 F12中 ,扩增出抗体VH和 VL 基因 ,用 linker(Gly4 Ser) 3基因 ,将 VH和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆到 p MD18- T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 74 4 bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排鼠抗体可变区基因特征。 VH和 VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 (B)和轻链к 家族     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体的基因克隆及核苷酸序列分析

应用 RT-PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 ( Mc Ab)的杂交瘤细胞 2 E3中 ,扩增出抗体 VH 和 VL 基因 ,用 linker( Gly4Ser) 3基因 ,将 VH 和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆至 p GEM-T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 72 6bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH 和VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 ( B)和轻链κ 家族     

抗脂肪细胞特异膜蛋白单链抗体基因的克隆及序列分析

从分泌抗40ku脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取纯化mRNA，经RT—PCR扩增抗体轻、重链可变区基因，然后与Linker连接组装成单链抗体基因(scFv)。结果，成功地构建了scFv基因，其排列方式为VH—linker—VL。经序列分析表明，scFv基因全长741bp，VH基因全长369bp，VL基因全长327bp。抗脂肪细胞膜蛋白单链抗体基因的构建为进行该抗体基因的表达奠定了基础。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子表膜单链抗体基因的构建

应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子表膜抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,再通过重叠延伸拼接（Splice overlap extension）PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入连接肽（Gly4Ser）3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至pMD18-T载体中进行测序。经测序,基因全长为744bp,编码248个氨基酸残基;经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。结果表明,成功构建了抗堆型艾美耳球虫子孢子表面蛋白抗体的ScFv基因。     

抗猪脂肪细胞膜抗体库的构建

通过免疫方法降低猪脂肪含量、提高胴体品质成为人们研究的一个新课题,噬菌体展示技术的完善与发展为实现这一研究目的提供了条件,成为制备高亲和性抗体的有力工具。用猪脂肪细胞免疫小鼠,提取mRNA,反转录成cDNA。通过PCR扩增出重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL,再用编码(Gly4Ser)3的Linker将VH、VL连接在一起,克隆入pCANTAB5E中,转化大肠杆菌,经辅助噬菌体M13K07超感染,构建噬菌体抗体库并进行筛选。     

鸡源抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒单链抗体文库构建及筛选

为构建鸡源抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-4)单链抗体(scFv)文库并筛选出具有高亲和力的单链抗体。本研究从FAdV-4免疫鸡的外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法分别扩增出鸡抗体的VH和VL基因,通过Linker接头将VH和VL基因连接成scFv,将scFv基因连接至噬菌粒载体pComb3XSS中,构建单链抗体文库,通过噬菌体展示技术筛选抗FAdV-4单链抗体,并采用Phage ELISA方法检测抗体的亲和力。结果成功构建鸡源抗FAdV-4单链抗体文库,库容量为9.5×10~(10) PFU/mL,通过4轮"吸附-洗脱-富集"筛选,最终鉴定出1株与FAdV-4具有较高的亲和活性的单链抗体。该研究结果为进一步研究FAdV-4抗体奠定了基础。     

一步法扩增IBDV上海株全长基因组cDNA

为了研究鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）上海株的全部核苷酸序列，应用蛋白酶K消化、割胶纯化获得了高纯度的dsRNA，应用随机引物合成了cDNA的第一链。参照基因库中相关IBDV毒株的基因序列，设计合成了两对引物，一步扩增出IBDV上海株全长基因组cDNA的A片段和B片段。为了验证获得的A片段和B片段的正确性，以扩增出的A片段为模板，成功扩增出的IBDV的VP2基因，并应用T载体进行了克隆和测序，测序结果显示，其与国内外数株IBDV毒株的同源性很高，表明醉建立的扩增IBDV全长基因组cDNA的一步法正确、可行。     

鸡钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性及其与肉质性状的相关性

为探讨钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)基因作为影响鸡肉质性状候选基因的可能性,本研究以8个优质鸡新品系为试验材料,采用PCR-SSCP方法对CAST基因的部分编码区进行单核苷酸多态性(SNPs)检测。结果发现了CAST基因1个多态性位点(G→T),使试验鸡群表现出AA、BB和AB这3种基因型。利用SAS(8.01)软件统计分析了3种基因型与优质鸡肉质性状的相关性,结果表明,CAST基因的多态性对鸡肌内脂肪含量、肌纤维密度和直径有显著的影响(P0.05),对其他肉质性状无显著影响(P0.05);推测CAST基因可能对鸡肉质性状具有很大的影响或与控制肉质性状的主基因连锁。     

Sequence of the domestic duck (Anas platyrhynchos) growth hormone-encoding gene and genetic variation in the promoter region

The duck growth hormone encoding gene and its promoter region were amplified by polymerase chain reaction (PCR). A total of 5.25 kb were cloned and sequenced. Duck growth hormone (GH) consists of five exons and four introns and is structurally similar to mammalian and chicken GH gene. Although the distal region of duck GH promoter showed no similarity to chicken and turkey promoters, the proximal region of the promoter contained two putative Pit‐1 binding sequences, and showed similarity to chicken and turkey GH promoters. Genetic variation was detected at five positions of the promoter region. The results of this study indicate that the expression of duck GH is likely regulated in a similar manner to that of chicken GH via enhancer‐type cis‐acting elements and the presence of genetic variation in the duck GH gene may be applicable to marker‐assisted selection.     

鸡肝脏型脂肪酸结合蛋白基因启动子活性分析

PCR扩增鸡L-FABP基因5′侧翼区约2kb的DNA片段,进行克隆并测序,构建了鸡L-FABP基因报告基因系列缺失载体,瞬时转染进入人肝癌细胞系,利用双荧光素酶报告基因系统测定了荧光素酶活性。在线分析软件发现鸡L-FABP基因启动子区存在HNF-1、SREBP-1、AP-1、C/EBP、Oct-1、TATA、CCAAT、GATA-1等调控元件,没有发现CpG岛。报告基因结果表明鸡L-FABP基因启动子-2 076bp/-20bp区域具有最强的启动子活性,-522bp/-20bp区域启动子活性最弱;C/EBPα可以显著的抑制鸡L-FABP基因的表达,这些结果为深入研究鸡L-FABP的表达调控机制奠定了基础。     

鸡HMIT基因的克隆与表达分析

旨在克隆鸡H+/肌醇转运蛋白（H+/myoinositol transporter，HMIT）基因的转录序列，并检测HMIT基因在鸡不同组织中的表达情况，以及外源胰岛素处理对HMIT基因相对表达量的影响。本研究以AA肉鸡为试验动物，采用RT-PCR技术克隆鸡HMIT基因全编码区序列，采用生物信息学技术分析其编码蛋白的生物学特性，利用荧光定量PCR检测HMIT基因在大脑、肝、腹脂、腿肌、心、肾、空肠和回肠等组织中的表达情况，并检测其在肾和大脑中进行胰岛素处理120和240 min后的表达情况。结果表明，以NCBI预测的鸡HMIT（XM_001232939.5）序列为模板设计引物，成功克隆出鸡HMIT基因（1 694 bp，GenBank登录号：MN708211）。克隆的鸡HMIT编码区全长1 380 bp，相比XM_001232939.5预测的编码序列少561 bp，预测编码含有459个氨基酸组成的蛋白。核苷酸和氨基酸序列比对发现，鸡HMIT在物种间高度同源，共线性分析显示，HMIT所在的1号染色体区域在物种间也是高度保守的。HMIT编码的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质，其二级结构和三级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。跨膜结构分析显示，鸡HMIT存在8个明显的跨膜结构域。亚细胞定位结果表明，鸡HMIT蛋白分布于质膜（52.3%）、内质网（21.7%）、液泡（17.4%）、线粒体（4.3%）和高尔基体（4.3%）。实时荧光定量PCR检测结果显示，HMIT基因在鸡大脑和肾表达量最高，且显著高于其他组织（P<0.05）。胰岛素处理240 min后，HMIT在肾和大脑中的表达量都显著低于PBS对照组（P<0.05）。本研究克隆获得了鸡HMIT的全编码区，生物信息学分析及组织表达特性研究为深入探索鸡HMIT基因的生理功能和调控机制奠定基础。     

中国地方品种丝羽乌骨鸡白细胞介素2基因的克隆及遗传进化分析

鸡白细胞介素2（ChIL-2)是近年来新发现的一类细胞因子。根据Sundick等发表的鸡IL-2基因序列设计一对特异性引物,从ConA体外激活的脾脏淋巴细胞中提取mRNA,通过RT-PCR方法扩增和克隆了我国地方品种丝羽乌骨鸡IL-2cDNA,丝羽乌骨鸡IL-2基因由734nt组成,编码-由143个氨基酸组成的前体蛋白,基因5’端含有17个核苷酸和3'端含有285个核苷酸组成的非编码区,3'UTR中含有4个重复的“ATTTA”序列。编码蛋白氨基酸与Kestrel,Obese和SC品系的来杭鸡比较,氨基酸的突变主要发生在28-32位,这一区域丝羽乌骨鸡和Kestrel来杭鸡相同,Obese和SC鸡相同,基因系统进化树分析表明丝羽乌骨鸡和Kestrel来杭鸡具有很近的亲缘关系,Lbese和SC鸡具有很近的亲缘关系。中国的药用鸡品种-丝羽乌骨鸡在非常保守的133位发生了氨基酸突变,我们推测这可能与该品种鸡具有很强的抗病能力有关。     

STAT5b基因的遗传多态性及其与京海黄鸡体重和繁殖性状的关联分析

以京海黄鸡、AA鸡、尤溪麻鸡、边鸡等4个鸡品种为研究对象,采用PCR-SSCP方法检测信号转导和转录激活子5b(STAT5b)第7外显子和部分内含子7的多态性,并分析其对京海黄鸡体重和繁殖性状的遗传效应。结果显示,在STAT5b第7内含子区域检测到1处突变(8 066bp C→T)。在4个鸡品种中均检测到AA、AB、BB 3种基因型,χ2检验结果表明,除京海黄鸡外其余3个品种群体在该座位均达到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。最小二乘分析表明,京海黄鸡3种基因型个体的出生重和开产日龄存在显著差异(P<0.05)。     

京海黄鸡卵巢转录组研究:基因结构分析与新基因发掘注释

本试验通过对京海黄鸡卵巢组织进行转录组分析,旨在为完善京海黄鸡部分基因结构和发掘新基因提供参考。选取高、低产京海黄鸡各4只,利用转录组测序(RNA-Seq)技术对其卵巢转录组进行测序,然后对得到的测序数据进行生物信息学分析。测序数据经过质量控制后,8个样品共得到484 992 074条有效数据(Clean Reads),总计61.09 Gb。筛选出1 445 264个京海黄鸡品种内SNP位点,其中位于基因区的SNP位点916 108个,位于基因间区的SNP位点552 168个。8个样品中平均新预测的可变剪接12 883个,并对7 481个基因结构进行了优化。与所选的参考基因组序列对比分析,共发掘4 431个新基因,通过与各数据库进行序列对比,1 809个新基因得到功能注释。本研究通过转录组测序技术检测了京海黄鸡卵巢组织的基因结构,为进一步完善京海黄鸡的基因结构信息及发掘潜在的新基因提供分子水平的依据。     

Cloning of PRL and VIP cDNAs of the Java sparrow (Padda oryzivora)

Complementary DNA (cDNA) of prolactin (PRL) and vasoactive intestinal polypeptide (VIP) of the Java sparrow were cloned and sequenced. The proximal region of the PRL promoter was also identified. Java sparrow PRL was found to have 88.3, 88.3, and 89.1% sequence identity at the cDNA level to PRL of chicken, turkey, and duck, respectively. The predicted amino acid sequence had an overall similarity with a comparable region of chicken (91.4%), turkey (88.9%) and duck (92.0%) PRL. Based on the cDNA sequence and genomic structure of the chicken PRL gene, the proximal promoter was characterized. Sequence analysis of the proximal region of Java sparrow PRL promoter revealed a high degree of similarity to that of chicken, turkey and duck PRL promoters. Moreover, cDNA of prepro-VIP was also cloned and sequenced. Java sparrow prepro-VIP shows high similarity to chicken and turkey prepro-VIP. However, the region upstream of the 5' untranslated region of Java sparrow prepro-VIP did not show similarity to that of chicken. These results suggest that the mechanisms, which regulate expression of the VIP gene, may be different between precocial and altricial birds, but expression of the PRL gene may be widely conserved in avian species.