Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜中的动态表达与其抗虫性研究

采用ELISA方法检测Bt杀虫基因在转基因油菜植株中的表达。试验结果表明：在第3至9叶期Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中稳定、高效地表达,Bt杀虫蛋白的表达量为170ng/25mg-260ng/25mg鲜叶,占植物可溶性蛋白的0．067％－0．105％,其抗早效果高达42．5％－80．0％。但从第11叶期后Bt杀虫蛋白表达量显著地降低,只有7ng/25mg-50ng/25mg鲜叶,占植物可溶性蛋白的0．03％－0．02％。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种，采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行进行了研究，连续三代的研究结果表明，Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株（T01，T02，T03，T05，T06，T07，T08）的基因组中，并稳定地遗传给后代，纯合转基因株系杂交分析表明，在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的，T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白若整位点是同源染色体的不同座位，而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白若整位点是在非同源染色体上。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为研究

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种,采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行为进行了研究.连续三代的研究结果表明Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株(T01,T02,T03,T05,T06,T07,T08)的基因组中,并稳定地遗传给后代.纯合转基因株系杂交分析表明,在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的,T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白基因整合位点是同源染色体的不同座位,而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白基因整合位点是在非同源染色体上.     

CrylA杀虫基因的人工合成

苏云金芽孢杆菌(B.t.)杀虫蛋白,不仅专一性地杀死昆虫,而且对人、畜无毒无害。80年代中期,将酶切修饰后的B.t杀虫基因导入植物,获得了具有抗虫作用的转基因烟草及番茄植株,受到国内外科学家的高度重视。但导入棉花等植物后,由于表达量低,无抗虫效果。为了使原核B.t.杀虫基因能在真核植物体内有效地表达,使转抗虫基因植株获得抗虫能力,我们按照植物基因组优化密码子,在不改变B.t.杀虫蛋白氨基酸序列的前提下,完全人工合成了B.t.CryIA杀虫基因,经定性杀虫试验,具有生物杀虫活性。     

光杆状菌属细菌杀虫毒素研究进展

Bt制剂的大量使用及表达Bt毒素的转基因植物的应用已引发了抗性昆虫种群的发展,光杆状菌属细菌产生的杀虫毒素蛋白是一类高效、杀虫谱广的新型杀虫蛋白,使得有限的用来开发转基因抗虫作物的基因资源得到了补充。对近年来发现的Tc蛋白毒素复合体、PirAB双元毒素及其致软毒素(Mcf)的最新研究进展进行了综述,并对今后的研究方向提出了见解。     

利用密码子优化提高Bt cry1Ah基因在转基因玉米(Zea mays L.)中的表达

Bt cry1Ah基因是本实验室从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BT8中克隆的一种新型杀虫蛋白基因。在前期工作中已根据植物密码子偏好性对cry1Ah基因进行过一次优化。根据玉米密码子偏好性对cry1Ah基因进行第二次优化,并将两次优化的cry1Ah基因分别构建了pAhmG和pmAhb植物表达载体,利用农杆菌介导法转化玉米自交系综31,分别得到10株和9株阳性转基因玉米植株。通过ELISA、Western blot检测及生物活性检测,比较不同优化的基因在玉米中的蛋白表达量及抗虫情况。初步结果表明外源基因在玉米植株中可以稳定表达并可以遗传。二次优化基因比一次优化基因在玉米中的蛋白表达量更高,抗虫性更好。表明密码子优化有利于提高外源基因的表达。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ia32基因克隆和原核表达的研究

根据GenBank中cry1I类基因序列设计特异性引物,以Bt SC-13菌总DNA为模板PCR扩增得到2 151bp的cry1Ia全长基因。该基因编码蛋白由717个氨基酸组成,相对分子量为80.9kDa,等电点为6.57,编码蛋白与Cry1Ia1(CAA44633)亲缘关系最高达99.03%的序列同源性,该蛋白被Btδ-内毒素国际命名委员会正式命名为Cry1Ia32(登录号为JX944039)。cry1Ia32基因通过表达载体pET-21b在大肠杆菌中高效表达分子量为81kDa的蛋白,诱导表达的Cry1Ia32蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾的2龄幼虫具有较高杀虫活性,LC50值分别为0.025mg/mL和0.011mg/mL,为抗虫转基因植物研究提供了新的基因。     

转基因抗虫棉的培育

采用花粉管通道途径,将合成的Bt杀虫蛋白基因导入棉花优良品种泗棉3号和中棉所12,获得了转基因植株。组织化学分析表明,GUS标记基因已在R#-1代植株中表达。根据对GUS阳性转基因植株的PCR分析,证明Bt杀虫蛋白基因出现在R#-1代植株中,并通过自交传递至R#-2代。经抗虫性鉴定,获得了5株对棉铃虫有高度毒杀作用的R#-1代转基因抗虫植株S545、S591、S636、S1001（泗棉3号+Bt/GUS）和Zh1109（中棉所12+Bt/GUS）,对棉铃虫幼虫的致死率分别达到91.6%、93.8%、92.3%、85.7%和75.0%。通过自交和选育,获得了R#-5代转基因抗虫棉,并进行了抗虫性和转基因的跟踪鉴定,表明通过基因工程方法获得了抗棉铃虫的棉花新种质。     

农杆菌介导BtCry1Ac、NTHK1双价基因转化烟草植株的研究

为探讨多基因植物转化载体p096899中外源基因BtCry1Ac和NTHK1在转基因植株中的表达情况,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化野生烟草,经卡那霉素筛选,初步获得了10株转基因烟草植株.经PCR鉴定,证明目的基因已被整合到烟草基因组中.利用荧光定量PCR和ELISA分析目的基因在转录水平和翻译水平的表达量,并对转基因烟草株系进行了抗虫试验和耐盐性试验.结果表明,目的基因在转录水平和翻译水平分别得到表达,但表达量存在差异,其中2号转基因株系毒蛋白表达量最高,其含量达可溶性总蛋白的0.028 5％;饲虫试验中,部分转基因烟草株系对斜纹夜蛾的毒杀作用明显高于未转化烟草,其中2号转基因株系的抗虫性最高,饲喂第6天斜纹夜蛾幼虫死亡率达到75.56％,与Bt毒蛋白表达量相一致;在盐胁迫下,转基因烟草的叶片生长状况均好于对照(非转基因)烟草的生长.证明BtCry1Ac基因和NTHK1基因的转入在一定程度上提高了烟草的抗虫性和耐盐能力.     

转Bt基因棉花的研究应用及问题与对策

20世纪80年代初Bt毒蛋白基因被克隆并转化到植物当中,转Bt基因棉花的应用已取得了相当的效益。但随着转Bt基因棉花的种植,也出现了许多问题,诸如抗药性的产生、抗虫谱狭窄、表达水平低等。现在转抗虫基因棉花的研究主要围绕着转多基因抗虫棉的培育,采用特异启动子调控外源抗虫基因在棉株体内的高效表达,修饰Bt基因以改善Bt毒蛋白的杀虫效能,重视外源与内源抗虫系统间的协调性,加强现代基因工程与传统抗虫育种相结合和筛选广谱性抗虫基因培育广谱性抗虫棉花,等等。     

转Bt基因玉米对亚洲玉米螟的抗性评价

转Bt基因抗虫玉米为诺华公司含Bt11转化系的杂交种NX4777,能全株表达Cry1Ab杀虫蛋白,以其非转基因受体玉米品种NX4906为对照。在玉米生长至心叶中期(50~60cm高)、抽雄前期和抽丝散粉期分别进行人工接亚洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]初孵幼虫40~60头。以食叶级别、存活幼虫数、蛀孔数、隧道长度和雌穗被害级别等,分别作为评价玉米心叶期和穗期的抗性标准。结果表明,Bt玉米食叶级别仅为1级,显著低于对照的7级。Bt玉米平均每株存活幼虫0.04~0.20头、蛀孔0.11~0.15个、隧道长度0.13~0.41cm,雌穗被害级别为0,植株折茎率为0,而对照玉米平均每株存活幼虫6.19~12.41头、蛀孔4.48~7.05个、隧道长度12.41~24.09cm,雌穗被害级别为5.9,植株折茎率高达73.6%~95.5%。室内生测结果亦表明,取食Bt玉米心叶、雄穗的初孵幼虫3d全部死亡,取食花丝7d死亡率达到99%,相比之下取食常规玉米的存活率在88.7%以上。表明表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt对亚洲玉米螟具有很高的抗虫性,能够保护玉米全生育期免受玉米螟的危害。     

转基因抗虫油菜对菜青虫抗性的研究

 通过室内喂虫实验和大田抗虫实验对转基因抗虫油菜的菜青虫抗性进行了研究。实验结果表明:转Bt杀虫蛋白基因抗虫油菜新品系对菜青虫幼虫具有较强的抗性,在室内喂虫实验中虫子的死亡率高达94.40%,而对照仅为15.00%;在大田中虫子死亡率达46.59%,而对照仅为21.25%。     

Bt杀虫蛋白在转基因抗虫棉中的表达

[目的]评价转基因抗虫棉的生物安全性.[方法]利用3个由花粉管通道法获得的转Bt基因的抗虫棉品系,通过Southern杂交技术研究了抗虫棉的插入数,通过棉铃虫饲喂、半定量RT-PCR和ELISA测定了抗虫棉的Bt杀虫活性的时间和空间的动态变化.[结果]Bt基因在抗虫棉中为1～2个拷贝数;Bt蛋白杀虫活性的时空动态表现为在不同生育期的同一器官中,苗期叶片的表达比花铃期的叶片强,在同一生育期内,不同器官表达不同,叶片和铃壳的表达高于苞叶、花和雌雄蕊.[结论]Bt杀虫蛋白在转基因抗虫棉中的抗性具有时空表达特异性.     

Bt棉功能叶氮代谢对Bt蛋白表达及氮肥调节的响应

为评价外源Bt基因插入以及氮肥对Bt棉功能叶Bt蛋白表达及氮代谢的影响,对Bt棉功能叶Bt蛋白含量,硝酸还原酶、谷丙转氨酶和蛋白酶活性,可溶性蛋白质和全氮含量等指标进行了测定。结果表明:Bt棉功能叶Bt蛋白含量在蕾期最高,此后,随生育进程呈显著下降。与常规棉相比,Bt棉功能叶硝酸还原酶活性提高,在前中期谷丙转氨酶活性显著提高且有利于可溶性蛋白质的合成,前期全氮含量显著增加,对蛋白酶活性没有明显影响。Bt棉功能叶Bt蛋白含量与硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质和全氮含量呈显著正相关,表明Bt棉前期增强的氮代谢促进了Bt蛋白的表达。施氮肥明显提高Bt棉中后期功能叶硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质含量和Bt蛋白的表达。基施和初花期各50%的效应显著大于全部基施,而在基施氮肥基础上,初花期增施50%的氮肥效应最明显。与常规棉比较,施氮肥更有利于Bt棉中后期功能叶硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质含量提高。     

转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空动态

以转Bt基因抗虫棉 33B为材料 ,利用ELISA检测方法 ,通过对棉株不同发育时期和同一时期的不同组织或器官Bt晶体蛋白含量的测定 ,研究了转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空变化。结果表明 ,随着棉株生育进程的推进和株体的老化 ,Bt晶体蛋白含量随着植株体内可溶性总蛋白含量的逐渐降低而降低 ,而Bt基因的表达强度从苗期到蕾期随着棉株营养生长的加快而呈上升趋势 ,至蕾期达到高峰 ,以后逐渐减弱。不同组织或器官Bt晶体蛋白的含量也有较大差异 ,表现在幼嫩组织或器官的含量较高 ,成熟组织或器官次之 ,衰老组织最低。这说明Bt基因表达强度的减弱和Bt晶体蛋白含量的降低是转Bt基因抗虫棉生育后期抗虫性降低的根本原因     

转vip3基因作物研究进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)转基因作物在全球种植已近15年。随着转基因作物种植面积的扩大,害虫对Bt杀虫蛋白产生抗性已成为一个严峻的问题。通过研究发现,苏云金芽孢杆菌的营养生长阶段可产生一种新的毒素,即VIP3蛋白。VIP3蛋白与已知的ICPs没有序列同源性和结构相似性,表达VIP3对十多种鳞翅目害虫具有毒杀作用,具有更广泛的抗虫谱,尤其可毒杀小地老虎(Agrois ipsilon)等对Bt非敏感害虫,对环境生物没有不良影响,是防治抗性害虫及扩大抗虫谱的一种新策略。     

Bt杀虫蛋白基因导入新疆棉花获得抗虫转基因植株

通过花粉管通道法将人工全序合成的Ｂｔ杀虫蛋白基因导入新陆早４号和Ｃ６５２４两品种中,收获注射地Ｂｔ杀虫蛋白基因的棉花种子２万余粒。经棉铃局喂的抗虫性生物检测,得到高抗虫的１８株新陆早４号转化苗和３６株Ｃ６５２４转化苗;以Ｂｔ基因的一对引物进行ＰＣＲ分析,５４株抗棉铃虫的转化棉花苗均扩增出部分Ｂｔ杀虫蛋白基因的目标带。未转化的对照棉花苗则无此条带,证实Ｂｔ杀虫蛋白基因已整合到转化抗虫棉株的染色体上,     

双价抗虫转基因棉花研究

构建了携带人工合成的GFM CryIA杀虫基因和经过修饰的CpTI基因的高效双价杀虫基因植物表达载体pGBI121S4ABC。采用花粉管通道法,将pGBI121S4ABC转入到石远321、中棉所19号、3517和541中国棉花生产品种中,首次获得了双价转基因抗虫棉株系。叶片室内抗虫生物学鉴定表明,抗性好的株系棉铃虫幼虫校正死亡率大于96%;经分子检测,证实了双价杀虫基因在棉花基因组中的整合与表达。