吕梁黑山羊的体细胞克隆

研究旨在尝试利用体细胞克隆技术进行地方优良品种吕梁黑山羊的克隆保种。剪取吕梁黑山羊耳缘组织,通过组织块培养法获得了吕梁黑山羊皮肤成纤维细胞,使用第6代的皮肤成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,将重构胚胎通过手术移植到受体辽宁白绒山羊母羊体内,结果成功获得了2只体细胞克隆黑山羊,生长发育状况良好,且与供体黑山羊一致,表明体细胞克隆技术是可行的。这是山西省首例吕梁黑山羊克隆个体,它的成功为优良地方品种改良、保种等研究提供了有效可行的方法,为下一步进行吕梁黑山羊的转基因育种研究奠定了技术基础。     

吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞的分离及体外培养

为了更好地开展对吕梁黑山羊这一特色地方品种资源的保护研究,采用组织块贴壁法,成功分离、培养并获得具备典型形态特征的吕梁黑山羊耳缘皮肤成纤维细胞。经过反复冻融试验检测细胞能够稳定传代和保存,同时对其进行了电转染条件的初步摸索。结果表明,在电压240 V,脉冲时长20 ms的条件下,转染效率较高。该细胞的分离培养为开展种质资源保存及相关繁殖生物技术研究提供了较好的平台,同时也为后续开展转基因克隆和基因编辑研究奠定了良好的基础。     

兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞系的建立

通过物种体细胞培养和长期保存,可在细胞水平上保存珍贵的种质资源.采用组织块培养法培养耳缘组织原代细胞,并通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞并用液氮保存,细胞复苏后进行了活力、形态、生长特性、微生物污染和染色体等检查.结果表明:保存了兰州大尾羊27个个体的耳缘细胞,保存的细胞平均复苏活力97.6％,生长良好,形态呈成纤维型,生长曲线呈“S”型,最大增殖浓度3.01×105个·mL-1,倍增时间为26.1h,细菌、真菌、病毒和支原体检查为阴性,染色体为2 n=54,二倍体占88％.最终,成功培养并保存了兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞,使这一珍贵的种质资源在细胞水平上得以长期保存.     

吕梁黑山羊成纤维细胞培养过程中霉菌污染的清除

为建立和完善细胞在体外培养过程中清除霉菌污染的方法,挽救珍贵的细胞资源,试验在被霉菌污染的吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞培养液中分别添加2.5,25,250μg/m L的两性霉素B,每天洗涤、换液一次,连续处理14 d,比较不同浓度药物的清除效果。结果显示,细胞培养液中添加25μg/m L的两性霉素B后,细胞中无霉菌生长,细胞生长良好,药物处理过程中可正常传代,处理后细胞生长曲线与对照组细胞无明显差异。说明细胞培养液中添加25μg/m L两性霉素B既能清除霉菌污染又不会对细胞造成影响,该浓度是清除霉菌污染适宜的质量浓度。     

β 巯基乙醇和发情羊血清对牛颗粒细胞体外培养的影响

为满足实验室卵母细胞体外成熟共培养和胚胎共培养的需要以及进行卵巢颗粒细胞生物学功能等研究的需要，进行牛卵巢颗粒细胞的体外培养研究。在基础培养液TCM199中分别添加12.5、25、50、100、200 μmol/L的β 巯基乙醇(BME)，观察颗粒细胞生长状况；在基础培养液中分别添加体积分数为10%的发情山羊第1天血清、体积分数为10%的发情山羊第11天血清和体积分数为10%的胎牛血清，观察颗粒细胞生长和增殖情况。体外培养颗粒细胞的活细胞率随着添加BME浓度的增大而增加，在25 μmol/L时达到最高，此后随浓度的增大而降低；发情山羊第1天的血清组中，颗粒细胞生长和增殖情况最好。BME可以提高颗粒细胞体外培养的活率，最佳添加浓度为25 μmol/L；发情山羊第1天的血清可有效促进颗粒细胞体外培养生长和增殖。     

甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞生长和增殖的影响

【研究目的】研究了不同剂量甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞微核和增殖的影响,在细胞水平上揭示甜菜碱对三黄鸡生长影响的机理,为甜菜碱在动物生产中的应用提供依据。【方法】体外分离培养三黄鸡胚胎成纤维细胞,在培养液中添加不同剂量甜菜碱,观察细胞生长及分裂。【结果】①在基础培养液(DMEM 15%NBS)中添加10mM,20mM甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞微核率无显著影响;添加30mM,40mM,50mM甜菜碱显著提高三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的微核率。②在基础培养液(DMEM 15%NBS)中添加10mM、20mM甜菜碱能促进三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖,以在培养液中添加20mM甜菜碱时三黄鸡原代成纤维细胞增殖速度最快。添加50mM甜菜碱时抑制了三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖。【结论】低剂量甜菜碱可促进三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖,高剂量甜菜碱对细胞分裂构成危害。     

人羊膜上皮细胞对于生长因子和ORFV的敏感性研究

研究人羊膜上皮细胞(hAEC)在不同生长因子存在时生长速度差异性及在羊口疮病毒(ORFV)作用下形态学变化特征。采用胶原酶-胰蛋白酶联合消化法分离获取hAEC并进行原代培养。分别向培养液中添加40 ng·mL-1表皮生长因子(EGF)和10 ng·mL-1的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),倒置显微镜观察细胞生长和增殖情况,以选择最适宜hAEC原代培养方法。体外实验用ORFV感染hAEC并记录。获得大量hAEC细胞。细胞培养时添加bFGF,hAEC生长和增殖速度显著加快。病毒感染出现明显细胞病变。胶原酶-胰蛋白酶联合消化及培养液中添加10 ng·mL-1的bFGF是hAEC较为适宜的原代培养方法;hAEC对于ORFV具有敏感性。     

血清饥饿对兔成纤维细胞生长的影响

用含体积分数０．５％血清的ＤＭＥＭ直接饥饿胎儿及皮肤成纤维细胞，细胞数先是略有增长，然后逐渐下降。胎儿和皮肤成纤维细胞在血清梯度饥饿期间，更换含体积分数为４％，２％和１％血清的ＤＭＥＭ，细胞仍缓慢增长；更换含体积分数为０．５％血清的培养液后，细胞数逐渐降低。血清饥饿成纤维细胞后，细胞直径明显小于对数生长期的细胞（２０，１９ＶＳ３６μｍ，Ｐ〈０．０１）。血清饥饿的成纤维细胞，ＰＣＮＡ单抗染色阴性，证     

血清饥饿对兔成纤维细胞生长的影响

用含体积分数０．５％ 血清的ＤＭ ＥＭ 直接饥饿胎儿及皮肤成纤维细胞,细胞数先是略有增长,然后逐渐下降。胎儿和皮肤成纤维细胞在血清梯度饥饿期间,更换含体积分数为４％ ,２％ 和１％ 血清的ＤＭＥＭ,细胞仍缓慢增长;更换含体积分数为０．５％ 血清的培养液后,细胞数逐渐降低。血清饥饿成纤维细胞后,细胞直径明显小于对数生长期的细胞（２０,１９ＶＳ３６ μｍ ,Ｐ＜ ０．０１）。血清饥饿的成纤维细胞,ＰＣＮＡ 单抗染色阴性,证明离开了细胞周期,进入Ｇ０ 期,该期的细胞仍保持着活力     

人类原始生殖细胞的体外培养

为了探讨人原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素,以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层,室温下用1．25 g／L胰蛋白酶+0．2 g／L EDTA消化人胚胎组织5～9 min,或用1 g／L胶原酶(IV型)消化20～40 min,分离得到PGCs,然后用不同培养液培养,从培养液角度较为系统的研究原代培养人原始生殖细胞的条件。结果表明,在KSR培养液(体积分数15％ Knockout serum replacement+高糖DMEM+10 ng／mL人重组白血病抑制因子(LIF)+4 ng／mL人重组碱性成纤维细胞生长因子+10 ng／mL Forskolin)和STO(建系的小鼠胚胎成纤维细胞)条件培养液中培养的原代人原始生殖细胞,有较高的克隆形成率;培养液中添加不同质量浓度的LIF对克隆形成率影响差异不大。