黄鳝脂肪酸去饱和酶及延长酶基因cDNA的克隆与表达

为了解黄鳝合成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的能力,利用Trizol提取黄鳝肝脏总RNA,经RT获得cDNA,基于脂肪酸去饱和酶(FAD)及延长酶(FAE)基因同源系列设计简并引物进行黄鳝cDNA的PCR扩增、测序,获得黄鳝FAD及FAE基因部分片段序列。然后分析黄鳝FAD及FAE的同源性和系统进化情况及黄鳝胚胎和胚后发育期仔鱼该两个基因的表达水平。结果表明:黄鳝FAD与军曹鱼的△6去饱和酶同源性高达85%,其次是大菱鲆(83%),FAE与军曹鱼、线鳢、澳大利亚金枪鱼等的同源性高达89%;但FAD和FAE在系统发育树中均自呈一支。FAD和FAE基因在黄鳝胚胎和胚后发育阶段均有表达,以出膜后2～4 d表达量最高。提示黄鳝具有合成LC-PUFA的能力,但不同发育阶段合成能力不同。     

香梨优斑螟脂肪酸Δ9去饱和酶基因序列及不同虫态的表达分析

【目的】研究Δ9去饱和酶基因特性及其在不同虫态下的表达,研究EpFAD9基因功能及潜在应用提供数据,为该香梨优玫玉暝、饱和脂肪酸积累中的作用提供参考。【方法】采用生物信息学软件鉴定、分析和预测Δ9去饱和酶(EpFAD9)的核苷酸和氨基酸序列,研究蛋白质结构和功能,并利用qRT-PCR方法测定△9去饱和酶基因在不同虫态下的表达水平。【结果】EpFAD9基因开放阅读框由1 056 bp组成,含352个氨基酸,起始密码子ATG位于获得序列的第1 280碱基上,终止密码子TAA位于该序列第2 338碱基。推测该蛋白无信号肽,共4个跨膜结构域,整体表现为亲水性蛋白,主要在内质网中发挥生物学作用。EpFAD9基因在幼虫期表达量较高,分别是成虫期和蛹期的17.75和29.58倍。【结论】EpFAD9基因基因在香梨优斑螟不同虫态下存在表达差异,在幼虫体内的表达量最高,成虫和蛹期的表达很低,尤其是虫蛹,其表达量更低于成虫,虫蛹和成虫状态下的香梨优斑螟对低温抵抗能力都低于幼虫。     

杜氏盐藻DsFAD2基因的鉴定及缺氮胁迫下表达分析

[目的]w-6脂肪酸去饱和酶2(FAD2)催化油酸(18∶1)去饱和形成亚油酸(18∶2),是多不饱和脂肪酸合成过程中的第一个关键酶。为了探究DsFAD2在盐藻油脂合成积累中的作用。[方法]本文以运城盐湖分离的富油杜氏盐藻(Dunaliella salina)株系(YC-011)为材料,利用高保真PCR技术克隆盐藻DsFAD2基因,并对DsFAD2编码蛋白进行了跨膜区、高级结构及氨基酸序列比对等一系列生物信息学分析。应用qRT-PCR检测DsFAD2基因在氮(N)胁迫培养条件下的表达模式。[结果]DsFAD2蛋白定位于内质网中,有5个跨膜区,具有典型膜结合蛋白的结构特征。此外,DsFAD2也具有所有FAD2蛋白家族所特有的3个组氨酸保守区和芳香族氨基酸序列。系统发育分析发现杜氏盐藻DsFAD2与莱茵衣藻CrFAD2、团藻VcFAD2亲缘关系最近。qRT-PCR表明,与正常培养的杜氏盐藻相比,缺N培养显著诱导DsFAD2上调表达,N胁迫8d时DsFAD2的表达量是未胁迫对照的2.8倍。[结论]DsFAD2参与杜氏盐藻N胁迫响应,促进多不饱和脂肪酸形成,增强藻细胞抗逆性。本研究为进一步解析N胁迫条件下藻细胞油脂富集及响应分子机制提供了科学参考。     

陆地棉膜结合脂肪酸去饱和酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析

膜结合脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase, FAD)是生物合成不饱和脂肪酸的关键酶。本研究以陆地棉基因组数据为基础,利用生物信息学方法对棉花FAD基因家族进行全基因组鉴定和进化分析。结果表明,陆地棉基因组中共含有37个FAD基因,进化分析发现这些基因分为4个亚家族,各亚家族成员数量不一,但相同亚家族成员含有相似的基因结构和保守基序。共线性分析发现28对复制基因全为片段复制基因,且都经历了严格的纯化选择作用。此外,在陆地棉FAD基因的启动子区域,发现了丰富的响应植物激素信号和逆境胁迫的顺式作用元件。转录组分析表明,陆地棉FAD基因家族响应干旱和盐胁迫,定量PCR分析表明施加外源褪黑素显著影响了FAD基因的表达。本研究结果为进一步解析FAD家族基因的功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜FAD2基因调控序列的克隆及瞬时表达分析

油酸去饱和酶FAD2（fatty acid desaturase 2）是广泛存在于植物中的一种能催化油酸脱氢生成亚油酸的还原酶。根据GenBank上已知的甘蓝型油菜FAD2基因设计引物,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）叶片总DNA为模板,进行TAIL-PCR扩增,获得约1.4 kb片段并测序。序列比对结果说明该片段为已知的FAD2基因编码区上游序列。将该片段进行不同长度的5′端缺失,并用缺失后的序列替换pBI221-LUC质粒上的CaMV35S启动子,构建了甘蓝型油菜瞬时表达载体,进行油菜原生质体瞬时表达的初步研究,结果表明该序列5′端-669 bp至-1019 bp对报告基因表达水平有较大的影响。结合启动子预测分析结果,此片段中可能存在的赤霉素应答元件、光调控元件等顺式作用元件对FAD2基因的表达调控具有重要作用。     

紫苏PfPDCT基因序列特征及表达分析

采用生物信息学技术和在线分析软件对紫苏PfPDCT基因序列及所编码的蛋白质进行分析,并且利用实时荧光定量PCR技术研究该基因在晋紫苏1号种子发育不同时期的表达特性,旨在探究磷脂酰胆碱甘油二脂转磷酸胆碱酶(PDCT)在植物脂肪酸代谢过程的作用。结果表明,紫苏PfPDCT基因c DNA全长序列为2 098 bp,开放阅读框为1 683 bp,编码560个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明,PfPDCT蛋白分子量约为59.315 ku,等电点为9.48,不稳定系数为35.00,推测其为稳定蛋白,与已知赤藓PDCT蛋白高度同源。通过荧光定量PCR分析可知,紫苏PfPDCT基因在不同发育时期的种子中均有表达,其中,在开花后20 d表达量最高,为开花后10 d的1.92倍。研究结果可为进一步阐明紫苏PfPDCT基因的功能及作用机制奠定基础。     

毛白杨亚油酸去饱和酶基因的克隆与表达模式分析

以毛白杨为材料,利用现有的杨树基因组EST序列库资源,通过同源序列搜索,经过多次拼接合并获得了理论的杨树亚油酸去饱和酶cDNA序列全长,通过RT-PCR手段首次克隆得到了毛白杨PtFAD3基因编码序列cDNA (GenBank 登录号: DQ354393),该 cDNA 全长 1 199 bp,开放阅读框编码383个氨基酸.通过RT-PCR半定量研究表明PtFAD3在叶片中的表达量最高,茎和根中的表达量依次降低;用低温、干旱、NaCl、ABA分别处理毛白杨组培苗,叶片中的PtFAD3表达量在逆境初期 24 h 之内没发生变化.该研究为毛白杨脂肪酸去饱和酶的研究以及植物脂肪酸基因工程提供了基础.     

脂肪酸去饱和酶参与植物对胁迫的响应

植物常受到温度、盐和干旱等非生物以及病原菌和昆虫等生物胁迫。全面了解脂肪酸的去饱和、动员和调控将有助于提高植物对非生物和生物胁迫的耐受性。文章对近年植物脂肪酸在去饱和、动员和调控非生物和生物胁迫上的研究进展进行综述,并对脂肪酸去饱和酶的调控进行讨论。     

膜整合脂肪酸去饱和酶系统进化分析

将已报道的膜整合脂肪酸去饱和酶基因所编码的氨基酸序列进行比较,通过邻位相连法构建系统进化树.结果表明,膜整合脂肪酸去饱和酶氨基酸序列都具有3个高度保守的组氨酸簇,说明它们具有很近的亲缘关系.系统进化树由3个单系群组成:△9-脂肪酸去饱和酶;△12、15-脂肪酸去饱和酶;前端脂肪酸去饱和酶包括△4、5、6、8脂肪酸去饱和酶.△12、15-脂肪酸去饱和酶单系群与前端脂肪酸去饱和酶单系群构成姐妹单系群,它们可能是由△9-脂肪酸去饱和酶单系群进化分枝而来的.     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体的构建与转化

内质网型ω-3脂肪酸去饱和酶(FAD3)是不饱和脂肪酸合成途径中催化十八碳二烯酸[18∶2(9,12)]转化为十八碳三烯酸[18∶3(9,12,15)]的关键酶。通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到LeFAD3的全长cDNA,基因全长为1 184bp,开放阅读框(ORF)为1 134bp,注册号为EU251190。将该基因正反向序列分别插入带有35S-CaMV启动子pBI121表达载体下游,获得正、反义表达载体,转化农杆菌LBA4404,利用农杆菌介导法转化番茄,获得转基因番茄植株。     

油用牡丹脂肪酸脱氢酶基因FAD3的克隆与表达分析

【目的】ω-3脂肪酸脱氢酶(ω-3 FAD)为植物脂肪酸生物合成途径中的关键酶,通过对油用牡丹‘凤丹’ω-3 FAD基因结构特征及其在不同组织中的表达模式进行分析,为研究FAD3在油用牡丹‘凤丹’脂肪酸形成过程中的调控提供理论基础。【方法】采用RACE和RT-PCR的方法克隆油用牡丹‘凤丹’ω-3 FAD基因,用Vector NTI Advance 11软件进行序列分析,BLAST进行同源性比较,并用MEGA7.0的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树,利用在线蛋白质分析工具Ex PASy预测FAD3蛋白的基本参数和特性,利用Phyre2预测蛋白质二级和三级结构,并通过实时荧光定量PCR检测该基因在油用牡丹‘凤丹’不同发育期的种子以及不同组织中的特异性表达情况。【结果】获得油用牡丹‘凤丹’脂肪酸脱氢酶FAD3,命名为FAD3(Gen Bank登录号:KX906966)。序列分析表明该基因c DNA序列全长1 723 bp,其中,开放阅读框1 308 bp,编码435个氨基酸,3′端非编码区长287 bp,5′末端非编码区长99 bp,预测成熟蛋白分子量为49.9 k D,理论等电点(p I)为7.42,N端无信号肽,脂肪系数为83.08,不稳定指数35.67,总水平亲水性为-0.222。经FAD3蛋白的二级结构预测,FAD3以α-螺旋、随机卷曲为主,其次是延伸链、β-转角含量较少;多序列比对结果表明,油用牡丹FAD3氨基酸序列含有2个保守结构域,系统发育分析结果显示‘凤丹’与芍药处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和Target P亚细胞定位分析得知,FAD3蛋白有3个跨膜区域,可能定位于内质网中发挥功能。组织特异性结果分析表明,FAD3在‘凤丹’的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,雌蕊次之,在雄蕊中表达量最低;不同时期种子中,10 d表达量最高,20 d次之,在60 d中表达量最低。【结论】成功从油用牡丹‘凤丹’中克隆获得FAD3全长c DNA序列,其在‘凤丹’不同组织中呈现出多种表达模式。     

‘航花2号’的Δ~(12)脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的生物信息学分析

植物中的Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是油酸形成亚油酸的关键酶。通过NCBI和EXPASY 2大数据库,采用Signal P、TMHMM、Psort、Prot Param和Target P等分析程序对花生品种‘航花2号’及其它物种的19个FAD2蛋白序列进行分析,利用MEGA6.0软件比对序列及构建系统进化树阐明FAD2基因的系统发育关系,亲缘相近的FAD2蛋白聚在一起。预测了‘航花2号’和‘粤油13’的FAD2蛋白的分子质量、等电点、信号肽、跨膜和保守结构域等。结果表明:‘航花2号’FAD2蛋白的N端没有信号肽,预测定位在微体、细胞质、线粒体基质和叶绿体类囊膜中,而C端信号基序LKGL使得FAD2蛋白选择性地结合和嵌入内质网,植物的FAD2蛋白普遍有3个高度保守的组氨酸富集基序(HECGHH、HRRHH和H[A/C/T]HH)和3~5个跨膜结构,但分析结果显示,‘航花2号’的FAD2蛋白的H[A/C/T]HH的组氨酸基序是缺失的,而油酸转化为亚油酸的效率上并没有显著变化,为将来FAD2基因的基因工程操作提供一定的理论基础。     

紫苏茉莉酸羟基甲基转移酶基因PfJMT的克隆及表达分析

【目的】茉莉酸羟基甲基转移酶（jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT）是植物茉莉酸甲酯生物合成的关键酶,通过克隆紫苏JMT,并研究其在不同胁迫下和种子不同发育时期的表达模式,为研究JMT在植物防御和种子发育中的作用提供理论依据。【方法】根据紫苏种子转录组测序结果设计引物,从紫苏中克隆得到紫苏茉莉酸羟基甲基转移酶基因的DNA和cDNA序列,命名为PfJMT,通过生物信息学分析该基因的结构、稳定性、亲水性、亚细胞定位及保守结构域等,利用系统进化树分析PfJMT和其他物种JMT蛋白的进化关系。取开花期的紫苏根、茎、叶、花等组织用于组织特异性表达分析。取开花后5、10、15、20、25和30 d的种子用于JMT在种子不同发育时期表达模式的研究。用25 μmol·L ^-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和1 mmol·L ^-1水杨酸（salicylic acid,SA）喷洒处理具有4片真叶的紫苏幼苗并浇灌根部,分别于处理0、2、4、8、16、24和48 h后取样,研究JMT在不同胁迫下的表达模式。 【结果】PfJMT的ORF长1 050 bp,编码349个氨基酸。生物信息学分析表明,PfJMT为不稳定的亲水蛋白,亚细胞定位于细胞质,含有一个甲基转移酶-7（Methyltransf-7）保守结构域。通过与其他物种的JMT蛋白多序列比对发现,紫苏JMT和丹参JMT的序列一致度最高,为80.5%,和水稻的序列一致度最低,为36.8%。在对多种不同植物基于JMT蛋白构建系统进化树的分析中发现紫苏和拟南芥、丹参等双子叶植物亲缘关系较近,而与建兰、水稻等单子叶植物亲缘关系较远,说明JMT在单子叶和双子叶植物的进化过程中可能存在较大的差异。荧光定量PCR结果表明,PfJMT在紫苏根和茎中的相对表达量最低,叶和花中的相对表达量比根和茎中略高,在开花后5d的种子中的表达量最高,并且随着种子的发育表达逐渐下调,说明JMT在种子发育中起着重要作用。在使用外源MeJA和SA处理的紫苏根、叶组织中,PfJMT表达均显著下调,这一结果支持JMT可能不直接参与防御反应,而是通过调节JA水平间接参与植物防御的理论。【结论】成功克隆获得PfJMT,随着种子的发育PfJMT表达量逐渐下调,并在外源MeJA、SA胁迫下表达量显著下调。     

甜荞麦脂肪酸脱氢酶基因(FeFAD)家族的鉴定与分析

脂肪酸是人体内不可缺少的营养成分.虽然甜荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)籽粒中油脂含量不高,但是研究表明其含有较高的多不饱和脂肪酸,不饱和脂肪酸含量在40％左右.脂肪酸脱氢酶(FAD)是形成不饱和脂肪酸的关键酶,甜荞麦脂肪酸脱氢酶基因的研究对理解其多不饱和脂肪酸的形成及调控具有重要意义.本研究利用甜荞麦基因组数据库,以拟南芥膜结合脂肪酸脱氢酶基因(FAD)作为种子序列进行Blastp序列比对,共鉴定出10个甜荞麦FAD全长基因,并对其基因特征、进化、保守结构域、蛋白质二级和三级结构等进行分析.结果显示:10个FeFAD基因被分为6个亚族;基因特征分析显示,FeFADs基因开放阅读框长度在900～1 374 bp之间,等电点介于6.83～9.23之间;所有FeFAD基因均含有内含子,且FeFAD6的内含子数最多,含有10个内含子;除FeFAD4含有TMEM189_B_dmain结构域外,大多数Fe- FADs均含有保守的脂肪酸脱氢酶结构域,FeSLDs除含有脂肪酸脱氢酶结构域外还含有Cyt-b5特定结构域;除FeFAD4含有HXXXH、HXXHH 2个保守组氨酸序列外,其余FeFADs均含有HXXXH、HXXHH、HXXHH 3个保守组氨酸序列;二级结构氨基酸数量预测显示FeFADs均以α-螺旋和无规则卷曲为主;三级结构预测显示大多数FeFADs三级结构各自均有自身的独特结构.本研究结果将为探究甜荞麦脂肪酸脱氢酶基因的功能提供一定的理论依据.     

油用向日葵脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1的克隆与表达分析

为了解FAD2-1基因在油用向日葵品质形成过程中的作用,以油用向日葵为材料,利用RT-PCR方法对高含油率保持系材料改HA89(含油率为46%)和低含油率保持系材料86-1(含油率为38%)的脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1进行克隆与表达分析。结果表明:获得了脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1全长cDNA编码序列,全长为1 137bp,编码378个氨基酸。核苷酸序列和蛋白序列比对结果表明,该基因在这2份材料中第44位和第102位核苷酸存在差异,并且都导致了氨基酸的改变。种子发育不同阶段油酸和亚油酸积累动态分析和qRT-PCR研究结果表明,FAD2-1基因表达量变化趋势与亚油酸含量变化趋势基本一致,而与油酸含量变化趋势基本相反。     

不同品种(系)紫苏含油量及脂肪酸成分对海拔的响应

为紫苏的合理栽培提供理论依据,在贵州选取5个海拔梯度(398~1 391m)试验点种植6个紫苏品种(系)(奇苏1~6号),收获后检测紫苏含油量及主要脂肪酸成分,分析不同海拔高度紫苏含油量及脂肪酸成分变化。结果表明:不同品种(系)紫苏含油量及脂肪酸成分对不同海拔试验点的响应不同,奇苏1号在镇宁县(海拔1 391m)、开阳县(615m)、思南县(398m)和福泉市(821m)以及奇苏4号在开阳县试验点含油量较高,平均含油量47.27%;奇苏4号在开阳县、湄潭县(海拔802m)、思南县和镇宁县以及奇苏3号在开阳县种植的α-亚麻酸含量较高,平均含量为65.03%;奇苏1号、奇苏2号、奇苏4号和奇苏6号在镇宁县种植及奇苏3号和奇苏5号在福泉市种植的籽粒不饱和脂肪酸含量较高。以含油量为目标性状,奇苏1号含量较高,适宜贵州省内不同海拔点种植;若以亚麻酸含量为目标性状,奇苏4号含量较高,适宜贵州省内不同海拔点种植;以不饱和脂肪酸为目标性状,偏高海拔地区种植紫苏其籽粒不饱和脂肪酸含量较高。     

紫苏RAS基因启动子的克隆及序列分析

迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase,RAS)是紫苏(Perilla frutescens)迷迭香酸生物合成途径中的关键酶,采用基因组步移方法,克隆得到长度为2 022 bp的紫苏RAS基因5′端的启动子片段,并对启动子序列的转录起始位点和顺式作用元件进行分析。结果表明,紫苏RAS基因启动子调控区域除了含有基本的TATA-box和CAAT-box元件外,还含有多个与植物胁迫和生长相关的顺式作用元件,如脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应的顺式作用元件等,另外还包含多个光响应顺式作用元件。