不同浓度氮、磷对杜氏盐藻生长的影响

在实验室条件下,研究了不同氮（0、0.1、0.4、0.8、1.0、1.2 g/L）、磷（0、0.015、0.025、0.030、0.045、0.060 g/L）浓度下杜氏盐藻生长增殖的关系和特征,以及氮磷比（c（N）/c（P））变化等对该藻生长的影响。实验结果表明：杜氏盐藻对氮、磷有着较强的适应能力,浓度增大藻增长率增大,浓度继续增大反而抑制藻的增长,属于营养依赖型藻类。不同氮质量浓度梯度对杜氏盐藻生长具有显著性影响（P〈0.05）,但对杜氏盐藻生长率K的影响不显著（P〉0.05）,最适宜的氮浓度为1.0 g/L;不同磷质量浓度梯度对杜氏盐藻的生长和生长率K具有显著性的影响（P〈0.05）,最适宜的磷浓度为0.025 g/L。当c（N）/c（P）为40时,最适合杜氏盐藻的生长。     

外源一氧化氮缓解盐胁迫下杜氏盐藻氧化损伤的初步研究

研究外源一氧化氮(NO)供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)缓解3.0 mol/L NaCl胁迫对杜氏盐藻的氧化损伤作用并探讨其初步机理。结果表明:与单独盐胁迫相比,添加低浓度的SNP(0.5μmol/L和1μmol/L)能促进杜氏盐藻的生长,显著提高其叶绿素含量,并增强了超氧化物歧化酶(SOD)的活性(P<0.05)。其中,1μmol/L SNP处理24 h后SOD活性提高了1.6倍。此外,半定量RT-PCR结果显示,低浓度的SNP(0.5μmol/L和1μmol/L)对盐胁迫下杜氏盐藻Fe-SOD基因的转录具有促进作用,24 h时作用显著(P<0.05),表达量分别提高了21.18%和27.41%,而高浓度的SNP(50μmol/L)抑制Fe-SOD基因的表达,加剧了盐胁迫带来的氧化伤害。     

紫苏脂肪酸去饱和酶基因PfFAD2的生物信息学及表达特性分析

为研究脂肪酸去饱和酶基因FAD2在紫苏脂肪酸合成机制中发挥的重要作用,对紫苏FAD2基因及其编码的蛋白质序列进行了详细的生物信息学分析。结果表明,紫苏FAD2基因cDNA全长序列为1 545 bp,ORF为1 149 bp,共编码382个氨基酸残基;紫苏FAD2蛋白属于亲水性蛋白,具有6个典型的跨膜螺旋区,含有PLN02505保守结构域,属于Membrane-FADS-like超蛋白家族;系统进化树分析结果表明,紫苏与芡欧鼠尾草的亲缘关系较近,与红花较远。利用荧光定量PCR技术分析紫苏不同组织以及不同发育时期的种子中FAD2基因的表达特性,结果表明,紫苏FAD2在开花后20 d的种子中表达量最高。研究结果可为进一步阐明紫苏脂肪酸代谢机制奠定理论基础。     

杜氏盐藻促有丝分裂活化蛋白激酶 DsMAPK的原核表达及纯化

盐藻是研究植物耐盐机制的重要模式生物,而 MAPK基因在植物耐盐分子途径中起重要作用。该试验通过PCR扩增DsMAPK基因的开放阅读框（ORF）,并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体 pGS-21a,得到重组表达载体pGS-21a-MAPK。将重组表达载体转化 E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用 GST-SefinoseTM Kit进行纯化,所得产物进行 SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明,该试验成功构建了重组表达载体 pGS-21a-MAPK,经IPTG诱导后表达的融合蛋白与预期相符,纯化后的上清蛋白经 Western blot检测显示该融合蛋白能与抗 GST单克隆抗体特异性结合,具有良好的免疫学活性, DsMAPK的成功表达为进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。     

杜氏盐藻基因DsSP的克隆、分析和原核表达(英文)

[目的]克隆盐藻淀粉磷酸化酶基因,并初步分析其基本性质和表达蛋白。[方法]采用RT-PCR和RACE的方法克隆基因;生物信息学系统分析其性质;构建原核表达载PGS21a-DsSP转化于E.coli BL21表达蛋白,采用GST-SefinoseTMKit和Western Blot分别纯化、检测该融合蛋白。[结果]成功克隆出1种淀粉磷酸化酶(GenBank accession No.KF061044)命名为DsSP;分析得到了其基本性质并预测了该蛋白的亚细胞定位、二级结构和三级结构;该融合蛋白在上清和包涵体中均存在,且对上清蛋白成功纯化;Western Blot检测表明其在E.coli.BL21中成功表达。[结论]为进一步阐明DsSP的功能及作用机制奠定了理论基础。     

甘蓝型油菜FAD2基因调控序列的克隆及瞬时表达分析

油酸去饱和酶FAD2（fatty acid desaturase 2）是广泛存在于植物中的一种能催化油酸脱氢生成亚油酸的还原酶。根据GenBank上已知的甘蓝型油菜FAD2基因设计引物,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）叶片总DNA为模板,进行TAIL-PCR扩增,获得约1.4 kb片段并测序。序列比对结果说明该片段为已知的FAD2基因编码区上游序列。将该片段进行不同长度的5′端缺失,并用缺失后的序列替换pBI221-LUC质粒上的CaMV35S启动子,构建了甘蓝型油菜瞬时表达载体,进行油菜原生质体瞬时表达的初步研究,结果表明该序列5′端-669 bp至-1019 bp对报告基因表达水平有较大的影响。结合启动子预测分析结果,此片段中可能存在的赤霉素应答元件、光调控元件等顺式作用元件对FAD2基因的表达调控具有重要作用。     

杜氏盐藻促有丝分裂活化蛋白激酶DsMAPK的原核表达及纯化（英文）

盐藻是研究植物耐盐机制的重要模式生物,而MAPK基因在植物耐盐分子途径中起重要作用。该试验通过PCR扩增Ds MAPK基因的开放阅读框(ORF),并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体p GS-21a,得到重组表达载体p GS-21a-MAPK。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用GSTSefinoseTMKit进行纯化,所得产物进行SDSPAGE和Western blot鉴定。结果表明,该试验成功构建了重组表达载体p GS-21a-MAPK,经IPTG诱导后表达的融合蛋白与预期相符,纯化后的上清蛋白经Western blot检测显示该融合蛋白能与抗GST单克隆抗体特异性结合,具有良好的免疫学活性,Ds MAPK的成功表达为进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。     

亚麻荠FAD2-1和FAD3-1编码蛋白的生物信息学分析

△-12脂肪酸脱氢酶FAD2(fatty acid desaturase 2)和△-15脂肪酸脱氢酶FAD3(fatty acid desaturase 3)是控制亚油酸(18∶2;ω-6)和亚麻酸(18∶3;ω-3)合成的限速酶,亦在植物抵御低温等环境胁迫反应中起重要作用。本文利用生物信息学工具分析了亚麻荠(Camelina sativa)FAD2-1和FAD3-1编码蛋白的理化性质、二硫键、磷酸化位点、高级结构、保守域和功能系统进化等特征。结果表明,FAD2-1和FAD3-1编码蛋白理论pI相近(分别为8.39和8.42),然而前者不稳定系数(40.04)显著高于后者(29.46)。FAD2-1蛋白的磷酸化位点为23个,多于FAD3磷酸化位点(18个),预示FAD2-1更易受翻译后调控。这两种蛋白均含有3个保守的组氨酸富集区(Hisbox),且在C端含有内质网滞留信号,赋予其定位于内质网和催化双键形成的活性。FAD2-1的a-螺旋比例(45.31%)高于FAD3-1(33.16%),然而后者无规则卷曲比例(51.93%)大于前者(44.53%)。3D结构模拟显示,FAD2-1和FAD3-1功能域大小和构象存在差异,这可能影响到底物选择性和催化效率。这些结果为全面解析亚麻荠种子油脂合成和ω-3族脂肪酸富集的分子机理提供了科学参考。     

包埋-脱水法常温和低温下保存盐生杜氏藻的研究

用包埋-脱水法在常温和低温保存盐生杜氏藻（Dunaliella salina）,探讨了温度、光暗和含水量等因素对存活率的影响。结果表明：盐生杜氏藻在4℃下保存6个月后的最高存活率达到54．4％。保存后的藻细胞经过恢复培养后,其生长力可达到保存前的水平。包埋-脱水法操作简单,无需复杂设备,在藻类种质的中期保存中有广阔的应用前景。     

小麦胁迫相关基因TaUCE2的克隆及表达模式分析

前期通过对耐旱小麦的RNA-Seq分析发现,转录本TRIAE_CS42_3DL_TGACV1_252817_AA0892160在干旱胁迫下表达量下降;通过克隆、生物信息学分析发现,该转录本包含一个444 bp的完整编码区,编码147个氨基酸,蛋白结构分析其含有一个UBC结构域,与山羊草泛素结合酶(E2)的氨基酸序列完全一致,证明该基因为泛素结合酶(E2)基因(Ta UCE2)。蛋白序列比对发现其第7、91、144位置处的氨基酸在单双子叶植物之间是特异的。进化分析发现该基因是在单双子叶植物进化后期分化的。荧光定量PCR分析表明,该基因响应ABA、干旱、高盐、低温的胁迫,在四种胁迫下,该基因在根中的表达量均降低。本研究为进一步分析泛素蛋白酶体途径在小麦逆境响应中的功能和机制奠定基础。     

番茄BZR基因家族鉴定及非生物胁迫下表达模式分析

番茄是一种世界性蔬菜,BZR基因在植物生长发育中发挥重要作用,但目前有关番茄BZR基因响应非生物胁迫研究较少.为更好研究BZR基因在番茄中分布与功能,研究共鉴定9个SlBZR基因家族成员,并利用生物信息学技术分析其基本信息、保守基序、染色体定位、系统进化、顺式作用元件及非生物胁迫下表达模式.结果表明,9个SlBZR基因成员分布在番茄8条染色体上.qRT-PCR分析表明,SlBZR基因在植物逆境或激素响应方面具有重要作用.SlBZR3和SlBZR8在非生物胁迫中明显上调表达,说明其可能在番茄响应非生物胁迫中发挥重要作用.研究为进一步探索番茄BZR基因功能提供理论依据.     

番茄OSCA基因家族鉴定及不同胁迫条件下表达分析

为阐明高渗性钙离子通道OSCA基因在不同胁迫条件下作用,基于番茄全基因组信息,从栽培番茄中鉴定出12个SlOSCA基因,均含DUF221结构域,分别位于1、2、4、6、7、8、9、12号染色体上,亚细胞定位分析表明均位于质膜和高尔基体上。系统进化分析显示SlOSCA基因家族可分为5个进化群。根据番茄表达量数据库组织特异性分析发现,SlOSCA基因家族在不同组织部位表达量不同,其中根部和叶片表达量相对较高。Real-time PCR结果表明,多数SlOSCA基因响应干旱、盐、低温、ABA和灰霉病胁迫。SlOSCA基因响应ABA胁迫普遍强烈,受低温胁迫影响较小。其中SlOSCA9受干旱、盐和ABA胁迫强烈诱导,SlOSCA10受灰霉病胁迫强烈诱导。     

甘蔗栽培种WRKY基因家族鉴定及其在黑穗病菌胁迫下的表达分析

从甘蔗栽培种R570基因组数据库中挖掘到60个ShWRKY(ShWRKY1～ShWRKY600)基因,分布于10条染色体上,每条染色体上有3～13个ShWRKY基因.系统进化树分析表明60个ShWRKY蛋白中,属于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类的分别有10、32和18个.所有ShWRKY家族成员皆为亲水性核定位蛋白,且除ShWRKY13为稳定蛋白外,其余家族成员都不稳定.ShWRKY基因家族的外显子数目为1～5个,保守基序数目为3～7个.启动子区域序列预测显示,ShWRKY基因包含多个与胁迫、生长发育和激素响应相关的顺式作用元件.表达谱分析显示,ShWRKY基因在甘蔗不同组织中差异表达,且参与对黑穗病菌胁迫的响应过程.RT-qPCR检测结果显示,接种黑穗病菌7 d后,ShWRKY37基因在2个甘蔗抗病品种和1个感病品种中上调表达,而在另外1个感病品种中下调表达;ShWRKY51基因则在抗病品种中下调表达,而在感病品种应答早期(1 d)上调表达.     

玉米ZmREM基因的克隆与逆境胁迫后表达分析

B3超家族基因是植物中特有的一类转录因子,参与植物生长发育、形态建成及抗逆境胁迫等过程。从玉米黄早4中获得一个含有2个B3-DNA结合域的基因,为B3超家族基因,命名为ZmREM。该基因全长1 047 bp,编码含有349个氨基酸的蛋白。Blast比对结果表明,ZmREM和谷子含有B3结构域蛋白、高粱的假定蛋白相似性分别为81%和84%。ZmREM基因是组成型表达,在根中表达量最高。同时ZmREM基因的转录水平可以为干旱、盐、冷和热所诱导。因此,ZmREM可能参与玉米多种非生物胁迫应答途径。     

亚麻MAPK基因克隆及盐碱胁迫下的表达分析

为研究MAPK基因与亚麻应答盐碱胁迫的关系,利用生物信息学方法从亚麻基因组中预测得到20个亚麻MAPK基因,命名为Lu MPK1~Lu MPK20,这20个MAPK基因都含有T[D/E]Y保守结构域,除Lu MPK5和Lu MPK20以外,其他基因都是两两一组。利用PCR技术克隆得到5个亚麻MAPK基因(Lu MPK3、Lu MPK8、Lu MPK11、Lu MPK14、Lu MPK16),这5个基因序列与预测序列完全一致。利用数字基因表达谱数据,分析亚麻盐碱胁迫下这5个基因的表达情况。结果表明,这5个基因的表达均受到盐碱胁迫影响。Lu MPK3、Lu MPK11、Lu MPK14、Lu MPK16在中性盐胁迫下上调表达,Lu MPK3、Lu MPK8、Lu MPK11、Lu MPK14在碱性盐胁迫下上调表达,Lu MPK16在碱性盐胁迫下下调表达。研究为亚麻MAPK基因功能,尤其是耐盐碱功能研究奠定理论基础。     

水稻免疫亲和素基因家族的克隆及对非生物逆境胁迫的响应分析

为探究在非生物逆境胁迫条件下免疫亲和素（immunophilins）基因家族在水稻（Oryza sativa L. japonica Nipponbare）中的功能,利用生物信息学技术鉴定水稻中免疫亲和素基因家族成员,并进行克隆及组织特异性、非生物逆境胁迫下的表达分析。结果表明,水稻基因组中存在30个OsFKBPs及29个OsCYPs免疫亲和素家族基因。30个OsFKBPs主要聚类为3个大的亚群,29个OsCYPs主要聚类为4个大的亚群。通过PCR扩增得到完整的OsFKBPs与OsCYPs基因编码序列,且序列信息与预测一致。OsFKBPs与OsCYPs基因在水稻的各个组织、各个发育时期均有不同程度的表达。OsFKBP19在各组织各发育时间表达量较为一致;OsCYP29在叶鞘中表达量最高而OsCYP57在根中表达量最高。定量PCR结果显示,在高光强胁迫处理4 h后水稻叶片中OsCYP37基因被诱导持续上升表达,而在渗透胁迫及盐胁迫处理中无显著变化;高光强及渗透胁迫处理4 h后水稻叶片中OsFKBP19持续上升表达,而在盐胁迫处理中波动上升表达。 综上,OsFKBPs及OsCYPs参与水稻的高光强、渗透胁迫及盐胁迫应答过程。     

玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT4克隆及其低温胁迫下的表达模式

[目的]克隆玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT4,并明确其组织表达特性及在低温胁迫下的表达模式,为深入研究SUT4基因响应低温胁迫的作用机理提供理论依据.[方法]以玉米自交系黄早四幼苗为材料,采用RT-PCR克隆其ZmSUT4基因,分析其生物学信息,构建系统发育进化树,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其组织表达特异性及低温胁迫(4℃)下不同组织中的表达模式.[结果]克隆获得的ZmSUT4基因(GenBank登录号MK541991)全长为1621 bp,开放阅读框(ORF)长度为1506 bp,编码501个氨基酸,编码蛋白的分子量53.36 kD,理论等电点(pI)8.84,具有12个跨膜结构,定位于细胞膜上,既属于易化扩散载体(MFS)家族成员,也属于蔗糖/H+共转运体(GPH)超家族成员,其中第25~447位氨基酸是MFS家族蛋白的保守结构域,第17~484位氨基酸是GPH超家族成员的蔗糖运转子保守结构域GPH-sucrose.ZmSUT4蛋白的氨基酸序列与单子叶植物SUT4蛋白同源性较高,为86%~96%,聚集在同一分支上;与双子叶植物SUT4蛋白同源性较低,为62%~65%,说明该类蛋白在不同物种间高度保守.ZmSUT4基因在玉米的根、茎和叶中均有表达,以根中的表达量最高,其次是叶,茎中的表达量最低.低温胁迫下,ZmSUT4基因在不同组织中表达量模式不同,根和叶中ZmSUT4基因表达量均在胁迫24 h达最大值,分别是低温胁迫前(0 h)表达量的2.21和2.62倍,茎中的ZmSUT4基因表达量在胁迫6 h达最大值,是低温胁迫前表达量的3.01倍.[结论]ZmSUT4基因受低温胁迫诱导表达,推测其是调控玉米响应低温胁迫的关键基因.     

甘蔗ATP结合蛋白基因克隆及其干旱胁迫下的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗ATP结合蛋白基因,分析其基本生物学信息及在干旱胁迫下的表达特性,为ATP结合蛋白的功能研究提供理论依据.[方法]从乙烯诱导甘蔗差异表达转录组和水分胁迫下甘蔗cDNA文库中获取ATP结合蛋白基因序列,设计其引物进行RT-PCR扩增,利用生物信息学软件进行序列分析及其蛋白结构和功能预测,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测干旱胁迫处理下的甘蔗ATP结合蛋白基因的表达情况.[结果]克隆获得的甘蔗ATP结合蛋白基因全长2145bp,编码714个氨基酸,其蛋白分子质量为79.430kD,理论等电点(pI)为9.33,不稳定系数为44.38;甘蔗ATP结合蛋白与玉米ATP结合蛋白的核苷酸序列及其推导氨基酸系列同源性最高,均达93%.甘蔗ATP结合蛋白主要由无规则卷曲(42.02%)、α螺旋(25.63%)和延伸链(22.27%)结构组成,具有蛋白激酶催化结构域、ATP结合位点、核苷酸结合位点(NBS)、糖基化位点、激酶磷酸化结合位点及核定位信号等;甘蔗ATP结合蛋白可能主要定位在细胞核、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体中,起中间代谢调控作用,或参与转录调控、免疫应答、胁迫应答及信号转导等生物反应.qPCR检测结果显示,在干旱胁迫7d后,甘蔗ATP结合蛋白基因的表达量明显下调,约为对照的30%,恢复正常供水(复水)后,表达量回升.[结论]甘蔗ATP结合蛋白基因表达受干旱胁迫诱导,可能参与甘蔗对干旱逆境胁迫响应的代谢调控.     

甜瓜CmCIPK家族全基因组鉴定和逆境条件下的表达分析

为探究甜瓜CIPK(CBL-interacting protein kinase)基因家族成员的生物学功能,以拟南芥中26个CIPKs的氨基酸序列为参照,用BLASTP方法鉴定了18个甜瓜CIPK家族成员,并对其理化性质、染色体分布、系统进化、基因结构、蛋白保守基序、顺式元件,以及基因的表达模式进行了分析。结果显示,CIPK基因家族成员的基因长度为1 499~8 499 bp,它们不均匀地分布在甜瓜的9条染色体上;根据进化关系可将其分为5个亚家族,分别包含了26、10、25、26和8个成员,并且其中有4个CmCIPK基因对发生了片段复制。基因结构分析表明,10个基因为内含子缺失型,8个基因为内含子富集型。蛋白保守基序分析发现,CmCIPK家族保守性较好,所有成员均含有CIPK家族的典型特征:N端激酶域中的激活环和C端调节域中的NAF/FISL结构域。在基因上游的2 000 bp序列中存在多个与植物激素和逆境相关的顺式元件,显示可能有多种转录调控。转录组分析发现,CmCIPKs的组织表达量整体表现为叶>根>雄花>雌花>果。选择CmCIPK1-like和CmCIPK12-like基因验证其组织表达模式,显示分别在叶和雄花中的表达量最高。对其进行不同逆境处理,结果表明,这2个CmCIPK基因受NaCl和脱落酸(ABA)诱导表达;在干旱处理中,这2个基因经历短时间的上调或下调后恢复至最初表达水平。以上结果说明,CmCIPK1-like和CmCIPK12-like基因可能在ABA和非生物胁迫中发挥着重要作用,可为以后CmCIPK的功能研究提供参考。     

菜粉蝶HSP20基因的克隆及温度胁迫下表达分析

[目的]克隆分析菜粉蝶(Pieris rapae)热激蛋白20基因(HSP20),并检测其在温度胁迫下的表达情况,为探析菜粉蝶适应温度胁迫机制提供参考.[方法]以菜粉蝶为试验材料,采用RT-PCR和RACE克隆获得菜粉蝶HSP20基因cDNA全长,并通过生物学软件分析其序列,明确其基因结构特征和亲缘关系;采用实时荧光定量PCR检测菜粉蝶HSP20基因在低温(-20~0℃)和高温(5~45℃)胁迫下的表达响应.[结果]菜粉蝶HSP20基因全长725 bp,5'-端非编码区105 bp,3'-端非编码区109 bp,开放阅读框531 bp,编码176个氨基酸,预测蛋白分子量19.5 kD,理论等电点6.61;其编码氨基酸序列中含有1个典型的HSP20家族结构域(位于第60~142位氨基酸)、1个α-晶体蛋白(位于第60~157位氨基酸)和1个Allato allatostatin(位于第14~24位氨基酸);基序列相似度分析其与二化螟、家蚕和甘蓝夜蛾HSP20蛋白氨基酸相似度较高并聚为一族.该基因随环境温度的升高或降低发生变化,在-5和40℃诱发该基因高效表达.[结论]低温和高温均能诱导菜粉蝶HSP20基因高效表达.