桑树光合系统ⅡMPsbR基因的克隆及在不同部位表达分析

根据桑树表达序列标签(ESTs),采取RT-PCR方法克隆了一个编码桑树光合系统ⅡPsbR基因的全长cDNA序列,以期为从分子水平上揭示桑树高效光合作用的机制奠定基础.序列分析表明,该基因全长623bp,存在56 bp的5'-UTR和306bp的3'-UTR,其开放阅读框(ORF)长261bp,编码86个氨基酸,预测蛋白质分子质量为8.95 kD,等电点为11.09.同源分析表明,桑树光合系统ⅡMPsbR基因与花生、大豆编码氨基酸具有较高的同源性;根据MPsbR基因的氨基酸序列与其他20个物种的氨基酸同源序列构建的系统进化树表明,桑树与花生、海桑、梨、大豆的亲缘关系较近.半定量RT-PCR研究表明,桑树光合系统MPsbR基因在桑树不同部位的表达水平有一定差异,在幼叶(刚展开第一张叶)和顶芽表达量最高,其作用机理有特于进一步研究之中.     

梨NAC结构域蛋白基因克隆与mRNA嫁接传递性研究

【目的】克隆梨NAC结构域蛋白基因NACP,验证其mRNA是否可以通过韧皮部进行嫁接传递。【方法】利用同源克隆的方法,分别克隆‘鸭梨’(Pyrus bretschneideri Yali)和杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)的NACP基因,利用生物信息学方法进行序列分析。以‘鸭梨’为接穗,杜梨为砧木进行微嫁接。从接穗茎尖、叶片、茎段韧皮部,嫁接口及砧木韧皮部、木质部组织中提取RNA,进行RT-PCR扩增。用特异的限制性内切酶ScrFⅠ对其扩增产物进行酶切鉴定。利用原位杂交技术,检测NACP基因在植物体内的表达部位。【结果】获得‘鸭梨’和杜梨NACP基因全长序列,长度均为1377bp,编码350个氨基酸,包含两个内含子,大小分别为111、96bp,分别命名为YL-NACP和DL-NACP。酶切鉴定结果表明,在接穗‘鸭梨’茎尖、叶片、茎段韧皮部中都有砧木DL-NACP基因的mRNA表达,同时砧木杜梨韧皮部中也有接穗YL-NACP基因的mRNA表达,而木质部中则没有发现该基因表达。通过原位杂交进一步证明,NACP基因只定位于韧皮部。【结论】成功地从‘鸭梨’和杜梨中克隆了全长的NAC结构域蛋白基因NACP,并进一步证明了梨内源性的NACP基因mRNA可以通过韧皮部进行传递,该结果为进一步研究果树砧木与接穗的互作机制奠定了基础。     

陆地棉CC-NBS-LRR基因的克隆及特征分析

根据抗病基因核苷酸结合位点(Nuc leotide b ind ing site,NBS)设计简并性引物,从陆地棉cDNA中进行RT-PCR扩增。获得含NBS保守域的EST,进一步用RACE技术和TAIL PCR技术获得其中1个EST的全长基因序列,并获得GHNBS基因的5′调控序列。此基因被命名为GHNBS。该基因的编码区长2 583 bp,编码861个氨基酸,GHNBS编码的氨基酸序列与拟南芥R基因具有28%的同源性。GHNBS与拟南芥的其他几个NBS-LRR基因比较发现,它们在保守区外的相似性相当低。Southern杂交和网上数据库搜索分析都表明GHNBS是1个寡拷贝基因。通过半定量RT-PCR分析发现GHNBS在棉花的蕾、花瓣、韧皮部、根及叶中均有表达且在根、叶中表达量比其它部位强,在木质部基本不表达。     

桑树SPL转录因子家族全基因组鉴定及特征分析

SQUAMOSA启动子结合类蛋白质(SQUAMOSA promoter binding protein-like,SPL)是一类植物生长发育和应对胁迫相关的重要转录因子。利用生物信息学方法,从川桑(Morus notabilis)基因组中鉴定到15个SPL基因,进化分析将其归为8个聚类组,其具有保守的基因结构和氨基酸基序,在拟南芥和水稻中存在多个直系同源基因,预测到7个MnSPLs基因的表达受miR156/157调控,MnSPLs在桑树多个组织中检测到表达,其中6个基因在5类组织中均有较高表达量,部分基因主要在冬芽和雄花中有较高表达量,MnSPL基因存在组织表达特异性,在桑树生长发育过程中发挥重要作用。     

水稻OsSAMT1基因的克隆及其遗传转化

采用RT-PCR法从水稻中成功克隆了1个水杨酸甲酯转移酶基因(OsSAMT1),构建了该基因的超表达载体,通过农杆菌介导法转化粳稻品种日本晴,获得10个转基因阳性植株.生物信息学分析结果表明,水稻基因组中共有12个OsSAMT1的同源基因,它们分别属于第6和第11号染色体上的2个基因族,而位于第2号染色体上的OsSAMT1基因与第6号染色体上的同源基因具有更高的相似性.     

家蚕糖转运蛋白BmST5基因的克隆与转录活性检测

根据GenBank已登陆的糖转运蛋白序列与家蚕基因组框架图和EST序列,获得家蚕同源糖转运蛋白基因BmST5。基因编码区长1 527 bp,编码508个氨基酸,预测蛋白分子质量为55.67 kD。序列分析结果显示,该基因有典型的Sugar_tr结构域和12个疏水的跨膜结构域,与体虱等同源蛋白的一致性在50%以上。RT-PCR结果表明,该基因仅在家蚕的马氏管、生殖腺和头中有表达,在中肠、丝腺、血液、体壁和脂肪体中不表达。     

桑树二倍体及其人工诱导同源四倍体遗传差异的RAPD分析

【目的】从DNA分子水平分析不同桑树二倍体及其人工诱导同源四倍体的遗传差异,为进一步探讨桑树多倍体诱变遗传规律提供理论依据。【方法】利用RAPD分子标记技术,对8个桑树二倍体品种与经秋水仙碱化学诱变获得的同源四倍体进行RAPD多态性和聚类分析。【结果】不同桑树品系二倍体间及与其人工诱导的同源四倍体间的RAPD多态性均存在明显差异。农桑8号和湖桑199号的二倍体及其同源四倍体间的扩增条带完全一致,诱导未产生变异;湖桑32号的二倍体及其同源四倍体的RAPD多态性最高,达到20.41%,桐乡青、璜桑37号、湖桑197号、国桑20号和育71-1的二倍体及其同源四倍体的RAPD多态性由高到低依次分别为9.09%、6.06%、5.45%、5.17%和3.17%。不同桑树品系间可以分为2大类,其中湖桑32号和桐乡青聚为一大类。【结论】不同桑树品系二倍体经秋水仙碱诱变后产生的遗传差异较大。     

新疆早实核桃FLOWERING LOCUS C同源基因的克隆与序列分析

[目的]通过克隆得到新疆早实核桃FLC同源基因,对其相关生物信息学进行分析,为在分子生物学水平上揭示早实核桃成花机理奠定基础.[方法]通过RT-PCR法克隆获得早实核桃FLC的同源基因cDNA全长.采用生物信息学手段对该基因的保守结构域、疏水性和二级结构进行分析.[结果]该基因命名为Pw-FLC基因,在GenBank注册,登记号为KF729795.PwFLC基因含开放阅读框612 bp,编码203个氨基酸,具有典型的MIKC型MADS-box结构域.[结论]该片段与其他植物的FLC同源基因序列同源性达48;～ 97;.推测该蛋白分子量为23.779 kD,理论等电点为5.96.     

桑树二倍体及其人工诱导同源四倍亿遗传差异的RAPD分析

【目的】从DNA分子水平分析不同桑树二倍体及其人工诱导同源四倍体的遗传差异,为进一步探讨桑树多倍体诱变遗传规律提供理论依据。【方法】利用RAPD分子标记技术,对8个桑树二倍体品种与经秋水仙碱化学诱变获得的同源四倍体进行RAPD多态性和聚类分析。【结果】不同桑树品系二倍体间及与其人工诱导的同源四倍体间的RAPD多态性均存在明显差异。农桑8号和湖桑199号的二倍体及其同源四倍体间的扩增条带完全一致,诱导未产生变异;湖桑32号的二倍体及其同源四倍体的RAPD多态性最高,达到20．41％,桐乡青、璜桑37号、湖桑197号、国桑20号和育71—1的二倍体及其同源四倍体的RAPD多态性由高到低依次分别为9．09％、6．06％、5．45％、5．17％和3．17％。不同桑树品系间可以分为2大类,其中湖桑32号和桐乡青聚为一大类。【结论】不同桑树品系二倍体经秋水仙碱诱变后产生的遗传差异较大。     

桑青枯雷尔氏菌MR111的GspF基因的获取与结构分析

Gsp F是细菌Ⅱ型分泌系统的内膜平台的重要蛋白,利用PCR扩增技术,获得了桑青枯雷尔氏菌MR111的含有该类基因功能性结构域的Gsp F基因。NCBI在线BLASTP分析发现,该基因与雷尔氏菌属来源的同源基因的一致性在90%以上;在聚类分析中,首先所有雷尔氏菌属同源基因聚合在同一分支,后与皮氏罗尔斯顿菌的同源基因聚合。基因结构分析表明,该基因有2个由α螺旋组成的具有高度相似性的、跨膜胞质结构域,揭示该基因可能参与细菌的跨膜分泌。     

大白菜BrARGOS基因的分离与功能分析

 【目的】从大白菜自交系日喀则的叶片中分离新的拟南芥ARGOS的同源基因,进行氨基酸序列比对和该基因的表达模式分析,转化拟南芥分析其功能,并分析该基因的表达量与大白菜叶杂种优势之间的关系。为在大白菜中研究该基因的功能提供依据。【方法】利用RT-PCR从大白菜叶中分离出ARGOS同源基因的cDNA序列,采用DNAMAN软件分析该基因所编码的蛋白质的二级结构,通过半定量RT-PCR检测该基因在大白菜各器官中的表达水平,分析转基因拟南芥的表型鉴定该基因的功能,通过半定量RT-PCR分析该基因的表达量与大白菜叶的杂种优势之间的关系。【结果】根据拟南芥ARGOS序列,通过Blast检索到大白菜BAC库中的序列,根据该序列设计特异引物,以提取自日喀则叶片的RNA反转录产物为模板,通过PCR扩增出1个新的ARGOS的同源基因BrARGOS。对大白菜、拟南芥和番茄中3个基因所编码的蛋白质做序列比对分析发现,这3个蛋白质的C末端富含亮氨酸。BrARGOS蛋白的二级结构含有自由卷曲、伸展片段和α-螺旋。通过半定量RT-PCR分析,在大白菜各器官中均检测到BrARGOS基因的表达,在果荚中表达量最高,其次为子叶,茎生叶中表达量最低。通过PCR检测阳性转化体拟南芥基因组显示,NPTⅡ基因已经转入拟南芥基因组中,表明外源BrARGOS基因也同时转入拟南芥基因组中。与转空载体对照拟南芥相比,过量表达BrARGOS基因的转基因拟南芥的叶、花、叶鲜重和株高均显著增大/高。【结论】从大白菜自交系日喀则叶片中分离了1个新的ARGOS的同源基因BrARGOS,并分析了BrARGOS基因的表达模式和功能。在拟南芥中过量表达BrARGOS基因使拟南芥的地上器官显著增大。大白菜BrARGOS基因可能与调节植物器官大小有关。     

桑树WRKY转录因子的全基因组鉴定及生物信息学分析

[目的]明确桑树基因组中WRKY转录因子家族结构及其功能特征,为进一步揭示WRKY转录因子家族生物学功能提供科学依据.[方法]利用生物信息学方法对桑树WRKY转录因子的数目、类型、结构、系统进化关系、保守结构域和密码子使用偏性等进行全面分析.[结果]基于桑树全基因组蛋白数据库,共鉴定出55个桑树WRKY转录因子家族基因,占桑树基因总数(29261)的1.88%.桑树WRKY转录因子存在6种内含子数量类型及15种内含子相位类型,其中27个基因含有2个内含子,25个基因的相位类型为2-2型.保守结构域系统进化分析结果显示,桑树WRKY转录因子家族蛋白主要分为三大类(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ),Ⅰ类可分为ⅠN和ⅠC两个亚组,Ⅱ类根据聚类情况又可分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe等5个亚组.桑树WRKY转录因子蛋白保守结构域分析发现有五类Motif的保守性较强,桑树WRKY转录因子蛋白中均包含C端Motif l,Ⅰ类蛋白同时含有N端Motif 3.桑树WRKY转录因子家族基因启动子区富含PBF(C2H2锌指因子)和AHL(拟南芥hook因子)元件.密码子使用偏性分析结果显示,桑树WRKY转录因子家族基因的有效密码子数(ENC)介于48.00~60.00,密码子第3位GC含量(GC3s)介于0.330~0.722,平均亲水性值(Gravy)均为负值;同义密码子相对使用度(RSCU)>1.000的密码子有29个,且以A(6个)或T(11个)结尾较G(4个)或C(8个)结尾的略多.[结论]桑树WRKY转录因子家族包含55个成员,内含子相位类型一致的同组成员可能来源于同一祖先基因,且与基因复制和基因组重排有关;蛋白序列高度保守,在植物抵御环境胁迫过程中发挥作用;基因密码子使用偏性较弱,主要受碱基突变选择压力影响.     

家蚕糖转运蛋白BmST1基因的克隆与序列分析

糖转运蛋白运输葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖等透过细胞膜为机体提供能量.根据GenBank已登陆的其他物种的糖转运蛋白序列与家蚕基因组框架图和EST序列获得家蚕同源糖转运蛋白基因BmST1.基因编码区长1 392 bp(GenBank登录号:FJ373021),编码463个氨基酸,预测蛋白分子质量为51.635 kDa.序列分析显示基因有2个外显子,含有11个跨膜结构域.RT-PCR表明该基因仅在此文所检测的家蚕丝腺中表达.     

桑树二倍体及人工诱导的同源四倍体遗传差异的SRAP分析

利用SRAP分子标记技术,对8份桑树二倍体品种和经秋水仙碱化学诱变得到的同源四倍体进行DNA遗传差异研究和聚类分析。结果表明:桑树不同材料二倍体及其同源四倍体间的SRAP多态性有明显差异。农桑8号、璜桑37号、湖桑197号、湖桑199号和国桑20号的二倍体及其同源四倍体间的扩增条带完全一致,无差异,而育71-1二倍体及其同源四倍体的SRAP多态性最高,达到1.41%,所有的二倍体及其同源四倍体材料均聚在一起,不同材料间亲缘关系近的聚为一大类。说明不同桑树材料经秋水仙素诱变后产生的遗传差异较大,桑树二倍体及其同源四倍体产生变异的原因可能是染色体上的等位基因积加效应造成DNA分子遗传结构的改变。     

不同启动子在转基因烟草中抗番茄黄化曲叶病毒的研究

为了提高植物对番茄黄化曲叶病毒的抗性,利用CaMV35S启动子、棉花韧皮部特异启动子PGHNBS、拟南芥韧皮部特异启动子SUC2分别构建了含有不同启动子控制下的烟粉虱内GroEL基因的植物表达载体P-Gro-EL、P-PGHNBS-GroEL、P-SUC2-GroEL。通过农杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。RT-PCR结果表明,3个启动子皆驱动GroEL基因在转基因烟草中表达。对转化再生烟草的一次病毒注射侵染结果显示,共有19株抗性烟草植株,其中,转P-GroEL载体的有7株,转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各有6株;2次病毒注射侵染的结果显示,获得7株抗性烟草植株,它们是转P-GroEL载体的1株、转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各3株。2次接种的试验结果表明,PGHNBS和SUC2转基因烟草植株的抗病效果均比CaMV35S转基因植株明显。证明利用韧皮部特异表达GroEL基因可以获得抗番茄黄化曲叶病毒的转基因植物。     

蓖麻DNA甲基转移酶序列与基因表达分析

植物DNA甲基化是与调控基因表达、保护基因组免受逆境胁迫等相关的表观遗传现象,其中关键酶DNA甲基转移酶催化DNA序列维持甲基化和从头甲基化。本研究基于蓖麻全基因组、利用生物信息学分析方法、结合转录组数据和RT-PCR半定量表达分析,鉴别出蓖麻DNA甲基转移酶氨基酸序列的结构特征、系统发生和表达形式。结果如下:通过同源序列BLAST从蓖麻基因组数据库中获得8个DNA甲基转移酶基因;系统进化分析将8个蛋白分为4个亚家族:2个MET同源蛋白、2个CMT同源蛋白、3个DRM同源蛋白和1个DNMT2同源蛋白,进一步发现DNA甲基转移酶在系统进化上较为保守,分化发生在单双子叶植物分化之后;亚细胞定位分析发现8个DNA甲基转移酶都定位在细胞核中;蛋白结构域比对结果显示8个蛋白的C端催化结构域都有6个保守motif参与甲基化修饰催化功能,表明蛋白具有基本的催化甲基化功能,而N端调节功能域的差异将蛋白分为四类,其中Rc DNMT2缺少N端调节结构域;结合转录组数据和RT-PCR半定量表达分析发现蓖麻DNA甲基转移酶基因(除Rc DRM2外)在发育胚乳中相对其他检测组织高表达,推测是该时期的胚乳低甲基化诱导甲基化基因高表达。该结果有助于全面了解蓖麻DNA甲基转移酶特征及为从表观遗传深入开展蓖麻品种改良具有重要理论指导作用。     

鸭骨形成蛋白4基因的克隆和序列分析

通过比较基因组学方法,采用RT-PCR技术克隆了鸭骨形成蛋白4(BMP4)基因的1 256 bp cDNA序列,包含44 bp的5'非翻译区和1 212 bp的完整编码序列(编码404个氨基酸);对该基因的结构分析得知鸭BMP4基因包含2个外显子和1个内含子.经同源比对发现该编码序列与鸡的BMP4基因相似性达95.5%...     

版纳微型猪近交系B4GALNT2基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析

【目的】研究异种器官移植免疫排斥相关基因B4GALNT2的亚细胞定位情况。【方法】以版纳微型猪近交系(BMI)为试验对象,通过RT-PCR方法获得B4GALNT2基因cDNA序列,运用分子克隆技术构建B4GALNT2和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,将其转染猪肾上皮细胞PK15进行瞬时表达,同时用Mito Tracker和Hoechst33342荧光染料分别对线粒体和细胞核染色,通过EGFP示踪检测B4GALNT2在PK15细胞中的表达和定位。【结果】成功构建了BMI B4GALNT2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,转染PK15细胞后主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白的表达,试验结果与PSORTⅡserver网站的预测一致。【结论】B4GALNT2蛋白主要定位于细胞质,揭示该蛋白主要在细胞质中发挥其功能作用。     

普通烟草CDPK基因家族的克隆及表达分析

 【目的】从烟草中分离更多CDPK基因,分析该基因家族的序列特征、进化关系和表达谱,为全面揭示其功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR、RACE和生物信息学的方法,分离普通烟草CDPK基因;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用RT-PCR研究普通烟草全长基因的表达谱。【结果】分离到普通烟草CDPK基因8个,其中3个可以找到完整的开放读码框;系统进化树分析显示,烟草属11个全长CDPK基因位于4个亚家族,预测的2对普通烟草和拟南芥的直系同源基因在功能上可能非常保守;3个普通烟草全长基因虽然在所有的组织中都能检测到,但是它们的表达谱在不同的组织间存在明显差异。【结论】分离到8个未报道的普通烟草CDPK基因,结合已有的报道,目前在普通烟草中获得了15个CDPK基因,为在基因组范围内研究普通烟草CDPK基因家族的功能奠定了基础。     

绵羊UCP4基因编码序列的克隆和mRNA表达研究

【目的】克隆绵羊UCP4基因的编码序列（CDS）,分析CDS及其编码蛋白结构特点,并探讨其mRNA的发育性表达规律,以期为该基因的结构和功能研究奠定理论基础。【方法】利用RT-PCR技术从绵羊大脑组织中扩增出该基因的编码区序列,运用生物信息学方法分析UCP4蛋白的理化性质和结构特点。利用实时荧光定量PCR技术,对两个具有显著尾型差异的绵羊品种（广灵大尾羊和小尾寒羊）2、4、6、8、10和12月龄共计96个个体的8种组织（大脑、小脑、下丘脑、垂体、皮下脂肪、肾周脂肪、肠系膜脂肪和尾部脂肪）进行mRNA表达研究。【结果】绵羊UCP4基因CDS区长972 bp,编码323个氨基酸,分子量为35.73 kDa,等电点为9.43。二级结构中α螺旋、β折叠股和环分别占56.04%、7.12%和36.84%。该蛋白为跨膜蛋白,无信号肽,但有2个糖基化位点和15个潜在的磷酸化位点。UCP4 mRNA在脑组织和脂肪组织中均有表达,但高表达于脑组织中。品种、月龄和组织对UCP4 mRNA表达均有显著影响。【结论】获得了绵羊UCP4 基因的CDS全序列,揭示了其mRNA的表达特征及其影响因素,对进一步研究该基因的结构及其与能量代谢的关系具有重要科学意义。