绵羊凝血酶敏感因子1(TSP-1)基因的克隆及在不同生长时期卵泡中的表达

凝血酶敏感因子1(TSP-1)基因在模式动物中发挥着各种生物学功能,FSH诱导后羔羊TSP-1的表达显著下调,而成年羊在激素诱导前后则无显著变化。为探究TSP-1基因的序列结构及生物学功能,实验采用PCR扩增的方法获得阿勒泰羊TSP-1基因的CDS区全长,软件分析TSP-1基因的蛋白质序列及其功能区域,同时利用荧光定量PCR的方法检测5头1周岁阿勒泰羊10个组织中的表达情况。结果显示,TSP-1基因序列全长为3 519 bp,共编码1 172个氨基酸,与预测序列相比有2个无义突变。系统进化树分析表明绵羊与牛、野猪的遗传距离较近。TSP-1蛋白结构不稳定,不存在跨膜结构,有一个信号肽,可能存在6个N-糖基化位点、50个潜在O-糖基化位点以及44个潜在的磷酸化位点,与TSP-3蛋白含有2个长重复区、3个短重复区、6个C型Ga离子结合位点和一个N型Ga离子结合位点。TSP-1基因在阿勒泰羊7个组织中都有表达,随着卵泡直径的增大,TSP-1基因的表达也逐渐升高。试验结果推测TSP-1基因可能在绵羊卵泡发育中发挥重要作用。     

大豆质膜内在水孔蛋白的生物学功能预测

[目的]利用生物信息学方法对大豆质膜内在水孔蛋白（GrnPIP）的亚细胞定位、跨膜区、信号肽和磷酸化住点进行预测,为基因的功能研究提供参考。[方法]从干旱胁迫后磊抗旱大豆品种21的叶片中克隆出GmPIP基因．利用PSLpced、Protcomp Version8．0、WoLF PSORT、CELLO v2．5等亚细胞预测工具进行亚细胞定位预测;利用TMHMM Serverv．2．0进行蛋白跨膜区分析;利用NetPhos 2．0 Server进行磷酸化位点分析;利用SignaIP3．0 Server程序进行信号肽分析。[结果]综合4种工具的预测结果表明,GmPIP蛋白包含6个跨膜区,亚细胞定位预测表明该蛋白位于细胞质膜上,发现该蛋白的第254个氧基酸是一个潜在的糖基化位点和13个磷酸化位点,该蛋白没有明显的信号肽结构。[结论]利用不同方法进行的生物信息学分析结果可相互验证,生物信息学可以对未知蛋白进行初步的功能预测．有助于确定后续试验的方向．     

蛋鸡卵巢CHST11基因CDS序列分析

根据NCBI上已公布其他物种CHST11基因的mRNA序列设计蛋鸡特异性引物,应用RT-PCR方法从其卵巢卵泡中扩增出CHST11的CDS全序列。结果表明:CHST11基因编码产物为不稳定的疏水蛋白,经过BLAST比对发现,和其他物种的CHST11序列相比,同源性高。生物信息学软件分析表明,CHST11蛋白不具有信号肽,在10~40位氨基酸处存在1个跨膜螺旋结构区,其序列预测显示存在13个O糖基化位点。CHST11基因可能参与卵巢肿瘤和卵巢癌的调控,同时也可能与卵泡发育有关。     

绵羊血小板糖蛋白4基因(CD36)的克隆及在不同生长时期卵泡中的表达

【目的】血小板糖蛋白4基因(CD36)在模式动物中发挥着各种生物学功能,通过转录组数据分析,可能在绵羊卵泡发育中发挥重要作用。本研究获得了CD36基因及探究其在不同组织中表达情况,从而预测其在绵羊生长过程中可能发挥的生物学功能。【方法】实验采用PCR扩增方法获得阿勒泰羊TSP-1基因的CDS区全长,运用软件分析CD36基因的蛋白质序列及其功能区域,同时利用荧光定量PCR的方法检测5头1周岁阿勒泰羊7个组织及不同直径卵泡中的表达情况。【结果】CD36基因序列全长为1419 bp,共编码472个氨基酸,与预测序列相比完全一致。系统进化树分析表明绵羊与牛的遗传距离较近。CD36蛋白为脂溶性亲水蛋白,具有1个跨膜螺旋结构,在氨基酸1~20位存在以信号肽,存在8个N-糖基化和41个潜在的磷酸化位点,包括19个Ser,15个Thr和7个Tyr。检测不同组织和不同直径卵泡中CD36基因发现:CD36基因在绵羊7个组织中都有表达,心与肺和小卵泡中CD36表达量差异显著(P0.05),在不同直径卵泡中总体表达量较低。【结论】CD36基因可能在绵羊卵泡发育中发挥重要作用。     

家兔MYL12B基因的克隆及生物信息学分析

克隆家兔MYL12B基因的CDS序列并对其进行生物信息学分析。结果表明,家兔与其他动物MYL12B基因在CDS和氨基酸序列上的相似性较高。对家兔MYL12B蛋白的软件预测分析表明,该蛋白是一个无二硫键和信号肽的稳定的亲水性结构蛋白,含11个磷酸化位点和3个糖基化位点。研究结果可为该基因的进一步研究以及探明其作用机制和网络调控机理提供依据。     

牛卵泡颗粒细胞CART与候选受体的分子对接及其功能

通过同源建模预测牛卵泡颗粒细胞(GCs)可卡因–苯丙胺转录肽(CART)与候选受体ZMPSTE24的三维结构,运用分子对接技术分析二者的结合模式,探究其分子互作关系;选取3头健康成年母牛,分离GCs,转染TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默序列,提取总RNA,并采用q RT–PCR检测TEDDM1、AGTR2、CMKLR1、ZMPSTE24等4个候选受体沉默后m RNA的相对表达量;采用CCK–8法测定各试验组和对照组GCs增殖情况;采用ELISA法检测各组培养液中雌激素(E2)的质量浓度,研究此4个候选受体在牛卵泡GCs中的功能。结果表明：ZMPSTE24与CART存在1个结合位点、9个盐桥、17个氢键;4个候选受体试验组的m RNA相对表达量均极显著(P<0.01)低于si NC组和空白组的,表明TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24在GCs中沉默效果良好;TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默后,各试验组的细胞增殖率和培养液中E2质量浓度均极显著(P<0.01)低于阳性对照组(不加CART)的。可见,4个...     

绵羊IGFBP-6基因的克隆及序列分析

以凉山半细毛羊为研究对象,克隆了其胰岛素样生长因子结合蛋白6基因(IGFBP-6),采用生物信息学方法进行遗传进化分析,对IGFBP-6蛋白的理化性质进行分析,并对其二级和三级结构进行预测。结果表明,绵羊IGFBP-6基因的CDS全长序列为711 bp,编码236个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为96%、84%、74%,氨基酸序列同源性分别为95%、80%、69%;IGFBP-6蛋白大小为24.9 ku,理论等电点(p I)为8.83。遗传进化分析结果显示,绵羊IGFBP-6基因与山羊、牛等哺乳动物关系较近,与鱼类的亲缘关系较远。IGFBP-6蛋白存在明显的疏水性区域和亲水性区域,有1个信号肽、14个磷酸化位点、3个N-糖基化位点和7个O-糖基化位点;二级结构分析结果显示,IGFBP-6蛋白无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠区域比例分别为77.54%、19.92%、2.54%;三级结构分析结果显示,IGFBP-6蛋白存在IGFBP_N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。     

牛卵泡AGTR2序列结构及表达特性分析

【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构,并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】同期发情处理后,经B超声波连续监测(每12h一次)采集牛双侧卵巢,分离优势卵泡(dominant follicles, DF)和从属卵泡(subordinate follicles, SF);其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞(granulosa cells, GCs),抽提总RNA后,经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序,获得AGTR2基因全CDS区;生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析;设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物,分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况;另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后,设定阳性、阴性对照组和试验组,应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】AGTR2 CDS区全长1 089 bp,编码362个氨基酸;牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明,该序列与印度水牛序列相似性最高(99.4%),与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%;立体结构和功能域分析表明,AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构,符合G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPCRs)的典型特征;qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF(P0.01),且差异表达倍数达7.47倍;免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】AGTR2属于G蛋白偶联受体,符合神经肽CART受体的基本特征;本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础,同时,对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。     

绵羊BMPR1B基因的生物信息学分析

【目的】利用生物信息学软件对绵羊BMPR1B基因进行分析,并了解其功能和结构,为进一步探讨BMPR1B基因在绵羊生长繁殖以及绵羊卵泡生长和分泌和产羔率等研究奠定遗传信息基础.【方法】利用生物信息学对绵羊骨形态发生蛋白1β(bone morphogenetic protein 1beta,BMPR1B)基因的蛋白理化性质、亚细胞定位、潜在信号肽剪切位点、蛋白跨膜螺旋结构、糖基化和磷酸化位点、蛋白保守结构域、亲疏水性和编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构和三级结构等进行分析预测.【结果】绵羊BMPR1B基因CDs编码蛋白质的502个氨基酸残基中,带电荷氨基酸、疏水氨基酸和极性氨基酸含量较高.相对分子量为56 907.4U,理论等电点pI为7.78;亚细胞主要定位于细胞核,不属于分泌蛋白;无信号肽序列;预测含有32个磷酸化位点和2个糖基化位点;存在一段跨膜结构且分别有一个GS和S-TKc的结构域,二级结构以无规卷曲为主.预测该蛋白在翻译和脂肪代谢过程中有着重要意义.【结论】绵羊BMPR1B蛋白包含502个氨基酸,为细胞核合成蛋白,该蛋白翻译后修饰的主要方式是磷酸化,在细胞内主要行翻译和脂肪代谢作用.蛋白二级结以无规卷曲为主,三级结构主要由α螺旋和无规卷曲缠绕折叠形成.     

绵羊IGFBP-7基因的克隆及序列分析

试验以凉山半细毛羊为研究对象,采用RT-PCR方法克隆了其IGFBP-7基因的CDS全序列,生物信息学方法深入分析其序列。结果表明,凉山半细毛羊IGFBP-7基因的CDS序列为846 bp,编码282个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为99%、95%、90%,氨基酸序列同源性分别为98%、93%、89%,Gen Bank登录号为FJ589640.1;IGFBP-7基因的氨基酸分子质量为29.0 ku,理论等电点(p I)为8.25;进化分析显示其与牛、山羊等哺乳动物关系较近,与斑马鱼、鲍等亲缘关系较远;IGFBP-7基因的蛋白质疏水性区域与亲水性区域间隔较为均匀分布,有1个信号肽、2个跨膜区、16个磷酸化位点、4个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为64.89%、19.86%、15.25%;三级结构分析显示存在IGFBP_N和Ig-like功能域。该试验为进一步研究绵羊IGFBP-7基因的功能奠定了基础。     

静宁鸡PPARα基因克隆与生物信息学分析

为阐明静宁鸡PPARα基因的结构及功能,根据NCBI上登录的原鸡PPARα基因的CDS序列设计引物,以静宁鸡肾脏为材料采用PCR的方法,对目的基因进行克隆,并测序。根据测序的结果,采用各类分析软件,对所获得的DNA片段进行生物信息学分析。结果成功克隆了静宁鸡PPARα基因的全长CDS序列。生物信息学分析结果表明,该基因CDS全长1 407 bp,所编码的蛋白质包含468个氨基酸。其分子量为52 300,等电点为5.85。在二级和三级结构上,α-螺旋和无规则卷曲为蛋白的主要结构形式。PPARα蛋白是一个亲水性蛋白质,不存在跨膜区域,不含信号肽,没有N-糖基化位点,但存在16个O-糖基化位点,存在25个丝氨酸(Ser)磷酸化位点、12个苏氨酸(Thr)磷酸化位点和6个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点。静宁鸡PPARα蛋白在第100～168个氨基酸之间有1个ZnF_C4结构域,在第264～449个氨基酸之间有1个HOLI结构域。同源性分析结果表明,静宁鸡PPARα基因与原鸡的亲缘关系最近。静宁鸡PPARα基因的成功克隆和功能预测为进一步研究PPARα基因在静宁鸡脂肪代谢中的作用提供了基础。     

水稻ARAB-1类似基因的电子克隆及生物信息学分析

[目的]对水稻OsARAB-1基因进行电子克隆,并对其进行生物信息学分析.[方法]以NP 174188.1为查询探针,通过电子克隆获得OsARAB-1基因全长cDNA,用生物信息学软件对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析.[结果]获得了OsARAB-1基因全长cDNA,基因编码区序列(CDS)全长1 086 bp.电子定位于第五染色体基因组序列NC 008398.2核苷酸序列6 769 813 ～6 773 213 bp区域.OsARAB-1蛋白属于亲水性的胞外蛋白,比较稳定,偏碱性.二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主.具有2个功能结构域:SGNH水解酶型酯酶、GDSL脂肪酶.有21个磷酸化位点、7个糖基化位点.推定的活性位点的氨基酸残基为Ser34、Gly107、Asn167、Asp333、His336.与玉米酯酶亚型B4FM12亲缘关系最近.OsARAB-1基因的表达对水稻的发育和形态发生起重要作用,与水稻抗稻瘟病有关.[结论]该研究为用试验方法克隆该基因和功能鉴定奠定了基础.     

猪EGFL6基因生物信息学分析

为了解猪EGFL6基因基本特性,克隆该基因CDS区,运用生物信息学方法预测分析其氨基酸理化性质、同源性、蛋白功能及二三级结构等。结果表明,猪EGFL6基因CDS区全长1 665 bp,编码554个氨基酸,与人、马、小鼠、绵羊等氨基酸相似性均在75%以上,亲缘关系较近,该蛋白具有亲水性和不稳定性,是分泌蛋白,有12个潜在磷酸化位点,5个保守结构域,无跨膜结构区,无规则卷曲是二三级结构中最主要结构元件。该研究为进一步揭示猪EGFL6基因功能奠定基础。     

紫花苜蓿乙酰CoA硫解酶的生物信息学分析与同源建模

[目的]对紫花苜蓿中的乙酰CoA硫解酶进行生物信息学分析与同源建模。[方法]应用生物信息学软件预测紫花苜蓿乙酰CoA硫解酶的理化性质、亲/疏水性、卷曲螺旋结构、糖基化位点、活性位点、亚细胞定位、二级结构、结构域及三维高级结构。[结果]该蛋白质是一个极疏水性蛋白,含403个氨基酸,理论等电点为6.95;包含1个明显卷曲螺旋结构、5个糖基化位点、1个硫解酶结构域;二级结构中α-helix(Hh)占39.95%、Extended strand(Ee)占16.38%、Random coil(Cc)占43.67%;Ramachandram结构检测表明预测蛋白质残基的二面角有90%以上位于黄色区域,符合立体化学能量规则。[结论]为该蛋白功能的探索提供了一定的理论参考。     

牛卵泡AGTR2序列结构及表达特性分析

【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构,并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】 同期发情处理后,经B超声波连续监测（每12 h 一次）采集牛双侧卵巢,分离优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）;其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞（granulosa cells, GCs）,抽提总RNA后,经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序,获得AGTR2基因全CDS区;生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析;设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物,分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况;另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后,设定阳性、阴性对照组和试验组,应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】 AGTR2 CDS区全长1 089 bp,编码362个氨基酸;牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明,该序列与印度水牛序列相似性最高（99.4%）,与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%;立体结构和功能域分析表明,AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构,符合G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs）的典型特征;qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF（P<0.01）,且差异表达倍数达7.47倍;免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】 AGTR2属于G蛋白偶联受体,符合神经肽CART受体的基本特征;本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础,同时,对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。     

蛋白激酶C的克隆和生物信息学分析（英文）

[目的]PKC在信号转导、气孔调节、细胞分化中具有重要作用。该研究目的是为了克隆蛋白激酶C并预测它的性质。[方法]从玉米B73中克隆得到zm PKC(玉米蛋白激酶C)的c DNA,并且通过生物信息学的方法预测了它的特性,包括保守结构域、理化性质、特殊磷酸化位点和N端糖基化位点等。[结果]证明zm PKC长1 269 bp,编码422个氨基酸,有一个外显子和俩个内含子及一个蛋白激酶域,2个N端糖基化位点和28个特殊磷酸化位点,等电点为4.98,分子量为132 074.70。[结论]zm PKC的克隆和生物信息学分析能利于进一步研究PKC的功能。     

绵羊IGFBP-1基因的克隆及序列分析

试验以凉山半细毛羊为研究对象,采用RT-PCR方法克隆了IGFBP-1基因的CDS全序列,生物信息学方法深入分析其序列。结果表明,IGFBP-1基因的CDS序列为792 bp,编码263个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为97%、76%和74%,氨基酸序列同源性分别为97%、69%和71%,Gen Bank登录号为FJ589639.1;IGFBP-1基因的氨基酸分子量为27.8 k D,理论等电点(p I)为5.99;进化分析显示与牛、山羊等哺乳动物关系较近,与鸡、鱼类等亲缘关系较远;IGFBP-1基因存在明显的疏水性区域和亲水性区域,有一个信号肽、一个跨膜区、16个磷酸化位点、6个N-糖基化位点和8个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为61.98%、24.33%、13.69%;三级结构分析显示存在IGFBP_N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。为进一步研究绵羊IGFBP-1基因的功能奠定基础。     

绵羊及相关物种去乙酰化酶1的理化性质和蛋白结构预测

为深入研究SIRT1基因及其编码蛋白的结构和功能,特别是在各信号通路中的作用,本文基于NCBI发布的包括绵羊在内的9个物种的SIRT1基因的核苷酸和蛋白质序列,采用生物信息学方法分析SIRT1蛋白的理化性质和蛋白结构,预测了绵羊SIRT1蛋白的结构和翻译后修饰位点。结果表明,不同物种SIRT1蛋白的理化性质基本一致。绵羊SIRT1是一种接近于中性的亲水性脂溶蛋白,预测其有40个潜在的O-糖基化位点、2个N-糖基化位点、33个磷酸化位点、18个乙酰化修饰位点、11个泛素化修饰位点和3个类泛素化修饰位点。这些结果为进一步研究SIRT1的功能和表达调控奠定了科学依据。     

重组UK114蛋白编码基因的序列特征及表达分析

UK114蛋白对调节calpain活性具有重要作用,为了初步研究UK114蛋白的生物学特性,在测序的基础上,克隆和鉴定了UK114蛋白基因,分析该蛋白结构及功能预测。提取山羊肝脏中的总RNA,通过特异性引物扩增,获得UK114蛋白基因的序列,利用生物信息学方法分析了UK114蛋白的理化性质、信号肽、疏水性、糖基化、磷酸化位点,并对其二、三级结构进行预测。结果表明,克隆所得到的重组UK114蛋白基因由414个核苷酸组成,编码137个氨基酸的蛋白,其分子量约为14 ku,等电点为6.19;该蛋白氨基酸组成中丙氨酸含量最高,占15.3%,缺乏组氨酸和色氨酸;该蛋白结构中不存在信号肽,也没有糖基化位点,存在多个磷酸化位点;蛋白质二级结构中α螺旋占到了35.04%,不规则卷曲占到37.23%,β折叠占21.17%;三级结构中α螺旋位于N端,β折叠主要位于C端。该蛋白没有信号肽和糖基化位点,说明该蛋白不是分泌蛋白,不能发生糖基化,说明结构相对来说不是很稳定;有多个磷酸化位点,决定了其功能的多样性和复杂性。研究结果可为后期的蛋白质功能研究提供一定的理论依据。