保护地土壤生防木霉菌种群多样性研究

采用传统的形态学特征和分子方法(ITS、TEF序列和UP-PCR)研究了蔬菜保护地土壤中木霉菌种群多样性及其影响因素.结果表明:提交genbank 11个木霉种的序列,分别为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)、黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、非钩木霉(Trichoderma inhamatum)、微孢木霉(Trichoderma minutisporum)、长孢木霉(Trichoderma longipile)和粘绿木霉(Trichoderma virens);木霉菌24个菌株经UP-PCR扩增,引物AS4、AS19、L45扩增出一条500 bp大小的木霉菌种的特征性谱带,其他谱带则为多态性谱带,多态性达93.5％;营养条件、杀菌剂及土壤因素对不同种木霉菌的影响不同,得到2株适应性较强的木霉菌株,有望成为生防菌株.     

从3种基质分离的木霉种类鉴定

从福建省的食用菌、植物线虫虫体和植物根际土壤中共分离到125个木霉(Trichoderma)菌株,根据形态学特征和培养性状,鉴定出5种木霉,分别是哈茨木霉(T.harzianum)、绿色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)、拟康氏木霉(T.pseudokoningii)和长枝木霉(T.longibrachiatum).植物根际土壤中的优势种为哈茨木霉和绿色木霉;食用菌上的优势种为康氏木霉和拟康氏木霉;植物线虫虫体上的优势种为绿色木霉.     

南宁郊区土壤微生物对拮抗真菌G1和T1—2的抑制作用

从广西大学农场和南宁市郊12种作物类型田块采集土壤样品，经分离、纯化后，获得66个真菌菌株和67个细菌菌株。用对峙法测定分离到的土壤微生物对供试拮抗真菌G1（粘帚霉Gliocladium spp.)、T1-2（康氏木霉Trichoderma koningii)的抑制作用，结果表明，4个真菌菌株和28个细菌菌株对G1有强烈的抑制作用，6个真菌菌株和18个细菌菌株对T1-2有强烈抑制作用。     

不同纤维素分解菌纤维素酶活性比较试验

以滤纸为唯一碳源的无机盐溶液作为培养基,对拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)、黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)和绿色木霉(Trichoderma viride)这3种纤维素分解菌进行了培养及羧甲基纤维素CMC酶活性测定。结果显示:拟康宁木霉和绿色木霉的滤纸失重率分别达到37%、33%,是黄绿木霉的6～7倍,且他们的CMC酶活性也显著黄绿木霉。表明不同的菌株对纤维素类物质的分解能力差异很大,且CMC酶活性高的菌种滤纸分解能力也比较明显,以拟康宁木霉与绿色木霉分解纤维素的能力较强。     

木霉菌对植物病原真菌拮抗作用的研究

木霉菌是重要的植物病害生防菌。通过对峙培养法,测定了哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株NF9和绿木霉(Trichoderma virens)菌株TY对3种土传植物病原真菌的体外拮抗作用。结果表明,这2株木霉菌对黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌及茄子白绢病菌均具有一定的拮抗作用,不同木霉菌株间拮抗效果存在差异,哈茨木霉菌株NF9优于绿木霉菌株TY。     

辽宁省药用植物根际土壤木霉属真菌的多样性

对采集于辽宁省药用植物62份土壤样品的木霉属真菌进行分离,获得木霉属真菌78株,采用形态学方法从中鉴定出9种木霉属真菌,分别是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿色木霉(T.viride)、粗壮木霉(T.strigosum)、长枝木霉(T.longibrachiatum)、卷曲木霉(T.spirale)、钩状木霉(T.hamatum)、康氏木霉(T.koningii)、顶孢木霉(T.fertile)和多孢木霉(T.polysporum).其中哈茨木霉分离到34株,占分离到木霉菌总数的43.6%.采用对峙培养法,共筛选出对5种靶标菌抑制率大于70%,对靶标菌菌丝抑制作用明显的菌株4株,其中哈茨木霉2株,绿色木霉1株,钩状木霉1株.     

植物内生木霉的鉴定及其抑菌活性

对分离自健康植物的6种内生木霉菌进行活化,再观察菌落形态、颜色,测量生长速度,观察孢子形态,测量孢子直径范围,进而对供试菌株进行分类鉴定。结果初步鉴定,DBs0-13为多孢木霉(Trichoderma polysporum),DBs57为里氏木霉(T.reesei),DBs66为长孢木霉(T.longipile),40为绿色木霉(T.viride),171为康氏木霉(T.koningii),292为哈茨木霉(T.harizianum)。采用生长速率法测定供试真菌发酵液(相当于稀释10倍)对4种病原真菌的抑制效果。结果表明,6木霉菌对小麦赤霉菌、苹果轮纹菌、油菜菌核菌和可可球二孢菌都有不同程度的抑制作用,其中DBs0-13和171的抑菌率相对较高,并对4种病原真菌都具有抑制作用;6种木霉菌中抑菌率最高的是DBs0-13,其对油菜菌核病菌、可可球二孢的抑制率分别为62.89%、41.12%。     

防治油菜菌核病的木霉和粘帚霉菌株筛选及生防的初报

2002年6月至12月中旬,用4批共200颗菌核作诱饵,分离到粘帚霉(Gliocladiumspp.)、木霉(Trichoderma spp.)、镰刀菌(Fusariumspp.)、青霉(Penicilliumspp.)、毛霉(Mucorspp.)、根霉(Rhizopusspp.)、曲霉(Aspergillus spp.)、腐霉(Pythiumspp.)和少量难鉴定菌株,共计171个菌株,其中粘帚霉80株、木霉55株,分别占46.8%和32.2%,在不同采样期内均为优势种群。所诱捕的木霉经鉴定分为7个种,哈茨木霉和康氏木霉出现较早,而黄绿木霉和拟康氏木霉出现较迟。通过测定所获得木霉菌株对核盘菌的拮抗作用,筛选出Tk1、Th2生防潜能较好的菌株。经离体叶片测定,Tk1和Th2对油菜菌核病的防治效果分别达90.6%和89.1%。     

食用菌木霉病的病原鉴定

鉴定了危害食用菌的5种木霉菌。绿色木霉(Trichoderma viride)和康氏木霉(T.koningii)为优势种,长枝木霉(T.lon-gibrachiatum)、拟康氏木霉(T.pseudokoningii)和哈茨木霉(T.harzianum)首次在福建省食用菌上发现。     

~(60)Co-γ辐射诱变对康氏木霉产纤维素酶的影响

为了研究不同剂量60Co-γ辐射对康氏木霉产纤维素酶的影响。以康氏木霉AS3.2774为出发菌株,通过0.6~1.8 Gy辐照剂量的60 Co-γ辐射诱变康氏木霉,经平板培养和固体发酵培养筛选出高产菌株,研究不同剂量60Co-γ辐射处理对康氏木霉孢子存活率、康氏木霉产纤维素酶发酵能力和遗传稳定性的影响。结果表明,辐照剂量在0.9~1.1 Gy,康氏木霉孢子致死率达到70.0%~80.0%,辐照剂量大于1.5 Gy时,存活率接近0。辐照处理的孢子经刚果红平板初筛、固体发酵复筛、遗传稳定性试验,获得4株正突变菌株。突变株产纤维素酶活力平均数与出发菌株间存在显著差异,其中菌株Ly-23产纤维素酶的能力平均达0.356 IU/ml,比出发菌株提高了31.8%。该研究为从康氏木霉中筛选纤维素酶高产菌株奠定了基础。     

多功能木霉的筛选及鉴定

测定了60株分离自土壤的木霉菌株的解磷解钾、拮抗和对有机磷农药毒死蜱的耐受、降解等功能。结果表明,5株木霉具有很好的解磷能力,其中木霉T-404的解磷效果最好,为109.22 mg·L-1。6株木霉具有明显的解钾透明圈,但是液体培养后测定发现木霉的解钾能力不强。木霉具有不同程度的拮抗作用,其中6株木霉的拮抗能力很好。大部分木霉可以耐受高浓度的毒死蜱,但是不能降解该农药。对5株具多功能潜力的优势木霉菌株进行形态学和分子生物学鉴定表明:T-403、T-404、T-440为Trichoderma koningiopsis,T-400、T-450为Trichoderma koningii。     

木霉菌对杂交水稻生长影响差异的研究

[目的]通过比较哈茨木霉（Trichoderma harzianum）抗药性标记菌株TUV-13和野生型菌株T2-16对水稻生长影响的差异,筛选出对水稻生长有更好促进作用的菌株,进一步推动木霉生防菌株在水稻上的应用。[方法]采用不同浓度的TUV-13和T2-16孢子悬浮液对水稻进行人工接种（浸种处理）,确定最适浸种浓度;室外盆栽试验采用常规方法测定水稻各个生长势指标。[结果]确定TUV-13和T2-16最适浸种浓度均为1×105个/ml;用此浓度的孢子悬浮液浸种均能提高种子活力,且TUV-13对水稻萌发的促进作用更显著,幼苗鲜重比经T2-16浸种处理增加4.85%,活力指数提高5.96%。盆栽试验显示,2个处理均能促进水稻植株根系和地上部分的生长,经TUV-13孢子悬浮液浸种的效果最显著。[结论]TUV-13对T优6135的生长具有更显著的促进作用,显示出TUV-13在水稻应用上的巨大潜力。     

钩状木霉Th12菌株液体发酵条件的研究

[目的]研究钩状木霉Th12菌株最适的液体发酵条件,为研发和开发生物防治木霉制剂提供理论基础。[方法]采用稀释土壤平板法以及平板对峙法筛选、鉴定出钩状木霉Th12菌株,并考察了碳源、氮源、发酵时间、发酵温度、初始pH、接菌量、装瓶量、摇床转速对木霉菌丝产量的影响。[结果]木霉Th12菌株的最适液体发酵条件为以葡萄糖为碳源、以蛋白胨为氮源、发酵温度为25℃、初始pH为6、接菌量为0.8ml、装瓶量为50ml、摇床转速为180r/min的培养液中培养3d,菌丝产量最高。[结论]木霉Th12菌株在最佳液体培养条件中能最大限度地提供用于草坪镰孢枯萎病和褐斑病病害防治的菌丝体量。     

木霉L24菌株对小麦幼苗生长的影响

[目的]探索木霉L24菌株对小麦生长的影响。[方法]以小麦品种川育20为试材,采用木霉L24菌株分生孢子可湿性粉剂浸种和叶面喷施2种方式处理小麦,测定并比较小麦幼苗形态与生理生化的各项指标。[结果]木霉L24菌株浸种与喷施2种方式处理对小麦的根长、叶面积和苗高均有促进作用,可有效提高小麦过氧化物酶含量、叶绿素含量和根系活力,降低丙二醛（MDA）含量。其中,木霉L24菌株低浓度浸种处理有利于促进根系生长,低浓度喷施处理有利于增加苗高,而低浓度喷施和浸种处理则利于增加叶面积;喷施300倍处理的叶绿素含量最高（1.9455mg/g）;喷施500倍处理的根系活力最高;浸种300倍处理的POD活性最高（1.50×10-3U/g）;喷施高浓度处理更利于小麦MDA含量的降低。[结论]该试验证明了木霉菌对植物生长有促进作用。     

木霉培育条件及与农药的敏感性研究

[目的]筛选木霉的培育条件,同时对木霉对农药的敏感性进行研究。[方法]以木霉TC、TY、NF9、PZ株系为材料,先在PDA培养基和玉米培养基中筛选出合适的培养基,再对瓶装培养中的透气条件和袋装培养中培养条件进行筛选,最后进行木霉与农药甲霜灵、百菌清、菌核净间的敏感性试验。[结果]PDA培养基更有利于3种木霉株系的产孢;瓶装培养中透气塑料纸密封能促进木霉产孢;袋装培养中木霉在温度24(±2)℃、光暗比9 h∶15 h或10 h∶14 h的条件下生长较为理想;木霉对甲霜灵的敏感浓度可达1 500 mg/L左右。[结论]为后续的抗性试验提供了数据支持。     

产油微生物的筛选

采用苏丹黑B染色法、甲醇-氯仿法,从30份土壤样品中筛选到9株产油霉菌和4株产油酵母.经5.8S rDNA序列分析,9株产油霉菌分别为蓝状菌Talaromyces trachyspermus、嗜松青霉Penicillium pinophillum、青霉Pe.sp.、微紫青霉Pe.janthinellum、淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus、简青霉Pe.simplicissimum.、棘孢曲霉Aspergillus aculea-tus、木霉Trichoderma sp.、拟康宁木霉Tr.koningiopsis,4株产油酵母分别是毕赤酵母Pichia caribbica、假丝孢酵母Candida sp.、季也蒙酵母Meyerozyma guilliermondii和季也蒙毕赤酵母Pi.guilliermondii.通过摇瓶培养,测定了各菌株的产油量,结果表明:霉菌产油量最高的是嗜松青霉,产油量为26.4%;酵母产油量最高的是假丝孢酵母,产油量为44.3%.提取毕赤酵母的油脂,采用气相色谱-质谱联用分析,测得其油脂成分主要是14～20碳的短链脂肪酸.     

生防菌ANTI-8098A对青枯雷尔氏菌不同致病力菌株抑制作用的差异性

采用共培养法测定了生防菌ANTI-8098A对青枯雷尔氏菌强致病力菌株F-01-V和无致病力菌株F.1.3-010602-01-A的抑制作用,并以链霉素作参照。结果表明,生防菌ANTI-8098A对F-01-V的抑制作用较强,抑制率与生防菌培养液菌体数成正相关;对F.1.3-010602-01-A的抑制作用则较弱,菌体数为20.0×108cfu/ml的生防菌液对F.1.3-010602-01-A的抑制率为14.7%,而对F-01-V的抑制率高达99.5%。链霉素对F-01-V和F.1.3-010602-01-A都具有较强的抑制作用,抑制率与浓度成正相关,但是对F.1.3-010602-01-A的抑制作用更强:浓度为0.25U/ml的链霉素溶液,对F.1.3-010602-01-A的抑制率为50.0%,而对F-01-V的抑制率仅为3.3%。应用生防菌ANTI-8098制剂进行田间防治茄子青枯病的试验结果表明,生防菌制剂的防治效果达92.11%,显著地比农用链霉素的防效(72.81%)高。研究结果为阐述生防菌ANTI-8098对青枯雷尔氏菌的致弱现象提供了依据。     

哈茨木霉T_2菌株耐药性的测定及其对几种病原菌的抑制作用研究

[目的]为提高木霉菌的生物防治效果。[方法]研究了哈茨木霉T2菌株对3种病原真菌(齐整小核菌、立枯丝核菌和香蕉枯萎病菌)的抑制作用,分析其对7种杀菌剂的耐药性,并探讨了哈茨木霉T2菌株与杀菌剂联用对立枯丝核菌和齐整小核菌的抑制作用。[结果]哈茨木霉T2菌株对病原真菌的抑制随处理时间的延长而增强。处理后120 h其对齐整小核菌、立枯丝核菌、香蕉枯萎病菌的抑制率最高,分别为63.10%、65.64%和33.84%。哈茨木霉T2菌株对多菌灵的耐药性最强,EC50为4 345.32 mg/L。在浓度为800 mg/L时多菌灵对哈茨木霉T2菌株的抑制率为13.73%,当浓度在50 mg/L以下时抑菌率几乎为0。哈茨木霉T2菌株对代森锰锌、露星较敏感。[结论]哈茨木霉T2菌株与甲霜灵联用,能明显抑制齐整小核菌、立枯丝核菌的生长。     

3种菌株产木聚糖酶同工酶及其酶解产物的比较

探讨3种菌株所产木聚糖酶组分及其酶解产物的差异,为酶制剂和功能低聚木糖的研发和应用提供理论依据。采用SDS-PAGE电泳,研究黑曲霉C71、康宁木霉M46及XYNB重组工程菌G81所产的木聚糖酶同工酶。结果表明,C71、M46及G81分别产3种、4种和2种木聚糖酶同工酶;以桦木木聚糖为底物,在酶添加量为70U/g、底物20g/L、反应时间10h条件下进行酶解,采用TLC及HPLC分析酶解产物。TLC结果表明,C71和M46酶解液中含有木糖、木二糖和木三糖;G81酶解液中含有木二糖、木三糖和木四糖。HPLC结果表明,C71酶解液中木糖、木二糖和木三糖的质量浓度分别为2.4、1.3和1.7g/L;M46酶解液中木糖、木二糖和木三糖的质量浓度分别为1.5、1.8和2.1g/L;G81酶解液中木二糖、木三糖和木四糖的质量浓度分别为2.6、2.7和1.4g/L。不同菌株所产木聚糖酶组分及其酶解产物存在差异,低聚木糖的研发应根据酶学特性,选择不同的单一或复合酶制剂。