柑橘溃疡病拮抗放线菌筛选及其抑菌机理研究

[目的]明确保存的放线菌资源对柑橘溃疡病菌的抑制作用和抑菌机理.[方法]通过平板对峙培养法筛选对柑橘溃疡病菌Xanthomonasaxonopodis pv.citri）有抑制作用的放线菌菌株,并采用电导率法、考马斯亮蓝法和斐林试剂法测定拮抗菌株发酵滤液对溃疡病菌的影响.[结果]筛选出3个对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的放线菌菌株,抑菌圈直径达42.0～60.0 mm,且该3株放线菌发酵液能提高溃疡病菌菌液电导率,增加还原糖和蛋白质含量.[结论]3株拮抗菌能破坏柑橘溃疡病菌细胞膜完整性,增加细胞膜通透性,引起细胞质外渗.     

紫花苜蓿根腐性病害生防放线菌的分离与筛选

[目的]分离筛选出对苜蓿根腐病病原具有高拮抗作用的生防放线菌。[方法]利用梯度稀释分离法从来自内蒙古赤峰地区的10个土样中分离得到91株放线菌。以3株苜蓿根腐病菌为靶标菌,采用平皿对峙培养法,对分得菌株进行皿内拮抗作用测定。[结果]获得5株对供试苜蓿根腐病菌有较强抑制作用的拮抗菌株,编号为1-3-6、4-4-2、6-2-25、6-2-27、7-2-13,分别来自1号、4号、6号及7号土样,占分离菌株的5.50%。[结论]该研究可为苜蓿根腐病生物防治奠定一定基础。     

柑橘内生放线菌CR20的鉴定与拮抗活性

从不同橘园取不同柑橘品种的根部,共分离获得42株内生放线菌,经抑菌试验,筛选到1株对柑橘绿霉病菌和青霉病菌具有较高拮抗活性的放线菌菌株,将其编号为CR20。通过对菌株形态学特征和生理生化特性的观察,并结合对其16S rDNA的序列分析,将菌株CR20初步鉴定为弗吉尼亚链霉菌。     

放线菌DX23对马铃薯炭疽病菌的拮抗作用及其鉴定

为获得马铃薯炭疽病菌的生防放线菌,从马铃薯种植地健康植株的根围土壤中分离筛选放线菌.结果表明,采用平板对峙法筛选得到1株编号为DX23的拮抗菌,其拮抗作用表现为:培养72h后,平均抑菌圈直径为25.7mm.根据形态学特征、生理生化特性和16SrDNA序列对比分析,将该菌株初步鉴定为链霉菌属的栗褐色类群Streptomyces badius.     

油茶炭疽病拮抗放线菌CF17发酵液的抑菌活性及活性成分的分离纯化

采用十字交叉法测定CF17发酵液的抑菌谱,并通过离心、旋转蒸发浓缩、丙酮沉淀、固相萃取以及半制备高效液相色谱法对抑菌物质进行分离纯化和鉴定.结果表明,CF17发酵液对油茶炭疽病、油茶叶枯病、油茶软腐病、杉木炭疽病、核桃壳梭孢、降香黄檀炭疽病、檀香炭疽病等的病原菌均有抑菌效果.50%丙酮分离纯化效果优于乙醇沉淀法与乙酸乙酯沉淀法;在固相萃取中,活性物质主要集中在60%乙腈梯度洗柱样品中,最后经HPLC分离收集到一个有明显抑菌圈的样品.经质谱鉴定抑菌成分为Tetramycin A.     

伽师甜瓜猝倒病生防放线菌的筛选

【目的】分离、鉴定引起伽师甜瓜(Cucumismelo L.)猝倒病的病原菌,筛选可用于甜瓜猝倒病生物防治的拮抗性放线菌。【方法】采用组织分离法分离伽师甜瓜猝倒病的病原菌,用琼脂块法和无菌发酵滤液抑菌性试验筛选拮抗瓜果腐霉的生防放线菌,搭片法观察生防放线菌菌丝与瓜果腐霉菌丝间的相互作用。【结果】伽师甜瓜猝倒病的病原菌为瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum);筛选出7株对瓜果腐霉具有显著拮抗性的生防放线菌,其中8号放线菌对瓜果腐霉的拮抗环宽度为13.3mm,其无菌发酵滤液对瓜果腐霉的抑菌率在培养120h时高达88.3%。【结论】7株生防放线菌对由瓜果腐霉引起的伽师甜瓜猝倒病均有显著抑制作用;7株生防菌可通过产生抗菌物质或缠绕、消解菌丝的方式抑制瓜果腐霉生长。     

草坪病害真菌拮抗放线菌的筛选及活性研究

[目的]筛选拮抗活性菌株和寻找新的活性代谢产物。[方法]以引起草坪真菌病害的3种病原真菌镰刀菌(Fusarium sp.)、丝核菌(Rhizoctonia sp.)、腐霉菌(Pythium sp.)为目标菌,通过琼脂块法初筛、管碟法复筛对采自云南香格里拉的茶园土壤进行了放线菌的分离筛选,并对其中活性较好的菌株进行了抗菌活性验证及活性物质的粗分离与检测。[结果]共分离得到85株放线菌,最终获得S-6、S-23、S-31 3株对病原真菌有较强作用的菌株,其中最高抑菌达61.90%。将3株拮抗放线菌液体发酵,并通过管碟法进一步验证抗菌活性;将发酵液乙酸乙酯萃取浓缩后,在萃取相中检测到活性成分。[结论]该研究结果为草坪病害防治提供了新资源。     

烟草黑胫病菌拮抗放线菌LY18的分离筛选与鉴定

为了寻找对烟草黑胫病具有生防潜力的放线菌,笔者采用平板对峙法,从烟草黑胫病发病烟田健株根际土壤中,分离得到1株对烟草黑胫病菌具有显著拮抗效果的放线菌株LY18,其发酵液的无菌滤液对烟草黑胫病菌菌丝的抑制率达70%以上。电镜观察发现,抑菌圈周围的烟草黑胫病菌丝破裂、瘪陷。通过对LY18的形态观察、培养性状观察、生理生化测定结合16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为Streptomyces rajshahiensis。     

生防放线菌TGNBSA5的鉴定及其活性物质的研究

牛蒡内生放线菌TGNBSA5对猕猴桃溃疡病菌有较好拮抗作用。为开发该生防菌的生物防治价值,采用生理生化活性测定、形态观察及16SrDNA序列分析,并经发酵培养后,发酵液采用乙酸乙酯萃取、柱层析和薄层层析、HPLC检测等方法分离纯化抑菌活性组分。结果表明,该内生放线菌为链霉菌属的孢杆链霉菌(Streptomyces sporovirgulis),经紫外和NMR鉴定活性组分之一为苯甲醇。孢杆链霉菌为第一次从植物中分离获得,且活性组分苯甲醇的明确将为猕猴桃溃疡病的防治提供理论依据。     

瓜类枯萎病菌拮抗放线菌分离方法的研究

通过对土壤样品进行不同温度、不同孢子激活剂、不同抑制剂、不同培养基等条件的梯度试验,得到对黄瓜枯萎病菌有拮抗作用的土壤放线菌的分离方法:将土壤样品经100℃干热处理1 h,用0.05%的SDS稀释,分别涂布于含有1μg/ml青霉素的高氏合成1号琼脂、淀粉琼脂、腐植酸—维生素琼脂(HVG)组合培养基上,置于28℃培养7 d,并分离到69株瓜类枯萎病的拮抗放线菌。     

3种杀菌剂对柑桔溃疡病菌的室内毒力测定

为筛选防治柑桔溃疡病的高效药剂,将23种常见商品杀菌剂分别稀释成200 mg/L,采用喷雾法进行室内抑菌试验,选择3种初筛抑菌效果较好的药剂进行室内毒力测定.结果表明,噻霉酮、农用链霉素、溴菌腈的抑菌效果较好,其EC_(50)分别为46.59、86.18、102.91 mg/kg,噻霉酮的毒性最强.结合供试药剂有效成分和作用机理的比较,确定农用链霉素效果最佳.     

柑桔溃疡病菌在武汉地区越冬期适存性的研究

采用栽种易感病的脐橙苗实测法和以供检材料的浸提液或高速离心浓缩浸提液针刺接种脐橙叶片的致病性检测方法,对柑桔溃疡病菌在武汉地区越冬期的适存性进行了研究。结果表明：柑桔溃疡病菌在武汉地区主要病株的病斑内越冬,也有少量能以潜伏侵染的方式在病株的未显症叶片内越冬,成为翌年的初次侵染来源;病原菌不能在田间的病落叶、土壤和杂草上越冬。     

Comparison of PCR,DIA and Pathogenicity Assay for Detection of Xanthomonas axonopodis pv.citri,the Causal Agent of Citrus Bacterial Canker Disease

Polymerase chain reaction (PCR) approach based on newly designed primers, JYF5/JYR5, was applied for specific detection of Xanthomonas axonopodis pv.citri(Xac). The efficiency and reliability of PCR method were compared with dot immunobinding assay (DIA) and classical pathogenicity test techniques for detecting suspensions of pure cells of Xac and soaking sap of citrus tissues. Detection sensitivity of PCR was about 4.5 cells or 1.56 pg target DNA per reaction which was higher than that of DIA (ca. 450 cells per dot).These three techniques (PCR assay, DIA and Pathogenecity test) could always detect Xac from symptomatic citrus samples. Different performances were obtained from citrus materials without symptoms, and the positive detection frequency was PCR, DIA and pathogenicity test.     

柑桔溃疡病菌离体叶接种检验法的研究

对柑桔溃疡菌的离体叶接种检验法进行了研究和技术规范。结果表明 ,离体叶接种法是一种效果直观可靠、操作简便易行的检验溃疡病菌的方法 ,其检测水平可达到 1.5 5× 10 3 -4 cfu/ml;其技术规范为 :供接种的柑桔品种应为甜橙类感病品种 (如脐橙 ) ,供接种的离体叶片以达到定型大小的新梢成叶最佳 ;采用针刺后滤纸片贴敷菌液接种 ,最适孵育温度为 2 8～ 32℃ ,最佳保湿方法为吸水纸保湿法。     

PCR、DIA与致病性测定法检测柑桔溃疡病菌的比较

 依据柑桔溃疡病菌全基因组序列的独有保守区域设计筛选出的特异性引物对JYF5/JYR5，用于柑桔溃疡病菌的PCR检测，具有很好的检测特异性、灵敏度和稳定性。同时比较了PCR与DIA（斑点免疫结合技术）及传统的致病性测定法在检测灵敏度、稳定性及田间样品检出率等方面的差异。结果表明，PCR的检测灵敏度可达103～104 cfu·ml-1（每个反应体积约10个细菌），明显高于DIA（104～105 cfu·ml-1，每个样点约300个细菌）；PCR、DIA和致病性测定法检测田间显症样品的检出率均可达到100%，而检测柑桔无症样品的检出率依次降低。此外，通过排除PCR抑制物质和在PCR反应体系中加入终浓度为15%的甘油，有效地降低了检测中存在的假阴性。     

几种杀菌剂对柑桔溃疡病的生物活性

为筛选防治柑桔溃疡病的有效药剂,按大田推荐使用浓度,用抑菌圈法测定17种非铜药剂和5种含铜药剂对柑桔溃疡病的毒力,并研究7种非铜药剂田间防治效果。结果表明,代森锰锌、福美双、福美双.溴菌腈、农用链霉素、金核霉素和琥胶肥酸铜.乙磷铝.硫酸锌抑菌作用最强,其次为福美双.福美锌、大蒜素、络氨铜.络氨锌和盐酸吗啉胍.乙酸铜,过氧乙酸、噻唑锌、春雷菌素、中生菌素、琥珀酸铜和噻菌铜有微弱的抑菌作用,百菌清、多菌灵、苯醚甲环唑、叶青双、复硝酚钠和井冈霉素无抑菌作用。大田试验结果表明,30%金核霉素WP 500 mg/L和72%农用链霉素WP 200 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为76.34%和74.94%,显著优于其它药剂处理;80%代森锰锌WP 2000 mg/L、50%福美双WP 400 mg/L和50%福美双.溴菌腈WP 500 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为70.36%、66.55%和69.37%,与对照含铜药剂20%噻菌铜SC 67 mg/L处理无显著差异;大蒜素和叶青双对柑桔溃病防效较差,6%大蒜素EC 120 mg/L和20%叶青双WP 400 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为41.84%和21.8...     

几种杀菌剂对柑橘溃疡病的药效测定

[目的]筛选出对柑橘溃疡病有较好防效的杀菌剂。[方法]选用77%多宁600倍、80%金纳海600倍、3%克菌康800倍、77%多宁600倍＋柔水通3 000倍、80%金纳海600倍＋柔水通3 000倍、3%克菌康800倍＋柔水通3 000倍液等单、混剂,进行田间药效测定。[结果]所有参试药剂对柑橘溃疡病的防效均达48.00%以上,而添加农药增效剂后的防效显著高于单剂（P〈0.05）,其中以80%金纳海600倍＋柔水通3 000倍和3%克菌康800倍＋柔水通3 000倍对柑橘溃疡病的防效最好,其对叶部溃疡和果实溃疡的防效分别达77.00%和79.00%以上。[结论]80%金纳海600倍＋柔水通3 000倍和3%克菌康800倍＋柔水通3 000倍2种混剂在田间表现良好,推荐在生产上用于柑橘溃疡病的防治。     

应用斑点免疫技术快速检测柑桔溃疡病菌

应用改进的斑点免疫技术在国产微孔滤膜上检测柑桔溃疡病菌（Ｘａｎ－ｔｈｏｍｏｎａｓａｘｏｎｏｐｏｄｉｓｐｖ．ｃｉｔｒｉ）。结果表明，靶细菌检测下限为１×１０４细胞／ｍｌ，柑桔无症材料浸出液稀释（１２８倍）仍可检出。经柑桔叶面腐生黄单胞及近缘细菌交叉吸收，提高了多克隆抗血清特异性，能有效地避免假阳性。３种ＨＲＰ－标结结合物的效果为ＨＲＰ－ＳｐＡ＞ＨＲＰ－ＩｇＧ（鼠抗兔）＞ＨＲＰ－ＩｇＧ（羊抗兔）。封闭液采用ＴＢＳ＋０．１％曲拉通或０．５％吐温２０，吐温８０均可获得白色滤膜背景。对全国８省３８县５１８个柑桔无症样品ＤＩＡ检验结果，平均带菌率３１．８２％，符合实际病情。     

湖北柑橘溃疡病菌的PCR鉴定及序列分析

选用引物JYF5/JYR5对湖北疑似柑橘溃疡病标本进行了PCR鉴定和确证,同时改进了DNA抽提方法,优化了PCR条件,并与南京柑橘溃疡病菌株进行分子克隆比较.结果表明,南京菌株NJ-XC分离物扩增片段与Silva等报道的相应序列相似性为99%(411/413);湖北标本菌株HB-X0扩增片段与报道的相应序列相似性为100%(413/413),二者存在一定的差异.此外发现引物JYF5/JYR5能扩增叶表的根癌土壤杆菌,其片段大小为575bp.